5種常見(jiàn)致病菌菌液OD值與其活菌數(shù)相關(guān)性研究

林靜，何佳茜，尚翠玲，孟佳麗，李昕，金天明

比濁法又稱(chēng)濁度測(cè)定法，是一種光散射測(cè)量技術(shù)，通過(guò)測(cè)量透過(guò)懸浮質(zhì)點(diǎn)介質(zhì)的光強(qiáng)度來(lái)確定懸浮物質(zhì)濃度的方法。在實(shí)際應(yīng)用中，比濁法的用途非常廣泛，有研究者利用細(xì)菌的不同特點(diǎn)，對(duì)采用紫外-可見(jiàn)分光光度測(cè)定細(xì)菌濃度的方法進(jìn)行探討，在一定濃度內(nèi)吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系[1-7]。在本次試驗(yàn)中，比濁法主要用作測(cè)量5種常見(jiàn)致病菌菌液中的細(xì)菌數(shù)量（包括活菌、死菌），并結(jié)合平板計(jì)數(shù)法，進(jìn)一步彌補(bǔ)比濁法計(jì)數(shù)的缺點(diǎn)，得到快速細(xì)菌計(jì)數(shù)的方法[8]。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所需菌種：大腸桿菌、巴氏桿菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、牛鏈球菌，均為本實(shí)驗(yàn)室保存，所需培養(yǎng)基見(jiàn)表1。

表1 菌種與其對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基

1.2 方法

1.2.1 菌液OD值的測(cè)定

（1）一級(jí)種子液的制備。將復(fù)蘇后的菌種用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，搖床37℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜，為一級(jí)種子液。

（2）二級(jí)種子液的制備。吸取250 μL一級(jí)種子液加入到6 mL液體培養(yǎng)基中，吹打混勻，為二級(jí)種子液。

（3）生長(zhǎng)曲線分析儀的設(shè)置。將Bioscreener全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀測(cè)定程序設(shè)置為培養(yǎng)溫度37℃，時(shí)長(zhǎng)18 h，平均30 min/次，波長(zhǎng)600 nm。

（4）OD值的測(cè)定。用移液槍分別吸取200 μL二級(jí)種子液依次放入儀器測(cè)試專(zhuān)用孔板中，并對(duì)測(cè)試所用孔進(jìn)行標(biāo)記。分別取1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18 h時(shí)的細(xì)菌菌液，測(cè)定其OD600值。

1.2.2 菌落平板計(jì)數(shù)

采用平板菌落計(jì)數(shù)法。將菌液進(jìn)行 10、102、103、……、10n倍比稀釋?zhuān)肯♂尪戎貜?fù)3次，吸取1 mL稀釋后的菌液注入對(duì)應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，并用無(wú)菌涂棒涂布均勻后放入37℃恒溫箱過(guò)夜培養(yǎng)。當(dāng)固體培養(yǎng)基上的菌落數(shù)為30～300 CFU/mL時(shí)，即為合適的稀釋倍數(shù)，并取3次測(cè)量的平均值。計(jì)數(shù)平板上的平均菌落數(shù)乘以其稀釋倍數(shù)，即為1 mL菌液中的活菌數(shù)（CFU/mL）。

1.2.3 數(shù)量關(guān)系分析

對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析顯示，在細(xì)菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，菌液中活菌數(shù)與其OD600值之間存在著一定的數(shù)量關(guān)系，并得到相應(yīng)數(shù)量關(guān)系方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌的計(jì)數(shù)結(jié)果及分析

2.1.1 大腸桿菌的計(jì)數(shù)結(jié)果

大腸桿菌在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD600值、平板計(jì)數(shù)的平均菌落數(shù)（n）、稀釋倍數(shù)、1 mL菌液活菌數(shù)（N），如表2所示。

2.1.2 大腸桿菌線性回歸方程

測(cè)定大腸桿菌菌液在1.5～10 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD600值，以其為x軸，以活菌數(shù)為y軸，得到一條活菌數(shù)關(guān)于OD600值的數(shù)學(xué)曲線（圖1），并得出相關(guān)的回歸方程。

表2 大腸桿菌數(shù)值匯總

圖1 大腸桿菌OD600值與活菌濃度數(shù)量關(guān)系圖

2.2 巴氏桿菌的計(jì)數(shù)結(jié)果及分析

2.2.1 巴氏桿菌的計(jì)數(shù)結(jié)果

巴氏桿菌各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD600值、平板計(jì)數(shù)的平均菌落數(shù)（n）、稀釋倍數(shù)、1 mL菌液活菌數(shù)（N），如表3所示。

表3 巴氏桿菌數(shù)值匯總

2.2.2 巴氏桿菌線性回歸方程

以巴氏桿菌在1.5～10 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD600值為x軸，以活菌數(shù)為y軸，得到一條活菌數(shù)關(guān)于OD600值的數(shù)學(xué)曲線（圖2），并得出相關(guān)的回歸方程。

圖2 巴氏桿菌OD600值與活菌濃度數(shù)量關(guān)系圖

2.3 金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)結(jié)果及分析

2.3.1 金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)結(jié)果

金黃色葡萄球菌各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD600值、平板計(jì)數(shù)的平均菌落數(shù)（n）、稀釋倍數(shù)、1 mL菌液活菌數(shù)（N），如表4所示。

表4 金黃色葡萄球菌數(shù)值匯總

2.3.2 金黃色葡萄球菌線性回歸方程

以金黃色葡萄球菌在1.5～10 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD600值為x軸，以活菌數(shù)為y軸，得到一條活菌數(shù)關(guān)于OD600值的數(shù)學(xué)曲線（圖3），并得出相關(guān)的回歸方程。

圖3 金黃色葡萄球菌OD600值與活菌濃度數(shù)量關(guān)系圖

2.4 表皮葡萄球菌的計(jì)數(shù)結(jié)果及分析

2.4.1 表皮葡萄球菌的計(jì)數(shù)結(jié)果

表皮葡萄球菌各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD600值、平板計(jì)數(shù)的平均菌落數(shù)（n）、稀釋倍數(shù)、1 mL菌液內(nèi)活菌數(shù)（N），如表5所示。

表5 表皮葡萄球菌數(shù)值匯總

2.4.2 表皮葡萄球菌線性回歸方程

以表皮葡萄球菌在1.5～10 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD600值為x軸，以活菌數(shù)為y軸，得到一條活菌數(shù)關(guān)于OD600值的數(shù)學(xué)曲線（圖4），并得出相關(guān)的回歸方程。

圖4 表皮葡萄球菌OD600值與活菌濃度數(shù)量關(guān)系圖

2.5 牛鏈球菌的計(jì)數(shù)結(jié)果及分析

2.5.1 牛鏈球菌的計(jì)數(shù)結(jié)果

牛鏈球菌各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD600值、平板計(jì)數(shù)的平均菌落數(shù)（n）、稀釋倍數(shù)、1 mL體積內(nèi)活菌數(shù)（N），如表6所示。由于10 h時(shí)間點(diǎn)的OD600值誤差過(guò)大，不利于生長(zhǎng)曲線的擬合，將其舍棄。

2.5.2 牛鏈球菌線性回歸方程

取牛鏈球菌在1.5～12 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD600值，并以其為x軸，以活菌數(shù)為y軸，建立一條活菌數(shù)關(guān)于OD600值的數(shù)學(xué)曲線（圖5），并得出相關(guān)的回歸方程。

表6 牛鏈球菌數(shù)值匯總

圖5 牛鏈球菌OD600值與活菌濃度數(shù)量關(guān)系圖

3 討論與結(jié)論

在實(shí)際生產(chǎn)中，細(xì)菌計(jì)數(shù)是細(xì)菌研究中一項(xiàng)基礎(chǔ)且重要的工作。此次試驗(yàn)的目的就是得到一種快速、便捷的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法。細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中，平臺(tái)期后雖然細(xì)菌總數(shù)在逐漸增多，但死菌數(shù)量會(huì)越來(lái)越多，而活菌數(shù)卻越來(lái)越少。在細(xì)菌相關(guān)試驗(yàn)中，由于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)良好，符合比爾定律的要求，測(cè)量值一般處于0.2～1.2之間，菌液中內(nèi)毒素、外毒素含量較少等原因而被經(jīng)常使用[9]。吳海燕等[10]對(duì)不同轉(zhuǎn)速下大腸桿菌OD600值與時(shí)間的關(guān)系進(jìn)行探討，為快速而準(zhǔn)確的制備高感受態(tài)細(xì)胞提供OD600值的量化標(biāo)準(zhǔn)，其研究中所使用的待測(cè)菌液就取自于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。羅如松等[11]采用類(lèi)似的方法，闡明了豬胸膜肺炎放線桿菌生長(zhǎng)特性、細(xì)菌懸液濁度與細(xì)菌計(jì)數(shù)的關(guān)系，其試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，細(xì)菌處于穩(wěn)定生長(zhǎng)后期和衰亡期，可能因?yàn)榧?xì)菌的代謝活性降低、有毒產(chǎn)物的積累、細(xì)胞出現(xiàn)自溶現(xiàn)象等原因，導(dǎo)致菌液中存在有大量死亡的細(xì)菌和細(xì)胞碎片進(jìn)而影響測(cè)量。因此，在進(jìn)行生長(zhǎng)曲線擬合度測(cè)定時(shí)，對(duì)細(xì)菌對(duì)數(shù)期的OD600值與對(duì)數(shù)期的活菌數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，才可以得到擬合度高、有較強(qiáng)實(shí)際意義的數(shù)量方程[12]。

本試驗(yàn)通過(guò)菌液OD600值與菌液活菌數(shù)量的比對(duì)，可得出數(shù)量關(guān)系方程。分別為：大腸桿菌：y＝8 708.7e36.43x（R2＝0.828）；巴氏桿菌：y＝34.82e35.57x（R2＝0.866）；金黃色葡萄球菌：y＝49 331e28.16x（R2＝0.743）；表皮葡萄球菌：y＝4×108e24.73x（R2＝0.928）；牛鏈球菌：y＝8×109e68.21x（R2＝0.971）。將比濁法與數(shù)學(xué)模型相結(jié)合，代入OD600值即可快速得出相應(yīng)的細(xì)菌活菌數(shù)量，R2值越接近于1，計(jì)算獲得的活菌數(shù)量越為準(zhǔn)確。分析5種細(xì)菌的菌液OD600值與菌液中活菌數(shù)量的關(guān)系方程可知，表皮葡萄球菌、牛鏈球菌的數(shù)量關(guān)系方程在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有著較強(qiáng)的意義，生產(chǎn)實(shí)踐中可以有效地簡(jiǎn)化試驗(yàn)步驟，節(jié)約生產(chǎn)成本。

[1]楊正時(shí).生物制品中常用細(xì)菌計(jì)數(shù)法[J].微生物學(xué)通報(bào)，1979，6（2）：41-43.

[2]李冬陽(yáng)，茹柿平，吳堅(jiān)，等.分光光度法快速檢測(cè)細(xì)菌[J].分析化學(xué)，2010，38（4）：573-576.

[3]李恪梅，魏東，王秉翔，等.人用布氏菌疫苗濃度測(cè)定分光光度法的建立[J].中國(guó)藥事，2011，25（3）：233-235.

[4]陳士運(yùn)，沈旭，苗立中，等.應(yīng)用紫外分光光度法進(jìn)行禽多殺性巴氏桿菌（C48-1）細(xì)菌計(jì)數(shù)的研究[J].山東畜牧獸醫(yī)，2009，30（5）：12-13.

[5]肖敏，楊峰，王旭榮，等.分光光度法測(cè)定金黃色葡萄球菌菌液濃度方法的建立[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（11）：40-43.

[6]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

[7]董自艷，戴翚，馬仕洪，等.紫外—可見(jiàn)分光光度法快速確定細(xì)菌菌液的濃度[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2014，15（2）：120-121.

[8]楊廣.液體培養(yǎng)條件下細(xì)菌濃度兩種測(cè)定方法比較[J].微生物學(xué)雜志，2005，25（4）：71-72.

[9]沈萍.微生物學(xué)[M].北京：高等教育出版社， 2000.

[10]吳海燕，謝應(yīng)桂，何雄斌，等.快速準(zhǔn)確制備大腸桿菌高效感受態(tài)細(xì)胞中有關(guān)OD600值的探討[J].湘南學(xué)院學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2006，8（3）：13-15.

[11]羅如松，郭愛(ài)珍，林荔雯，等.豬胸膜肺炎放線桿菌濁度與細(xì)菌計(jì)數(shù)的關(guān)系[J].畜牧與獸醫(yī),2005，37（10）：10-12.

[12]明道緒.生物統(tǒng)計(jì)附試驗(yàn)設(shè)計(jì)[M].3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002.