酵母菌發(fā)酵玉米皮制備菌體蛋白飼料

王雅波，劉占英，蘭 輝，李永麗，劉艷新

（內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050）

資源開(kāi)發(fā)利用

酵母菌發(fā)酵玉米皮制備菌體蛋白飼料

王雅波，劉占英*，蘭 輝，李永麗，劉艷新

（內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050）

玉米皮是玉米加工過(guò)程中的主要副產(chǎn)品，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，可作為緩和資源短缺和降低工業(yè)成本的優(yōu)質(zhì)飼料來(lái)源，但目前各玉米淀粉廠對(duì)其的綜合利用不夠完全，導(dǎo)致部分資源浪費(fèi)。本文采用飼料國(guó)標(biāo)測(cè)定法對(duì)玉米皮中纖維素類(lèi)等有效成分進(jìn)行測(cè)定，并以玉米皮為原材料，采用畢赤酵母菌2.3250發(fā)酵的方法降解玉米皮中的纖維素類(lèi)物質(zhì)，使其充分轉(zhuǎn)化為高附加值的飼料蛋白。結(jié)果表明：玉米皮中的纖維素和半纖維素含量分別為16.40%和47.68%，蛋白質(zhì)含量為11.49%，淀粉含量為15.50%，脂肪含量為2.73%，木質(zhì)素含量為5.41%。另外，利用畢赤酵母菌轉(zhuǎn)化玉米皮時(shí)，在無(wú)蛋白胨添加的情況下，25℃恒溫培養(yǎng)48h，畢赤酵母菌濃度最高，為2.31×107個(gè)/m L。經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵，玉米皮中纖維素含量由16.40%降到6.22%，半纖維素含量由47.68%降到33.45%。該研究對(duì)玉米皮的重要組分進(jìn)行了系統(tǒng)分析，為利用酵母菌發(fā)酵玉米皮生產(chǎn)高附加值的菌體蛋白飼料等后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

玉米皮；酵母；菌體蛋白飼料

玉米是我國(guó)的主要糧食作物之一，我國(guó)現(xiàn)今擁有幾百家玉米淀粉加工廠。玉米皮是玉米淀粉加工的主要副產(chǎn)物之一，大約占玉米總質(zhì)量的12%（史建國(guó)，2007），但玉米皮并未得到充分利用，產(chǎn)品附加值極低，導(dǎo)致主產(chǎn)品成本增高，利潤(rùn)率下降，市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力變?nèi)跫吧鐣?huì)效益降低等。因此更深層次的開(kāi)發(fā)利用玉米的深加工副產(chǎn)物玉米皮（丁聲俊，2011），可帶動(dòng)玉米加工企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。與此同時(shí)，因飼料工業(yè)存在飼料蛋白供不應(yīng)求的現(xiàn)象，僅依靠生產(chǎn)以往使用的蛋白類(lèi)飼料根本無(wú)法滿(mǎn)足飼料生產(chǎn)迅速發(fā)展的需求，而發(fā)展微生物飼料蛋白是滿(mǎn)足其需要的有效途徑之一 （代養(yǎng)勇等，2011），并且玉米皮是該產(chǎn)業(yè)的首選原材料。孫付保等（2010）利用混合菌株固態(tài)發(fā)酵玉米皮生產(chǎn)飼料蛋白，張博潤(rùn)等（1997）利用白地霉Z-4、熱帶假絲酵母Z-14和木素木霉Z-203菌株混合發(fā)酵白酒糟生產(chǎn)飼料蛋白，但這些產(chǎn)纖維素酶的微生物大多數(shù)是真菌，而酵母菌與其相比更具色、香、味和較高的蛋白質(zhì)含量，發(fā)酵過(guò)程中耐酸能力強(qiáng)，不易污染，回收率高等優(yōu)點(diǎn)，是生產(chǎn)微生物蛋白飼料的首選菌種（陳曉萍，2009）。因此，本文利用酵母菌將玉米皮轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)飼料，旨在有效利用玉米皮的營(yíng)養(yǎng)成分，為菌體蛋白飼料研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)原料 玉米皮購(gòu)于內(nèi)蒙古阜豐科技有限責(zé)任公司，其他化學(xué)試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 菌種 畢赤酵母菌，為本實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到的最佳菌種。

1.1.3 儀器與設(shè)備 高效液相色譜Water 1515；色譜柱：Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm id，9μm）；RI示差檢測(cè)器；流動(dòng)相：8 mmol/L H2SO4；進(jìn)樣體積：20μL；流動(dòng)相流速：0.5 mL/min；柱溫：40℃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米皮成分的測(cè)定

纖維素、半纖維素含量的測(cè)定：范式測(cè)定纖維含量法（馮繼華等，1994）。

木質(zhì)素含量的測(cè)定：飼料中酸性洗滌木質(zhì)素的國(guó)標(biāo)測(cè)定方法（GB/T 20805-2006）。

粗蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：飼料中粗蛋白質(zhì)的國(guó)標(biāo)測(cè)定方法（GB/T 6432-94）。

淀粉含量的測(cè)定：測(cè)淀粉含量的國(guó)標(biāo)方法—酶水解法（郭冬生等，2007）。

脂肪含量的測(cè)定：測(cè)脂肪含量的國(guó)標(biāo)方法—索氏提取法（GB/T 6433-2006），以及酸水解法（李秀花，1994）。

1.2.2 酵母菌發(fā)酵玉米皮制備飼料蛋白 厭氧培養(yǎng)需取24個(gè)30mL西林瓶，稱(chēng)取0.6 g玉米皮，加入30mL蒸餾水；好氧培養(yǎng)需取24個(gè)100 mL三角瓶（提前洗凈，烘干），均稱(chēng)取0.6 g玉米皮，加入30mL蒸餾水，蓋膠塞，壓鋁蓋后放入1.5 MPa，121℃壓力鍋中滅菌。在操作前，需先在超凈工作臺(tái)內(nèi)殺菌30min，再接入1.5mL酵母菌液（5%接菌量），置于25℃，150 r/min的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)菌種。每24個(gè)瓶培養(yǎng)一個(gè)時(shí)間梯度，分別為24、48 h。觀察不同培養(yǎng)時(shí)間和需氧情況對(duì)畢赤酵母菌體的影響。

1.2.3 微生物飼料中菌體濃度測(cè)定 將培養(yǎng)好的菌液置于振蕩器上振蕩5 min，使菌落脫離玉米皮。再將菌液倒入離心管中，3000 r/min離心5min（張國(guó)華等，2008）。然后取上清液倒入比色皿中，置于分光光度計(jì)內(nèi)，測(cè)定OD560。

1.2.4 微生物飼料中菌體數(shù)測(cè)定 由于原菌液濃度太大，給計(jì)數(shù)帶來(lái)極大不便，故需預(yù)先稀釋。本次所采用的稀釋方法為：準(zhǔn)備數(shù)個(gè)裝有9 mL蒸餾水30mL西林瓶，取1mL菌液添加到一個(gè)西林瓶中，依此梯度稀釋5個(gè)濃度，考慮到在操作過(guò)程中容易染菌，所以使用壓過(guò)蓋的西林瓶稀釋?zhuān)缓笤倮醚虬逵?jì)數(shù)（沈萍等，2007）。

1.2.5 乙醇產(chǎn)量的測(cè)定

1.2.5.1 流動(dòng)相配制 先用抽濾瓶抽取少量二次水，清洗抽濾瓶?jī)?nèi)壁，將清洗后的水倒出。再用抽濾瓶抽取約1000 mL二次水后，再用超聲波清洗器超聲0.5 h，之后將其內(nèi)的屈臣氏水加入到儀器儲(chǔ)液瓶中。

1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品的配置 乙醇2 g，72%的硫酸溶液5mL，最后用二次水稀釋到1 L。

1.2.5.3 樣品溶液的配制 取培養(yǎng)好的菌液上清液950μL和50μL的10%的硫酸溶液加入到離心管中，4℃、15000 r/min冷凍離心3min。取出上清液置于另一離心管中，在上述同樣的條件下再離心3 min，同樣取出上清液經(jīng)0.22μm水相過(guò)濾頭過(guò)濾后置于進(jìn)樣瓶中，開(kāi)始測(cè)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米皮組分的分析 玉米皮組分含量見(jiàn)表1，纖維素含量約為24.80%、半纖維素含量為47.68%、蛋白質(zhì)含量為 11.49%、淀粉含量為15.50%、脂肪含量為2.73%以及木質(zhì)素含量為5.41%。這與Palmarola-Adrados等（2005）的研究近乎相同。

2.2 酵母菌發(fā)酵玉米皮制備飼料蛋白

2.2.1 培養(yǎng)條件對(duì)菌種濃度的影響 由表2可知，厭氧條件下培養(yǎng)48 h時(shí)，畢赤酵母菌體個(gè)數(shù)為2.31×107個(gè)/mL，相較于其他培養(yǎng)條件下，菌體濃度最高。

表1 玉米皮組成及含量%

表2 培養(yǎng)條件對(duì)菌體濃度的影響

2.2.2 蛋白胨添加量對(duì)菌種濃度的影響 由表3可知，蛋白胨添加量為0 g時(shí)，畢赤酵母菌體數(shù)量為2.31×107個(gè)/mL，高于其他條件下培養(yǎng)的菌體數(shù)量。

表3 蛋白胨添加量對(duì)菌種濃度的影響

2.2.3 纖維素與半纖維素的降解率 通過(guò)以上試驗(yàn)結(jié)果得知，在以玉米皮為底物時(shí)，厭氧培養(yǎng)48 h以后的菌液濃度明顯高于24 h的菌體濃度，厭氧條件下比好氧條件菌體濃度高，所以對(duì)該條件下培養(yǎng)后的剩余培養(yǎng)基中的纖維素和半纖維素成分進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 纖維素和半纖維降解率%

經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵，玉米皮中纖維素含量由16.40%變到6.22%，半纖維素含量由47.68%變到33.45%，說(shuō)明畢赤酵母菌使玉米皮中的纖維素和半纖維素得以降解，供己所需，這可能是由于畢赤酵母菌產(chǎn)生某種可降解纖維素的酶。隨著營(yíng)養(yǎng)成分的不斷增加，菌體濃度也會(huì)隨之上升，與培養(yǎng)48 h菌體濃度高于24 h結(jié)論一致。

2.2.4 乙醇產(chǎn)量 經(jīng)高效液相色譜測(cè)定，得到并無(wú)乙醇產(chǎn)生。

3 討論與小結(jié)

Javed等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，玉米皮中含有豐富的纖維類(lèi)物質(zhì)，其中包括有30%～50%的半纖維、10%～20%纖維素以及微量的木質(zhì)素。本試驗(yàn)結(jié)果表明，玉米皮中的纖維類(lèi)物質(zhì)含量很高，其中纖維素含量為16.40%，木質(zhì)素含量為5.41%，而半纖維素含量高達(dá)47.68%，淀粉含量為15.50%，蛋白質(zhì)含量為11.49%，在測(cè)量時(shí)會(huì)因原料的產(chǎn)地及種類(lèi)不同略有差異。另外，畢赤酵母菌可以有效的發(fā)酵玉米皮，通過(guò)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法和分光光度法均證實(shí)，在以玉米皮為底物時(shí)，厭氧培養(yǎng)48 h以后的菌液濃度明顯高于24 h的菌體濃度，厭氧條件下比好氧條件菌體濃度高，這一現(xiàn)象可能是由于在起初接入畢赤酵母菌時(shí)，首先會(huì)利用一部分木糖維持，以致培養(yǎng)前期酵母處于延遲期生長(zhǎng)，菌體數(shù)目增加不明顯，同時(shí)木糖的消耗較少（陳曉萍，2009）；培養(yǎng)后期酵母處于指數(shù)生長(zhǎng)期，酵母數(shù)急劇增加，同時(shí)開(kāi)始消耗玉米皮中的纖維素。對(duì)剩余培養(yǎng)基成分進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，玉米皮中纖維素含量由16.40%降到6.22%，半纖維素含量由47.68%降到33.45%，遠(yuǎn)高于喬君毅（2008）研究的纖維素和半纖維素的降解率水平，達(dá)到了玉米皮成分得以轉(zhuǎn)化的效果，在發(fā)酵過(guò)程中并未產(chǎn)生乙醇等影響飼料生產(chǎn)的有毒物質(zhì)，符合其作為微生物飼料的基本要求。

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Corn bran is themain by-product of the corn，which riches in nutritional value.As a high quality source of feed，corn bran can ease the shortage of feed resource and reduce the cost of feed industry.However the comprehensive utilization of the corn starch plant is completely inadequate，resulting in partof thewaste of resources.This paper aims to determinate the effective components of corn husk cellulose by the feed national standard method，and takingmaize peel as raw material，degrade corn husk cellulose material to make it fully into high value-added feed protein using Pichia pastoris 2.3250 fermentation method.The experimental results showed that the contents of cellulose and hemicellulose in corn bran were 16.40%and 47.68%respectively，and the protein contentwas 11.49%，the starch contentwas 15.50%，the fat content was 2.73%and the lignin contentwas 5.41%.When using the Pichia pastoris transformed corn skin components，in the absence of peptone added，culture for 48 h in the temperature was 25℃，microbial feed protein concentration is the highest，and the yeast cell number was 2.31×107/mL，the content of cellulose decreased from 16.40%to 6.22%，the hemicellulose contentdecreased from 47.68%to 33.45%.The study systematic analysis the important components of corn，and laid the foundation for the further research on the production ofhigh added value ofbacterial protein feed by using yeast fermentation.

corn bran；yeast；microbial protein feed

S816.4

A

1004-3314（2017）04-0031-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（61361016）；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（2013151412000）；內(nèi)蒙古自治區(qū)草原英才工程項(xiàng)目；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校青年科技英才支持計(jì)劃項(xiàng)目

*通訊作者

DO I：10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170408