近紅外光譜分析技術(shù)及其在飼料中的應用

李玉鵬， 李海花， 朱 琪， 喬家運， 王文杰*

（1.天津市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；2.天津市畜禽健康養(yǎng)殖技術(shù)工程中心，天津300381）

檢測分析

近紅外光譜分析技術(shù)及其在飼料中的應用

李玉鵬1，2， 李海花1，2， 朱 琪1，2， 喬家運1，2， 王文杰1，2*

（1.天津市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；2.天津市畜禽健康養(yǎng)殖技術(shù)工程中心，天津300381）

近紅外反射光譜分析技術(shù)（N IRS）正在以產(chǎn)業(yè)鏈的方式應用于多個領(lǐng)域，它可以快速高效地測定樣品中的化學組分和物化性質(zhì)。近年來，近紅外光譜技術(shù)尤其是在線分析的應用有了顯著的發(fā)展，本文就近紅外光譜分析技術(shù)的原理及在飼料中的應用研究進行了介紹。

近紅外反射光譜分析；飼料；檢測

近紅外光譜技術(shù)（NIRS）測定樣品中的化學組成和物化性質(zhì)時具有速度快、效率高、樣品處理簡單等優(yōu)點（陸婉珍等，2000），近些年正在以產(chǎn)業(yè)鏈的方式應用于多個領(lǐng)域，如農(nóng)業(yè)、石化、制藥、食品和臨床等，成為農(nóng)工礦企業(yè)和科研部門不可或缺的一種手段。

利用經(jīng)典的化學分析方法分析飼料的常規(guī)組分及營養(yǎng)成分，一直是飼料品質(zhì)管理的主要手段，雖然靈敏度和精確度高，但仍存在樣品準備繁瑣、前處理復雜、分析時間較長、檢測成本高、污染環(huán)境、對試驗條件和操作的人員要求相對較高等問題，但近紅外反射光譜技術(shù)的應用成功地解決了上述問題，隨著NIRS技術(shù)的發(fā)展利用，飼料檢測成為NIRS技術(shù)應用最早的領(lǐng)域之一。

1 近紅外光譜分析技術(shù)

近紅外光本質(zhì)是電磁波。近紅外光譜（NIR）區(qū)的發(fā)現(xiàn)比較早，是在1800年由Hershel發(fā)現(xiàn)的。美國ASTM（American Society for Testing and Materials，ASTM）規(guī)定近紅外光譜范圍為780～2526 nm（12820～3959 cm），介于可見光和中紅外之間。普遍認為近紅外波長分為兩個區(qū)域，即長波和短波，780～1100 nm處為短波，常用來做透射分析，1100～2526 nm處為長波，常用來做反射或漫反射分析 （董守等，2004；陸婉珍等，2000）。NIRS是20世紀70年代后發(fā)展起來的一種新的快速定性定量分析技術(shù)，尤其是進入80年代后，工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展十分迅速，且社會對環(huán)境保護提出了更高的要求，近紅外技術(shù)為節(jié)能降耗發(fā)揮巨大作用（趙雅欣等，2005）。NIRS主要是利用有機物中含氫集團X-H（包括C-H、N-H、S-H、O-H等化學鍵）振動的倍頻與合頻吸收，振動的非諧振性分子振動從基態(tài)向高能級躍遷時產(chǎn)生，并通過主成分分析 （priciple component analysis，PCA）、偏最小二乘法（partial least square，PLS）和人工神經(jīng)網(wǎng)絡 （artificial neural network，ANN）等化學計量學手段，建立物質(zhì)成分光譜與相應的待測成分含量之間的回歸模型，可利用相關(guān)系數(shù)較高的預測模型和待測物質(zhì)的近紅外光譜信息預測物質(zhì)化學成分含量（張卉等，2007）。

1.1 近紅外光譜分析技術(shù)原理 分子光譜的產(chǎn)生是由于分子中原子核的周期運動，包括近紅外、中紅外、遠紅外和拉曼光譜。近紅外光譜分析技術(shù)是根據(jù)物質(zhì)的光譜信息，對其進行定量或定性分析的一種技術(shù)。近紅外光譜分析技術(shù)基本分為透射光譜和漫反射光譜兩大類。透射光譜法常用于均勻透明的液體，固體樣品較常用漫反射光譜法，在短波近紅外處固體樣品也可用透射光譜法。能產(chǎn)生近紅外光譜的物質(zhì)分子都是紅外活性分子，非紅外活性分子不吸收紅外光。物質(zhì)組分的濃度值與通過儀器測定的光譜之間有一定的相關(guān)性（秦華俊，2007）。由于影響近紅外譜帶位置變化的因素很多，因而精確近紅外譜譜帶的歸屬十分不易（陸婉珍等，2000）。近紅外定量分析過程分為三部分：定標、驗證和應用，而最終的目的是為了應用，發(fā)揮近紅外的優(yōu)勢，實現(xiàn)其研究價值。

1.2 近紅外光譜分析技術(shù)的特點 近紅外光譜分析技術(shù)成功地結(jié)合了計算機技術(shù)、光譜技術(shù)和化學計量學等諸多方面的技術(shù)成果，已在許多領(lǐng)域中得以應用，與傳統(tǒng)分析技術(shù)相比主要具有以下優(yōu)點：不需要對待分析樣品進行前處理、不會對環(huán)境造成污染且節(jié)約大量的試劑費用、投資及操作成本低、分析方便速度快、穩(wěn)定性好，受干擾小、分析過程中不消耗其他材料或破壞樣品、測試重現(xiàn)性好等（陸婉珍，2006）。隨著微電機系統(tǒng)和微光機電系統(tǒng)技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外研制出了幾款新型的微型近紅外儀。微型近紅外光譜儀與普通的光譜儀相比有其明顯的優(yōu)勢：（1）體積小、容易實現(xiàn)模塊化，更符合近年來對檢測儀器輕巧、便攜的要求，且實現(xiàn)了現(xiàn)場應用的價值；（2）耐用、結(jié)構(gòu)緊湊、低能耗、校準速度快、對環(huán)境溫度和濕度變化適用范圍更寬；當前，國內(nèi)生產(chǎn)的微型化近紅外光譜儀大多數(shù)還處在理論的樣品機狀態(tài)，實用化的商品較少，但是，也已在制藥、奶粉生產(chǎn)等現(xiàn)場的監(jiān)測中廣泛應用，所以微型化近紅外光譜儀的開發(fā)不僅是現(xiàn)實的需要，也是一種普遍趨勢。

然而，近紅外技術(shù)也存在一些缺點 （張麗英等，2011；嚴衍祿等，2005；陸婉珍等，2000）：（1）近紅外技術(shù)是一種間接測量手段，需要用參考方法（一般是濕化學分析法）得到足夠數(shù)量的樣品濕化學分析值，因此測量精度基本都達不到該參考方法的測量精度，同時模型建立也離不開化學計量學的支撐；（2）前期投入大、費時費力，仍需檢測大量樣品的濕化學值，建模成本較高，對小批量樣品分析不切實際；（3）近紅外技術(shù)的使用范圍有一定的限制，待測定的成分含量最少為0.1%，且有含氫基團或與之含氫基團相關(guān)的屬性；（4）儀器和儀器周圍環(huán)境的改變或建模樣品發(fā)生改變，導致模型也會發(fā)生變化，需要對定標模型進行不斷的更新和優(yōu)化；（5）由于不同的儀器所產(chǎn)生的近紅外光譜并不一致，使得每臺儀器的模型都不相同，模型不能在不同型號儀器之間轉(zhuǎn)移，每個儀器上的模型需要隨著時間和空間范圍的變化不斷地進行維護，從而增加了使用的局限性（李軍濤，2014）。而微型近紅外儀測試的靈敏度比較低、相對誤差較大，分辨率和光譜穩(wěn)定性還有待提高（張小超等，2012）。

1.3 近紅外模型的評價參數(shù)和優(yōu)劣性判斷標準近紅外模型的建立過程中，需要用到諸多參數(shù)（SEC、SECV和R2等）對模型的質(zhì)量進行評定，以選取最優(yōu)的建模參數(shù)，進而得到預測性能最佳的模型。

定標模型建立后采用交叉驗證相關(guān)系數(shù)（1-VR）、交叉檢驗標準誤差（SECV）、模型的交叉驗證偏差（Bias）、定標標準分析誤差（SEC）、定標決定系數(shù)（RSQcal）對其預測性能進行綜合評定。1-VR值越大，SEC越小，SECV值也越小 （通常SECV大于SEC）則模型回歸得越好，但SEC過小，說明校正過程中可能存在過擬合現(xiàn)象。

在定標模型建立完成后，需要用驗證集對模型的性能（準確性、重復性和傳遞性等）進行驗證。驗證集是由一組完全獨立于定標集的樣本組成，采用近紅外預測值與濕化學值間的平均偏差（Bias）、驗標標準分析誤差（SEP）、驗標相關(guān)系數(shù)（RSQv）及實驗室實測值和近紅外值進行評定。SEP越小，預測結(jié)果越準確。相關(guān)系數(shù)（RSQv）越高，同時驗證集的預測值與濕化學值間的平均偏差（Bias）相對偏低的模型，即為最優(yōu)模型。

1.4 影響近紅外測定準確性的因素 影響近紅外測定準確性的因素很多，基本上可分為三大類：（1）樣品本身的影響；（2）參比值測定的準確性；（3）近紅外儀器的穩(wěn)定性及操作環(huán)境。

1.4.1 定標樣本的數(shù)量、來源、成分含量與變異試驗樣本數(shù)量的多少和分布影響測定結(jié)果的精確度，樣本數(shù)量過少不能充分反映被測群體的整體分布規(guī)律，樣本代表性差，建立的模型難以有適用性；樣本數(shù)量過多，不僅增加了工作量，而且也可能造成過擬合現(xiàn)象的出現(xiàn)。在實際應用中一般認為，建立適配性較窄的模型需選擇50～100個定標樣品，而建立適配性較寬或面向開放未知樣品群的模型則最少要選擇150個以上的樣品 （李勇等，2005）。選擇具有代表性的樣品，盡可能均勻全面地覆蓋整個測定組分含量范圍，但也要盡量避免樣品組分含量出現(xiàn)正態(tài)分布的現(xiàn)象，這樣才能夠充分地反映出待測樣品群體常態(tài)分布規(guī)律，構(gòu)建的近紅外預測模型性能才更真實可用。對于棉籽粕，采集樣品時除了考慮數(shù)量和成分含量、變異外，還應充分考慮品種、生長環(huán)境、加工方式、收獲季節(jié)等因素（李軍濤，2014）。

1.4.2 樣品的物理性狀 粉碎粒度的大小、樣品分布和密度等也會對近紅外預測性能產(chǎn)生影響。Thompso（1978）研究表明，樣品粒度是影響NIRS預測準確性最主要的因素。由于粒度不同影響樣品分布均勻性和光學表面性質(zhì)，所以會導致反射光分散進而改變樣品的近紅外光譜信息。Williams（1984）研究報道，在進行試驗分析的過程中樣品的水分含量應處于穩(wěn)定、自然狀態(tài)下，所以應注意樣品的保存。為防止樣品在儲存過程中的水分損失，將其裝于密封廣口瓶或自封袋中，-18℃低溫保存。樣品的溫度是影響近紅外測定的準確性的重要因素之一，所以在掃描樣品時將樣品放置在近紅外室內(nèi)24 h，可達到平衡溫度的效果，盡量保證定標樣品和待測樣品的光譜采集在同樣溫度下進行。此外，樣品表面的顏色和樣品中的雜質(zhì)也會對模型的性能造成影響。

1.4.3 參比數(shù)據(jù)的準確性 按照一定標準的濕化學方法分析得到的參比數(shù)據(jù)的準確性也是影響NIRS測定結(jié)果的重要原因之一。褚小立等（2005）研究表明，基礎數(shù)據(jù)準確性越高，則建立的模型的預測性能越好，對未知樣本的預測結(jié)果越精確。因此，對于定標和驗證樣品的理化值而言，其檢測一定要按照國際公認的標準或國標法進行，且每個樣品至少做2～3個平行，以確保參比值的檢測結(jié)果的精準無誤。

1.4.4 近紅外光譜儀的穩(wěn)定性和操作環(huán)境 儀器對測定結(jié)果準確性的影響大部分因素來自于儀器的噪音。儀器產(chǎn)生的噪音分為不同形式，即長期噪音和短期噪音。長期噪音主要因環(huán)境溫度變化和原件功能衰退而產(chǎn)生的。彭玉魁等（1996）研究表明，10～20℃的溫度改變會導致樣品吸光度變化，且此變化不定，無規(guī)律性。樣品杯中樣品的深度、密實度、裝樣后表面的平整度和樣品杯的清潔程度等因素也會對光譜造成一定的影響。因此每次盡可能保證一樣的裝樣條件，在相同的條件下測定樣品，以大大減少誤差。因此，近紅外的測定一般要求在相當穩(wěn)定的環(huán)境條件下工作。在進行近紅外測定之前，儀器的預熱很重要，且其時間與儀器的型號有關(guān)，不能短于15min或超過30min。短期噪音主要來源于波長不穩(wěn)定、檢出器和輸入放大器及儀器外部噪音。

2 近紅外光譜分析技術(shù)發(fā)展概況

人類最早認識的非可見光譜區(qū)是近紅外譜區(qū)，發(fā)現(xiàn)于1800年（嚴衍祿，2005）。近紅外在19世紀30年代被證明具有與可見光相同的光學性質(zhì)。由于受技術(shù)水平的不發(fā)達的限制，無法解決物質(zhì)在該光譜區(qū)的合頻和倍頻的吸收特征弱、譜帶交疊嚴重、解析困難等因素帶來的問題，因而使近紅外光譜“沉睡”了長達一個半世紀的時間。隨著各種技術(shù)（計算機、數(shù)字化和計量學）的不斷發(fā)展，背景干擾等問題的解決，可以很好地提取有效光譜信息。近紅外光譜的優(yōu)勢和使用價值逐漸被研究者證明，越來越多的實驗室和企業(yè)正在開展近紅外方面的研究，且被在實際中應用。近紅外作為高新技術(shù)之一，正在迅速發(fā)展，目前世界上大約有50個國家和地區(qū)對近紅外進行了相應的研究工作，尤其是一些發(fā)達國家近紅外技術(shù)已在許多領(lǐng)域得到了實際應用（張小超等，2012）。

20世紀70年代近紅外技術(shù)被美國人應用在農(nóng)產(chǎn)品水分、蛋白質(zhì)等組分含量的檢測。1950年前后，應用光譜的分析儀器倍受研究人員的關(guān)注，同時也關(guān)注近紅外光譜分析技術(shù)的發(fā)展情況，自1980年后應用光譜雜志（Applied Spectroscopy）上發(fā)表了很多有關(guān)近紅外光譜方面的論文，論文中涵蓋了有關(guān)近紅外定量和定性分析 （Stark等，1986）、有機物組分含量的分析（Weyer等，1985）、近紅外藥物成分分析和與之相關(guān)的研究進展等（Martin等，1992；Ciurczak等，1987）。近年來現(xiàn)代的科學技術(shù)一直在進步，微機械技術(shù)的發(fā)展以及微型光學元器件的研制成功，使得光譜儀的微小型化成為可能，并逐漸成為研究熱點之一 （向賢毅，2008）。許多研究人員利用新技術(shù)致力開發(fā)低成本、微型輕巧、能耗低且反應速度快的儀器，即微型近紅外儀。同樣，微型近紅外儀也分類型，主要的有傳統(tǒng)原理的傅里葉變換式光譜儀、光柵分光式微型光譜儀等和新原理的光譜儀。但是，整體上來說部分技術(shù)指標像分辨率、波長的準確程度和信噪比等仍然差于實驗室型的分析儀。

我國近紅外光譜技術(shù)的應用研究是從農(nóng)業(yè)領(lǐng)域開始的，在1977年前后才引入近紅外分析儀。國內(nèi)的嚴衍祿、張錄達等人最先研究學習近紅外方面的知識，為以后近紅外的應用研究打下了堅實的理論基礎，且在20世紀80年代初組建了研究傅立葉變換近紅外漫反射光譜的專項小組 （李大群等，1989）。20世紀80年代初發(fā)表了我國第一批關(guān)與此項技術(shù)的學術(shù)研究論文 （袁洪福等，2004；趙龍蓮等，1998；Yan等1998；Min等，1998；吉海彥等，1998）。目前，近紅外光譜分析技術(shù)已經(jīng)率先廣泛運用于我國紡織、造紙、生物化工、煙草、乳品、酒類與農(nóng)業(yè)等行業(yè)，它在確保和提高產(chǎn)品品質(zhì)方面發(fā)揮了重要作用 （徐廣通等，1999）。近年來，我國的光譜儀器的制造，化學計量學軟件的研發(fā)，相關(guān)模型的構(gòu)建和在實驗室及企業(yè)中的應用都有了長足的發(fā)展。我國許多領(lǐng)域已經(jīng)開始了近紅外光譜在線分析的應用，對實際生產(chǎn)中的各種參數(shù)，每個質(zhì)量控制環(huán)節(jié)實施連續(xù)監(jiān)控，確保獲得高質(zhì)量產(chǎn)品（蒲登鑫等，2003；徐廣通等，1990）。

3 近紅外光譜分析技術(shù)在飼料中的應用

由于近紅外光譜分析技術(shù)獨特的優(yōu)勢，伴隨著儀器的制造水平的提升、光譜化學計量學軟件的開發(fā)及各種測定樣品附件的研制均已達到較高的水平，自20世紀80年代中后期以來，NIRS在飼料中的應用已相當成熟，是農(nóng)業(yè)經(jīng)濟快速發(fā)展的新亮點。

1960年開始，研究者Norris等 （Burns等，1992）率先開始了利用NIRS測定谷物中的常規(guī)營養(yǎng)成分含量的研究，同時也進行了將近紅外光譜技術(shù)應用于其他農(nóng)產(chǎn)品組分和質(zhì)量的研究。隨著近紅外光譜分析技術(shù)的熟練應用，Schaalje和Mundel（1991）利用NIRS對大豆中氮的含量進行了檢測。Fontaine等（2001）研究表明，利用NIRS測定魚粉中油脂和蛋白質(zhì)含量是可行的。Montes等（2006）對飼料中的能量之王玉米的三種成分進行測定，其結(jié)果為：DM（RV2=0.95，SEP=1.2%），CP （RV2=0.88，SEP=0.3%），ST （RV2=0.79，SEP= 1.0%）。

Xiccato等（2003）采集不同國家的兔子飼料樣品164個，利用NIRS對DM、CP、CF、NDF、ADF、ADL和Starch成分的含量進行測定，隨機選取111個樣品作為定標集，剩余53個樣品作為驗證集，結(jié)果表明，定標集決定系數(shù)（R2）分別為0.79、0.84、0.63、0.56、0.84、0.74、0.94，檢驗集決定系數(shù)（R2），分別為0.70、0.86、0.60、0.50、0.82、0.59、0.90。

李靜（2007）利用NIRS成功構(gòu)建了棉粕化學成分的定標模型和驗證模型，模型預測棉粕粗脂肪含量的性能較差，其余常規(guī)營養(yǎng)成分的定標模型效果較好，可用于日常分析檢測。

目前NIRS技術(shù)不局限于樣品常規(guī)成分的分析，同時也能分析樣品中的微量組分含量，如氨基酸、維生素、毒素等物質(zhì)含量，還可以進行飼料有效能或消化率的測定等。有研究表明，近紅外預測棉籽粕真可利用氨基酸含量的定標結(jié)果是可行的，可按真可利用氨基酸進行飼料配方，達到準確適時高效利用飼料資源的目的 （丁麗敏，2000）。Lesson（2008）采用不同的方法測定了配合飼料和不同原料中的表觀代謝能（AMEn），試驗結(jié)果表明，不同測定方法得到的結(jié)果之差范圍為41.8～209 kJ/kg，而用NIRS測定的AMEn與濕化學測定值之間的平均差為836 kJ/kg，遠低于用其他測定方法得到的1254～1672 kJ/kg的差值，說明NIRS可以用于飼料中的AMEn的檢測。Losada （2010）采用體外法、常規(guī)法和近紅外法，分別對公雞的能量飼料的AMEn進行評定，結(jié)果顯示，RSQval分別為0.945、0.756和0.952?？偨Y(jié)多數(shù)研究者的結(jié)果，表明近紅外方法可用于飼料代謝能評定。

4 結(jié)語

我國的近紅外光譜分析技術(shù)的研究和應用雖然起步較晚，但隨著儀器和光譜處理化學計量軟件的國產(chǎn)化和相應各類應用模型的開發(fā)，近紅外光譜技術(shù)作為一種分析技術(shù)將會在越來越多的領(lǐng)域中充當快速檢測的手段。

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Near infrared reflectance spectroscopy（NIRS）has been applied in many fields，which can determine chemical composition and physical properties of the samples quickly and efficiently.In recent years，NIRS analysis skill has been improved significantly，especial online applications.This article introduced the principle of NIRS and its application in the feed.

near infrared reflectance spectroscopy；feed；determination

S816.17

A

1004-3314（2017）04-0022-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170406

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題（2012BAD39B01-3）

*通訊作者