蛹蟲草菌侵染柞蠶蛹條件的研究

張博 ，孫寧 ，孫永健 ，通信作者，張穎 ，路雨 ，何媛媛

蛹蟲草（Cordyceps militaris（L.）Link）又名北冬蟲夏草，是蛹蟲草真菌寄生在鱗翅目昆蟲蛹上形成的子座與蛹的復(fù)合體[1-3]。蛹蟲草富含蟲草素、蟲草多糖等多種生物活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗衰老等功效，既可以作為治療疾病的藥物，還可以制成功能性食品和飲料，前景非常廣闊[4-6]。在自然環(huán)境中，蛹蟲草菌成功侵染蟲蛹并萌發(fā)子實(shí)體，需要在特定氣候及生態(tài)條件下完成，因此野生蛹蟲草資源較為珍惜，不能滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求[7-10]。研究人員已從菌種選育、寄主選擇、栽培條件、產(chǎn)品開發(fā)等多個(gè)角度對(duì)人工蛹蟲草進(jìn)行了相關(guān)研究，取得了較多成果[11-16]。本研究利用營(yíng)養(yǎng)成分豐富、養(yǎng)殖技術(shù)成熟、一年可生發(fā)兩代的柞蠶蛹（Antheraea pernyiPupa）為寄主，探討人工培育蛹蟲草過程中，菌種侵染柞蠶蛹的關(guān)鍵因素，以優(yōu)化侵染方法。成果的應(yīng)用可為快速、優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)人工蛹蟲草提供保障，保護(hù)野生蛹蟲草資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

蛹蟲草菌種為天津市工業(yè)微生物研究所提供。

1.1.2 試材

蔗糖、MgSO4、KH2PO4、VB1等化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；新鮮滯育柞蠶蛹為市場(chǎng)采購(gòu)。

GZX-150BS型光照培養(yǎng)箱、KYC-100B型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海圣科儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；MJ-78A型高壓蒸汽滅菌鍋，上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)；RZ-2D2G型雙人桌面（水平）凈化工作臺(tái)，廣州瑞智凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)；FS-150N型超聲波處理器，上海生析超聲儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 液體培養(yǎng)基的制備

稱取馬鈴薯300 g，去皮后切成小塊，加500 mL蒸餾水煮沸30 min，用4層紗布過濾取濾液。向?yàn)V液中加入 MgSO41.5 g、KH2PO43 g、VB110 mg、葡萄糖20 g，用蒸餾水定容至1 000 mL后分裝于200 mL錐形瓶中（每瓶120 mL），每瓶加入20粒0.6 cm的玻璃珠，于121℃下滅菌20 min。

1.2.2 菌液的制作

按以下方法制作菌種，用滅好菌的接種針蘸取菌種，對(duì)清洗好的柞蠶蛹進(jìn)行穿刺接種。

菌懸液法（A1處理）：用接種環(huán)將斜面菌種的菌絲刮下，置入裝有50 mL無菌水的錐形瓶中，在無菌的環(huán)境下，用超聲波處理器將菌絲震碎，制成菌懸液待用。

發(fā)酵菌液法（A2處理）：挑取黃豆粒大小的蛹蟲草菌斜面菌種，接種于液體培養(yǎng)基。放置于搖床上進(jìn)行避光振蕩培養(yǎng)，設(shè)定溫度為22℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min，3 d后選出菌液澄清、菌球長(zhǎng)勢(shì)一致且無畸形的栽培種繼續(xù)培養(yǎng)2 d，在無菌條件下，用4層紗布過濾，取菌液待用。

改良發(fā)酵菌液法（A3處理）：按照方法二，將菌種培養(yǎng)于添加有柞蠶蛹浸出汁的液體培養(yǎng)基中（柞蠶蛹浸出汁∶液體培養(yǎng)基＝7∶3），經(jīng)培養(yǎng)、過濾后，取菌液待用。

1.2.3 接種方式

將1.2.2中A3處理制作的菌種，按以下方法接種，考察接種方式對(duì)侵染的影響。

穿刺法（B1處理）：用無菌接種針蘸取菌液，扎刺柞蠶蠶蛹尾部上數(shù)第二節(jié)腹環(huán)處，刺破蛹?xì)ぜ纯伞?/p>

注射法（B2處理）：用注射器吸取菌液，將針頭平行地緩慢插入蠶蛹尾部上數(shù)第二節(jié)腹環(huán)處，注射菌液0.2 mL。

噴淋法（B3處理）：用菌液噴淋整個(gè)柞蠶蛹表面，將沾有菌液的蛹胸腹面向下，置于17℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，重復(fù)此操作3次，后進(jìn)行正常發(fā)菌培養(yǎng)。

1.2.4 柞蠶蛹的處理

用流動(dòng)的水將柞蠶蛹清洗干凈，晾干表面的水，按表1的方式對(duì)柞蠶蛹進(jìn)行處理，采用1.2.3中的注射法將1.2.2中A3處理制作的菌種接種于蛹體，接種量為0.2 mL，考察柞蠶蛹的消毒方式對(duì)侵染的影響。

表1 柞蠶蛹的處理方式

1.2.5 栽培管理

接種好的柞蠶蛹，于17℃下培養(yǎng)至蛹體初步僵化，后將溫度調(diào)整為24℃，培養(yǎng)至蛹體完全僵化。然后進(jìn)行晝夜溫差培養(yǎng)，日間給予600 lx的光照12 h，溫度為22℃，夜間避光12 h，溫度為16℃，空氣濕度保持在60%～70%，培養(yǎng)10 d后原基開始形成。隨后晝夜給予600 lx的光照，溫度固定在22℃，空氣濕度保持在80%～90%。當(dāng)子實(shí)體尖端稍有膨大時(shí)，進(jìn)行采收。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌液對(duì)侵染及蛹蟲草培育的影響

由表2可知，不同的栽培用菌種制作方式，對(duì)蛹蟲草菌是否能成功侵染柞蠶蛹具有較大的差別。經(jīng)過液體發(fā)酵活化后制成的栽培種（A2、A3處理），蛹蟲草菌的侵染能力明顯提高。其中，改良發(fā)酵菌液法（A3處理）較優(yōu)，使得柞蠶蛹僵化率達(dá)到78.7%，而菌懸液法（A1處理）效果較差，僵化率最低，僅為61.3%。且A2、A3處理的子實(shí)體萌發(fā)率及蛹蟲草的平均干重均高于A1處理，說明菌種經(jīng)發(fā)酵活化后，對(duì)子實(shí)體的萌發(fā)及生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用。由于改良發(fā)酵菌液法（A3處理）在液體培養(yǎng)基中添加了70%的柞蠶蛹浸出汁，可以使蛹蟲草菌在發(fā)酵過程中先適應(yīng)柞蠶蛹的營(yíng)養(yǎng)成分，當(dāng)接種之后，蛹蟲草菌可以較快地進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，從而縮短柞蠶蛹完全僵化所需的時(shí)間（22 d），因此確定改良發(fā)酵菌液法為較優(yōu)的栽培種制作方法。

表2 菌液的制作方式對(duì)侵染及蛹蟲草培育的影響

2.2 接種方式對(duì)侵染及蛹蟲草培育的影響

由表3可知，采用噴淋法（B3處理）進(jìn)行接種，柞蠶蛹僵化效果最好，僵化率可達(dá)91.3%，但蛹體完全僵化所需時(shí)間最長(zhǎng)，為34 d，明顯高于采用穿刺法（B1處理）與注射法（B2處理）進(jìn)行接種的柞蠶蛹。經(jīng)注射法接種后的柞蠶蛹，雖然僵化率低于噴淋法2%，但子實(shí)體萌發(fā)率及蛹蟲草平均干重均高于其他兩種方法，分別為91.8%與3.47 g，且蛹體完全僵化所需時(shí)間最短，僅為19 d。噴淋法在接種時(shí)不會(huì)給蛹體造成開放性損傷，從而避免了蛹體被其他雜菌感染而變質(zhì)，但柞蠶蛹的外殼，阻礙了蛹蟲草菌對(duì)其侵染，菌絲只能由外向內(nèi)緩慢生長(zhǎng)（圖1）。而注射接種法促進(jìn)了菌絲對(duì)蛹體的侵染，且接種量可控，培養(yǎng)時(shí)間短，對(duì)子實(shí)體的萌發(fā)及生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，因此確定為較優(yōu)的接種方式。

表3 接種方式對(duì)侵染及蛹蟲草培育的影響

圖1 利用3種不同方法接種，完全僵化后的柞蠶蛹

2.3 柞蠶蛹前處理方法對(duì)侵染及培育的影響

由表4可知，在4種柞蠶蛹的前處理方法中，升汞處理（C2處理）后接種的150個(gè)柞蠶蛹中，僅有1個(gè)被雜菌感染，僵化率最高為99.3%。不經(jīng)前處理（C4處理）的柞蠶蛹，僵化率最低，僅為88.7%，可見，經(jīng)過消毒或滅菌處理后，蛹蟲草菌對(duì)柞蠶蛹的侵染效果明顯改善。但從蛹體僵化所需的時(shí)間、子實(shí)體萌發(fā)效果、蛹蟲草平均干重來看，利用高溫（C1處理）進(jìn)行前處理的效果最佳，接種后，雖然僵化率略低于C2處理，但蛹體完全僵化所需時(shí)間最短，僅為6 d，僵化后，幾

乎所有柞蠶蛹均萌發(fā)產(chǎn)生子實(shí)體，發(fā)草率高達(dá)99.3%，子實(shí)體長(zhǎng)勢(shì)健壯、顏色金黃，蛹體呈棕色（圖2），蛹蟲草平均干重在4種處理中最高，為3.54 g。這可能是由于利用升汞進(jìn)行前處理，雖然可以起到較好的殺滅雜菌的效果，但由于重金屬汞毒性較大及難以清除干凈，會(huì)影響子實(shí)體的萌發(fā)及生長(zhǎng)，造成子實(shí)體原基難以形成、生長(zhǎng)緩慢、細(xì)弱矮?。ㄒ妶D2）。新潔爾滅消毒法（C3處理）雖然在一定程度上可以防止雜菌的感染，但同樣會(huì)對(duì)子實(shí)體產(chǎn)生影響。因此確定高溫高壓滅菌法為較優(yōu)的前處理方式。

表4 消毒、滅菌方式對(duì)蛹蟲草培育的影響

圖2 采用4種不同前處理方法培育獲得的柞蠶蛹蟲草

3 討論

研究結(jié)果表明，對(duì)菌種進(jìn)行活化后，采用注射接種的方法使其更直接、快速地進(jìn)入寄主體內(nèi)，會(huì)在一定程度上提高侵染效率；且不同的柞蠶蛹前處理方式，可在侵染效果上形成較大差別，柞蠶蛹經(jīng)過高溫滅菌后，減輕甚至完全消除了雜菌的影響，增強(qiáng)了蛹蟲草菌對(duì)柞蠶蛹的感染能力，有效避免了壞蛹的出現(xiàn)，使蛹體完全僵化所需時(shí)間縮短至6 d，僵化率達(dá)到98%。通過對(duì)相關(guān)條件的探討，既提高了蛹蟲草菌的侵染能力，又縮短了培育周期，改善了產(chǎn)品品質(zhì)，后續(xù)還可通過加強(qiáng)對(duì)蛹蟲草菌種的選育來完善相關(guān)技術(shù)。

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