一種新型開環(huán)烯二炔的設(shè)計(jì)、合成及細(xì)胞毒性研究

黃 帥, 李 競(jìng), 李保君, 胡愛國(guó)

(華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,上海市先進(jìn)聚合物材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)

一種新型開環(huán)烯二炔的設(shè)計(jì)、合成及細(xì)胞毒性研究

黃 帥, 李 競(jìng), 李保君, 胡愛國(guó)

(華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,上海市先進(jìn)聚合物材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)

通過Sonogashira反應(yīng)合成了一種以馬來酰亞胺為主體結(jié)構(gòu),炔基帶有兩個(gè)對(duì)稱烷基鏈的烯二炔化合物。該烯二炔在適度加熱的情況下能夠發(fā)生Bergman環(huán)化反應(yīng),產(chǎn)生芳基雙自由基。通過紅外光譜分析確認(rèn)反應(yīng)后碳碳叁鍵信號(hào)峰消失;利用自由基捕捉技術(shù)獲得了單N-叔丁基-α-苯基硝酮(PBN)加成產(chǎn)物和雙PBN加成產(chǎn)物,并通過電子順磁共振波譜檢測(cè)到了這兩種PBN加合物的自由基信號(hào),說明烯二炔發(fā)生了Bergman環(huán)化反應(yīng)。MTT法細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)該小分子烯二炔對(duì)腫瘤細(xì)胞的半抑制濃度在18 μmol/L左右,顯示出烯二炔對(duì)腫瘤細(xì)胞具有良好的抗增殖能力。這為以后設(shè)計(jì)合成高活性的開環(huán)型烯二炔抗生素提供了新的思路。

烯二炔; Bergman環(huán)化; 抗腫瘤抗生素; 細(xì)胞毒性

多年來,世界各國(guó)都在關(guān)注如何根治癌癥。癌癥是引起發(fā)達(dá)國(guó)家人口死亡的主要原因,在發(fā)展中國(guó)家癌癥的發(fā)病率也在不斷增加[1]。治療癌癥的方式多種多樣,其中化學(xué)治療是十分重要的手段之一?；瘜W(xué)治療癌癥的常用藥物是抗生素。藥用抗生素絕大部分含有天然的活性成分,可以影響癌細(xì)胞的生長(zhǎng)行為。1965年,Ishida等[2]從鏈霉菌(Streptomycescarzinostaticus)的發(fā)酵液中分離出新制癌菌素(Neocarzinostatin,NCS)。隨后人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了Neocarcinostatin Chromophore[3]、Esperamicins[4]、Calicheamicins[5]、Dynemicins[6]、Kedarcidin Chromophore[7]、Lidamycin[8]等20多種天然烯二炔類抗腫瘤抗生素。這些天然抗生素都有一個(gè)相似的主體化學(xué)結(jié)構(gòu)——烯二炔,該基團(tuán)可以被靶向傳輸?shù)紻NA的小溝內(nèi),引發(fā)Bergman或者M(jìn)yers-Saito環(huán)芳香化反應(yīng),產(chǎn)生高度活性的苯基雙自由基。這些自由基可以進(jìn)一步奪取磷酸骨架上的氫原子,導(dǎo)致DNA的單鏈或者雙鏈裂解,引起細(xì)胞的凋亡。天然烯二炔抗生素的抗腫瘤活性甚至比臨床上最為有效的阿霉素高出5～8 000倍[9]。例如：體外試驗(yàn)表明C-1027對(duì)于KB腫瘤細(xì)胞有著極其突出的細(xì)胞毒性,其半抑制濃度(IC50)甚至低于0.1 ng/mL[10]。體內(nèi)試驗(yàn)表明該抗生素對(duì)于荷瘤小鼠也展示出了高效的抗腫瘤活性[11]。雖然天然烯二炔抗生素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的毒性,但是其缺乏細(xì)胞選擇性的弊端使得它們?cè)跉⑺滥[瘤細(xì)胞的同時(shí)也對(duì)正常細(xì)胞顯示出細(xì)胞毒性[9,12-13],并且伴隨有一定的副作用,如白細(xì)胞減少[14]、心肌病等[15]。

天然烯二炔抗生素的獨(dú)特抗腫瘤機(jī)制和它們顯而易見的弊端為有機(jī)合成化學(xué)家們嘗試人工合成烯二炔提供了機(jī)遇和挑戰(zhàn)。過去幾十年來,人們合成出了各種類型的烯二炔抗生素,希望在合適的引發(fā)條件下能夠提高Bergman環(huán)化反應(yīng)的活性,并且能夠降低烯二炔對(duì)于正常細(xì)胞的毒性。其中研究較為廣泛的是pH引發(fā)機(jī)制和光照引發(fā)機(jī)制[16]。

Basak等[17]報(bào)道了可以根據(jù)腫瘤細(xì)胞中的酸性環(huán)境設(shè)計(jì)出pH響應(yīng)的烯二炔,合成的幾種烯二炔在堿性環(huán)境下對(duì)所測(cè)細(xì)胞沒有表現(xiàn)出明顯的毒性優(yōu)勢(shì)。當(dāng)引發(fā)條件置換為弱堿環(huán)境,目標(biāo)烯二炔開始發(fā)生Bergman環(huán)化反應(yīng),產(chǎn)生細(xì)胞毒性,并且對(duì)腫瘤細(xì)胞的半抑制濃度達(dá)到了臨床上的要求。但是,這些烯二炔在保持高毒性時(shí),不能區(qū)分正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。Jones等[18]設(shè)計(jì)合成了一種可以定向攻擊腫瘤細(xì)胞特征區(qū)域的烯二炔,這些區(qū)域包括像核酸靶體突起的地方,在與這些核酸突起相互作用的過程中,烯二炔分子發(fā)生了構(gòu)型轉(zhuǎn)變,使得烯二炔的炔基末端處在一個(gè)臨界的碳原子之間的距離(簡(jiǎn)稱cd距離),進(jìn)而引發(fā)Bergman環(huán)化反應(yīng)。Sharma等[19]設(shè)計(jì)合成了多種十三元的環(huán)狀烯二炔抗生素,展現(xiàn)出了對(duì)既選細(xì)胞良好的抗增殖能力。在靶向區(qū)域,作者使用了外部光源來觸發(fā)烯二炔的反應(yīng)活性。該種設(shè)計(jì)方案成功的前提條件是在特定波長(zhǎng)的光源作用烯二炔之前,烯二炔小分子能夠穩(wěn)定存在。同時(shí),外部的光源照射不能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生額外的毒性。這種方法證明了光照引發(fā)可以選擇性地作用特定部位，但是受限于光源的穿透組織的能力,光源到達(dá)不了所有的腫瘤部位。Polukhtine等[20]通過調(diào)整取代基的電子性能合成出了一種新型的烯二炔,提高了環(huán)化產(chǎn)物的產(chǎn)率。他們通過不同模式的激發(fā)能量轉(zhuǎn)移,旨在減輕烯二炔毒性,并且在時(shí)間和空間上控制反應(yīng)活性。在測(cè)試腫瘤細(xì)胞毒性時(shí),羰基結(jié)構(gòu)的烯二炔沒有破壞DNA,光照以后生成的羥基結(jié)構(gòu)的烯二炔對(duì)DNA產(chǎn)生了穩(wěn)健的單鏈和雙鏈裂解能力。

近期,我們研究組[21]設(shè)計(jì)并合成出了一種含有馬來酰亞胺以及三乙氧基官能團(tuán)的開環(huán)烯二炔。這種烯二炔的三乙氧基官能團(tuán)可以在腫瘤細(xì)胞中的酸性部分水解,形成雙羰基結(jié)構(gòu)。羰基強(qiáng)烈的吸電子作用使其能夠在常溫下引發(fā)Bergman環(huán)化反應(yīng)。之后,又將馬來酰亞胺部分的封端苯基替換成活性較高的呋喃環(huán)[22]。令人驚喜的是,這種烯二炔不僅保留了Bergman反應(yīng)的活性,而且表現(xiàn)出了較好的細(xì)胞選擇性。在前期研究工作的基礎(chǔ)上,本文選擇以馬來酰亞胺為主體結(jié)構(gòu),通過尋找合適的炔基取代基,統(tǒng)籌考慮cd距離、空間位阻、電子效應(yīng)等因素,合成了具有如下特點(diǎn)的開環(huán)烯二炔：開環(huán)烯二炔化合物能夠在相對(duì)較低的溫度范圍內(nèi)發(fā)生Bergman環(huán)化反應(yīng),引入馬來酰亞胺基團(tuán)可明顯地降低分子發(fā)生Bergman環(huán)化反應(yīng)的能壘[23]；合成的烯二炔具有對(duì)稱的長(zhǎng)鏈烷基,可以降低烯二炔分子的極性表面積,有助于分子滲透入親脂性的細(xì)胞膜。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 主要原料 1-己炔,純度98%,安耐吉化學(xué)有限公司;2,3-二氯馬來酸酐,純度99.9%,安耐吉化學(xué)有限公司;N,N-二異丙基乙胺,純度98%,安耐吉化學(xué)有限公司;碘化亞銅,純度99%,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;芐胺,純度99%,阿拉丁化學(xué)試劑有限公司;N-叔丁基-α-苯基硝酮(PBN),純度99.9%,阿拉丁化學(xué)試劑有限公司;乙腈、乙酸,分析純,上海凌風(fēng)化學(xué)試劑有限公司;硅膠(50～75 μm)、無(wú)水硫酸鎂,分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氘代試劑,分析純,百靈威科技有限公司;石油醚、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷,分析純,蘇州晶協(xié)化學(xué)有限公司;甲苯、四氫呋喃(THF)在使用前經(jīng)干燥處理,常壓蒸餾后方可使用。

1.1.2 主要儀器 核磁共振氫譜和碳譜(1H-NMR,13C-NMR):采用美國(guó)Bruker公司的核磁共振儀(BRUKER BIOSPIN AG,Magnet System 400 MHz/500 MHz),測(cè)試所用溶劑為氘代氯仿(CDCl3)。

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用:采用英國(guó)Micromass LCTTM型液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀,配以Waters 600液相色譜儀進(jìn)樣系統(tǒng),離子化方式為電噴霧電離(ESI)。

基質(zhì)輔助激光解析-飛行時(shí)間質(zhì)譜:采用美國(guó)AB Sciex公司生產(chǎn)的基質(zhì)輔助激光解析-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(4 800 plus)。

差示掃描量熱分析(DSC):采用德國(guó)微分掃描量熱分析儀Pyris鉆石熱分析工作站進(jìn)行檢測(cè),裝配有822e DSC模塊模型,氮?dú)鈿夥障聶z測(cè)溫度為室溫至250 ℃,升溫速率10 ℃/min。

傅里葉變換紅外光譜(FT-IR):采用美國(guó)Thermo Nicolet公司生產(chǎn)的Nicolet 5700型傅里葉變換紅外光譜儀,通過KBr壓片法以及涂膜法制樣,測(cè)定透射光譜。

紫外可見光譜(UV-Vis):采用Shimadzu UV-2550紫外-可見分光計(jì)。

電子順磁共振波譜(EPR):將待測(cè)物溶解在三氯甲烷(10 mmol/L)中進(jìn)行測(cè)試。使用EMX-8 /2.7C的EPR光譜儀(Bruker公司,德國(guó)),選擇在X波段測(cè)量。光譜儀設(shè)置為:掃描寬度0.01 T,時(shí)間常數(shù)163.84 ms,轉(zhuǎn)換時(shí)間40.96 ms,分辨率1 024點(diǎn),調(diào)制頻率100.00 kHz,調(diào)制振幅10-4T,微波頻率9.877 GHz,微波功率6.358 mW。

1.2 烯二炔抗生素的合成

烯二炔抗生素的合成步驟如圖1所示。

圖1 烯二炔抗生素的合成路線和Bergman環(huán)化反應(yīng)

化合物1[24]:稱取2,3-二氯馬來酸酐(6.01 g,36 mmol)和40 mL乙酸,加入到100 mL圓底燒瓶中,室溫?cái)嚢柚镣耆芙?。將芐胺(4 mL,36.6 mmol)緩慢滴加到圓底燒瓶中,立刻有大量白霧產(chǎn)生,室溫?cái)嚢柚涟嘴F消失。慢慢添加芐胺,待全部滴加完畢后,將整個(gè)反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至120 ℃油浴攪拌器中回流反應(yīng)22 h。反應(yīng)結(jié)束后,逐漸降低油浴鍋溫度使得體系冷卻至室溫,真空揮發(fā)除去乙酸,用乙酸乙酯作為良溶劑溶解整個(gè)粗產(chǎn)物,分液萃取后得到的固體經(jīng)柱層析硅膠色譜柱分離,以正己烷和乙酸乙酯(正己烷與乙酸乙酯的體積比15∶1)為淋洗劑洗脫,最終分離得到產(chǎn)物1(6.27 g,質(zhì)量產(chǎn)率68.1%)。1H-NMR(CDCl3,400 MHz,δ):7.36～7.28(m,5H),4.69(s,2H)。

化合物2[24]:稱取二氯馬來酰亞胺1(2.29 g,8.95 mmol)和40 mL乙腈至100 mL圓底燒瓶中,添加碘化鈉(5.05 g,35.8 mmol)后,將整個(gè)反應(yīng)體系置于90 ℃油浴攪拌器中,避光回流反應(yīng)5 h。待反應(yīng)結(jié)束后,逐漸降低油浴鍋溫度使得體系冷卻至室溫,快速將溶液傾入大量去離子水中,在玻璃壁上迅速有黃色絮狀沉淀析出?？焖贁嚢?4 h后,減壓過濾,至水分基本風(fēng)干后,得到的濾餅在真空烘箱中干燥5 h,得到橙黃色粉末固體產(chǎn)物2(2.69 g,質(zhì)量產(chǎn)率68.4%)。1H-NMR(CDCl3,400 MHz,δ):7.31～7.22(m,5H),4.70(s,2H)。

化合物 3[25]:稱取化合物2(632 mg,1.44 mmol),碘化亞銅(28 mg,0.144 mmol),二(三苯基磷)二氯化鈀(50 mg,0.072 mmol),N,N-二異丙基乙胺(DIPEA,622 μL,3.624 mmol)依次加入到50 mL的Schlenk瓶中,真空線下抽真空-置換氮?dú)鈹?shù)次,在氮?dú)夥諊录尤胗脷浠}處理過的THF(3 mL)和用鈉砂處理后的甲苯(10 mL),攪拌溶解,最后加入己-1-炔(441 μL,3.624 mmol)。氮?dú)獗Ｗo(hù)下在45 ℃攪拌反應(yīng),用薄層層析法(TLC)跟蹤至完全反應(yīng)。反應(yīng)停止后,將上層褐色液體直接通過柱層析硅膠柱色譜進(jìn)行分離,用石油醚和乙酸乙酯(體積比30∶1)為淋洗劑洗脫,得到淺黃色黏稠液體304 mg,質(zhì)量產(chǎn)率為61%。1H-NMR(CDCl3,400 MHz,δ):7.36～7.26(m,5H),4.67(s,2H),2.55(t,4H),1.61(m,4H),1.49(m,4H),0.94(t,6H);13C-NMR(CDCl3,125 MHz,δ):167.3,135.8,128.6,128.5,127.9,112.1,71.7,42.2,30.1,21.9,20.1,13.5;HRMS(ESI):m/zcalcd.for C13H26NO2[M+H]+:348.196 4,found:348.196 8。

PBN加合物(化合物4和5)[26]:稱取化合物3(156 mg,0.449 mmol)溶解在40 mL甲苯溶劑中,加入到50 mL封口瓶中,充分?jǐn)嚢枞芙庖院?立即將PBN(199 mg,1.123 mmol)加入到封口瓶中,真空線下抽真空-置換氮?dú)鈹?shù)次。氮?dú)鈿夥障掠驮?00 ℃攪拌反應(yīng)24 h。停止反應(yīng)后,真空揮發(fā)除去溶劑,用飽和氯化鈉溶液和乙酸乙酯萃取數(shù)次后,取有機(jī)層溶液,經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥、過濾、旋蒸除去溶劑。通過柱層析硅膠色譜柱進(jìn)行分離,用石油醚和乙酸乙酯(體積比25∶1)為淋洗劑洗脫,收集得到橙紅色黏稠液體56.8 mg,經(jīng)過EPR證實(shí)該產(chǎn)物是PBN的加合物(化合物4和5的混合物)。在高分辨質(zhì)譜中出現(xiàn)化合物5的峰,m/zcalcd.for C34H41N2O3[M]+:525.311 7;found:525.290 5。

1.3 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)

貼壁細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn):在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)開始之前,本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株都必須預(yù)先解凍、生長(zhǎng)、分裂,以獲得足夠數(shù)目的細(xì)胞用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞株經(jīng)充分生長(zhǎng)后接種到96孔板中,接種密度為3 000。再將細(xì)胞放置在培養(yǎng)箱里貼壁培養(yǎng),培養(yǎng)箱里以CO2氣體氛圍填充。與此同時(shí),配制濃度為100 mmol/L的烯二炔合化物3的丙酮溶液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾以后,逐步稀釋到100 μmol/L,再次稀釋到0.3、0.6、1.2、2.3、4.7、9.4、18.8、37.6 μmol/L,另外在作為參考樣的丙酮中加入培養(yǎng)液稀釋到丙酮體積分?jǐn)?shù)為0.1%。經(jīng)過1 d的細(xì)胞培養(yǎng),除去96孔板中的培養(yǎng)液介質(zhì),取代以200 μL各種濃度的烯二炔化合物3的丙酮溶液?？瞻捉M實(shí)驗(yàn)則加入200 μL體積分?jǐn)?shù)為0.1%的丙酮溶液,轉(zhuǎn)移孔板至CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)過程結(jié)束后,向每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔板中添加20 μL左右的 MTT試劑,另外單獨(dú)培養(yǎng)4 h。取出培養(yǎng)細(xì)胞的孔板,除去每個(gè)孔板中的培養(yǎng)液,待培養(yǎng)液全部除去后,適時(shí)向板孔中添加200 μL左右的二甲基亞砜溶液。以上操作完成以后,將整個(gè)孔板置于室溫環(huán)境下,平鋪在超凈臺(tái)面上,等待約10 min。再將孔板置于酶標(biāo)儀中,勻速搖蕩整個(gè)體系30 s,直至甲臜結(jié)晶物在溶劑中逐漸消失。調(diào)節(jié)儀器至波長(zhǎng)490 nm處,對(duì)準(zhǔn)每個(gè)孔板計(jì)算出它們的吸光度值大小。將細(xì)胞的吸光度值對(duì)比空白組的吸光度值并以百分比來表示,得到最終結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的合成

由Nicolaou提出的烯二炔化合物的間距理論認(rèn)為,烯二炔化合物能否自發(fā)發(fā)生Bergman環(huán)化反應(yīng)取決于兩個(gè)叁鍵末端(1,6位)的cd距離[27]。Schreiner等[28]指出影響熱致Bergman環(huán)化反應(yīng)的因素分別是cd距離、環(huán)張力能、電子效應(yīng)、位阻效應(yīng)等。開環(huán)烯二炔在結(jié)構(gòu)上比環(huán)狀烯二炔(天然烯二炔均為環(huán)狀烯二炔)簡(jiǎn)單很多,也比較容易合成,但是開環(huán)烯二炔炔臂間的cd距離大大超出了Nicolaou提出的臨界范圍,使得開環(huán)烯二炔發(fā)生熱致Bergman環(huán)化反應(yīng)的觸發(fā)溫度比環(huán)狀烯二炔高得多(一般在200 ℃以上)。因此,合成一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、作用高效的開環(huán)烯二炔抗生素面臨著不小的挑戰(zhàn)。

本文在烯二炔化合物3的烯烴部位引入馬來酰亞胺結(jié)構(gòu),增強(qiáng)了整個(gè)分子共軛區(qū)域的吸電子效應(yīng),大大降低了熱致Bergman環(huán)化反應(yīng)的引發(fā)溫度。圖1顯示了整個(gè)烯二炔分子的合成路線,通過優(yōu)化反應(yīng)條件,確定以二(三苯基磷)二氯化鈀為催化劑,N,N-二異丙基乙胺為堿的反應(yīng)體系獲得了較高的產(chǎn)率。在烯二炔3的核磁共振氫譜中,化學(xué)位移在7.20～7.35處的信號(hào)峰為苯環(huán)質(zhì)子特征峰,化學(xué)位移4.7處為與苯環(huán)相連的亞甲基的信號(hào),化學(xué)位移0.9～2.5左右處的4組峰是典型的烷基質(zhì)子信號(hào)峰。核磁共振碳譜中化學(xué)位移在70和110處左右的峰是典型的碳碳叁鍵信號(hào)峰。高分辨質(zhì)譜中出現(xiàn)了一組峰(質(zhì)荷比348.196 8),與理論上的C13H26NO2[M+H]+(質(zhì)荷比348.196 4)接近。以上測(cè)試都說明成功合成了烯二炔3。

用差示掃描量熱法(DSC)測(cè)試證實(shí)烯二炔3發(fā)生Bergman環(huán)化反應(yīng)的起始溫度約為70 ℃左右,相比于之前報(bào)道的絕大多數(shù)開環(huán)烯二炔要低許多。說明馬來酰亞胺基團(tuán)的引入大大降低了其發(fā)生熱致Bergman環(huán)化反應(yīng)的位壘。由此,我們嘗試將烯二炔3在不同極性的溶劑中進(jìn)行熱致Bergman環(huán)化反應(yīng)。在封管中,分別選用了四氯化碳、氯仿、乙腈和二甲基亞砜(DMSO)等溶劑將烯二炔3加熱到60 ℃,利用TLC點(diǎn)板跟蹤反應(yīng)。反應(yīng)24 h以后,發(fā)現(xiàn)在極性相對(duì)較小的四氯化碳、氯仿溶劑中,原料烯二炔沒有發(fā)生反應(yīng);而在乙腈中,原料烯二炔發(fā)生了部分轉(zhuǎn)化;在極性比較大的二甲基亞砜溶劑中,反應(yīng)6 h后,原料烯二炔就已經(jīng)反應(yīng)完全。我們認(rèn)為烯二炔3在非極性溶劑中能夠穩(wěn)定存在,而當(dāng)其轉(zhuǎn)移到極性溶劑中,就會(huì)加速發(fā)生Bergman環(huán)化反應(yīng)。圖2示出了烯二炔3及其在極性溶劑二甲基亞砜中加熱到60 ℃、反應(yīng)24 h后所得產(chǎn)物的核磁共振氫譜。對(duì)比發(fā)現(xiàn)化學(xué)位移在7.36～7.26區(qū)域的苯環(huán)上的氫,化學(xué)位移4.67處的芐胺亞甲基的氫,2.55～0.94區(qū)域的烷基氫的峰形都展寬了,說明烯二炔發(fā)生了Bergman環(huán)化反應(yīng),苯基雙自由基單體之間相互偶聯(lián)形成結(jié)構(gòu)剛性的聚合物。烯二炔3針對(duì)不同極性溶劑表現(xiàn)出的反應(yīng)活性的差異無(wú)法用一般的Bergman環(huán)化反應(yīng)機(jī)理來解釋[29]。最近,Haberhaueret等[30]提出了烯二炔之間的二聚反應(yīng),并且給出了其可能的反應(yīng)方式。這種反應(yīng)方式的位壘要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Bergman環(huán)化反應(yīng),并且每個(gè)烯二炔分子只有一個(gè)碳碳叁鍵參與反應(yīng),使得最后的聚合物產(chǎn)物中存在豐富的炔基基團(tuán)。傅里葉紅外光譜(圖3)顯示烯二炔3在2 210 cm-1處有明顯C≡C的伸縮振動(dòng)峰,而聚合物在2 210 cm-1處C≡C峰已經(jīng)消失,表明并沒有發(fā)生烯二炔之間的二聚反應(yīng)。圖4示出了將烯二炔3和對(duì)應(yīng)的聚合物溶于甲醇后測(cè)得的紫外可見光光譜。實(shí)線標(biāo)記的烯二炔3的光譜表明烯二炔在265 nm 和368 nm處有兩組特征的吸收峰,吻合芳香環(huán)π-π*過渡態(tài)和烯二炔部分的π-π*過渡態(tài)。虛線標(biāo)記的Bergman環(huán)化反應(yīng)之后的聚合物的光譜,呈現(xiàn)出一個(gè)拖尾到430 nm位置的寬峰,說明反應(yīng)前后分子的共軛體系發(fā)生了顯著的變化。

圖2 烯二炔3和對(duì)應(yīng)聚合物的核磁共振氫譜

圖3 烯二炔3和對(duì)應(yīng)聚合物的紅外光譜

圖4 烯二炔3和對(duì)應(yīng)聚合物的紫外-可見光譜

為了進(jìn)一步證實(shí)烯二炔3發(fā)生了Bergman反應(yīng),我們進(jìn)行了電子順磁共振波譜(EPR)的測(cè)試。熱致Bergman環(huán)化反應(yīng)的本質(zhì)是熱致引發(fā)條件滿足時(shí),會(huì)產(chǎn)生高活性的苯基雙自由基。自旋捕捉劑可以與壽命短暫的自由基反應(yīng),生成相對(duì)穩(wěn)定的自由基加合物[31],再利用EPR檢測(cè)技術(shù)獲得相應(yīng)的加合物圖譜,分析出精細(xì)的偶合參數(shù),可以判斷和識(shí)別出自由基的類型,進(jìn)一步推斷出前體的化學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)。我們用PBN作為自旋捕捉劑,追蹤Bergman反應(yīng)的中間體的碳自由基[26],由于新生成的氮氧自由基結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定,可以進(jìn)一步表征和研究。EPR研究表明(圖5),混合物中至少存在兩種自由基類型。圖5所示的三重精細(xì)偶合參數(shù)為1.45 mT的峰,和1,4-苯基雙自由基的單加成PBN產(chǎn)物非常吻合[26,31-33]。說明了體系中存在單PBN加成的產(chǎn)物。與此同時(shí),在高分辨質(zhì)譜中也看到了單PBN加成產(chǎn)物的分子離子峰525.290 5。另外,在EPR譜圖還可以看到一組微弱的小峰,它們的精細(xì)偶合參數(shù)為0.56 mT,對(duì)應(yīng)于1,4-苯基雙自由基的雙PBN加成產(chǎn)物[21,34]。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)烯二炔3發(fā)生Bergman環(huán)化反應(yīng)后的自由基可以繼續(xù)與其他分子反應(yīng),為烯二炔3用于生物活性研究提供了支持。

圖5 PBN自由基加合物在氯仿中的EPR譜線

2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

選取了肺腺癌細(xì)胞(A549)和正常肝細(xì)胞(L-02),運(yùn)用MTT比色法來評(píng)估烯二炔的細(xì)胞毒性,并選用丙酮作為有機(jī)溶劑載體,傳遞烯二炔至細(xì)胞中。空白實(shí)驗(yàn)組表明,采用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的丙酮溶液培養(yǎng)細(xì)胞以后,腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞仍然保持較高的活性。因此,烯二炔3的丙酮溶液如果對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生任何的抑制作用,其活性是來自烯二炔3,而非丙酮。我們嘗試將烯二炔3溶解在丙酮溶劑中,制備出新鮮的烯二炔溶液用于細(xì)胞毒性的研究。選取不同濃度的烯二炔3對(duì)腫瘤細(xì)胞A549、正常細(xì)胞L-02共同進(jìn)行培養(yǎng),圖6比較了不同濃度的烯二炔3對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的抗增殖能力。MTT比色法評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,抗腫瘤烯二炔3對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞都表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。當(dāng)烯二炔濃度在4.7 μmol/L以上,細(xì)胞存活率呈現(xiàn)出藥物濃度的依賴性。烯二炔3對(duì)實(shí)驗(yàn)中使用的腫瘤細(xì)胞A549的半抑制濃度(IC50)為15～20 μmol/L,凸顯了烯二炔3對(duì)腫瘤細(xì)胞較高的抗增殖能力,說明可以開發(fā)烯二炔3用于臨床作為抗腫瘤抗生素的潛能。但是,烯二炔3并沒有顯示出細(xì)胞選擇性,對(duì)正常細(xì)胞L-02也有明顯的細(xì)胞毒性,在很低的烯二炔濃度下,就產(chǎn)生了強(qiáng)烈的抑制能力。為此在后續(xù)的工作中,可以圍繞以下幾個(gè)方面展開：第一,烯二炔3整個(gè)分子的疏水性比較強(qiáng),加之整個(gè)細(xì)胞的微環(huán)境是親水性的,使得烯二炔3進(jìn)入細(xì)胞的難度加大?？梢詫⑾┒?的封端芐基直接替換成其他親水性比較好的基團(tuán),增加整個(gè)分子的親水性,亦或是將惰性的芐基替換成其他活性基團(tuán),可以進(jìn)一步與親水性的功能化基團(tuán)反應(yīng)。這樣既可能增加烯二炔3的抗腫瘤毒性,也能使烯二炔3分子兼具其他功能。第二,腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞微環(huán)境的差異為我們解決烯二炔3的細(xì)胞選擇性提供了一條思路。比如根據(jù)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞微環(huán)境酸性的不同,我們可以改變烯二炔3分子的炔基取代基,使其成為pH響應(yīng)的功能化藥物小分子。另外也可以在烯二炔3分子的炔基末端修飾光響應(yīng)型的基團(tuán),當(dāng)藥物分子釋放完畢后,局部照射腫瘤部位引發(fā)烯二炔的活性。這樣就可以靶向作用腫瘤細(xì)胞,在保持烯二炔3強(qiáng)烈的抗腫瘤細(xì)胞增殖能力的同時(shí),大大減少對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性。第三,烯二炔3也可以負(fù)載在具有腫瘤靶向的載體上,傳輸?shù)侥[瘤特定區(qū)域脫附載體后,釋放烯二炔的抗腫瘤活性。

圖6 不同濃度烯二炔3對(duì)腫瘤和正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性

3 結(jié)論與展望

本文從烯二炔抗生素的合成著手,設(shè)計(jì)并合成了基于馬來酰亞胺為主體結(jié)構(gòu)的烯二炔。馬來酰亞胺部分羰基的吸電子效應(yīng)大大降低Bergman環(huán)化反應(yīng)的熱引發(fā)溫度。該烯二炔的Bergman環(huán)化反應(yīng)得到多種譜學(xué)測(cè)試的證實(shí)。細(xì)胞毒性證明其可以對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生高效的抑制作用,其IC50可以媲美商用抗腫瘤藥物。但是,該種烯二炔對(duì)正常細(xì)胞也顯示出了強(qiáng)烈的抗增殖能力,說明它缺乏細(xì)胞選擇性。這可以通過在烯二炔上引入腫瘤靶向基團(tuán),或者將該種烯二炔負(fù)載在具有腫瘤靶向的載體上解決。無(wú)論如何,該種烯二炔合成路線簡(jiǎn)單,細(xì)胞毒性作用高效,為以后設(shè)計(jì)合成高選擇性、高效率開環(huán)烯二炔抗生素提供了一個(gè)新的思路。

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Design,Synthesis and Cytotoxicity Study of a Novel Acyclic Enediyne

HUANG Shuai, LI Jing, LI Bao-jun, HU Ai-guo

(Shanghai Key Laboratory of Advanced Polymeric Materials,School of Materials Science and Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

An acyclic enediyne with maleimide as the main structure and two symmetrical alkynyl chains was synthesized through Sonogashira coupling reaction.The enediyne was subjected to thermal Bergman cyclization to yield diradical intermediates.FT-IR results showed the complete conversion of the alkynyl moiety.The diradical intermediates could be further trapped by a spin trap (PBN) to generate mono- and di-PBN adducts corroborating the occurrence of the Bergman cyclization,which was confirmed by EPR analysis.MTT cell activity experiments confirmed that the half inhibitory concentration of this small molecular enediyne on tumor cell was around 18 μmol/L which were stable enough for long-time storage and active enough to suppress the cell multiplication for potential clinical application.

enediyne; Bergman cyclization; antibiotics; cytotoxicity

1006-3080(2017)01-0001-07

10.14135/j.cnki.1006-3080.2017.01.001

2016-04-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21474027)

黃 帥(1990-),男,碩士生,主要從事有機(jī)小分子合成研究。E-mail:hsecust@163.com

胡愛國(guó),E-mail:hagmhsn@ecust.edu.cn

O621.3

A