混合臍血間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

王曉寧，焦紅亮，杜 偉，李建斌，楊 波

(1.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院放療科，河南 鄭州 450007；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 鄭州 450052；3.河南省紅十字血液中心，河南 鄭州 450003)

臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells,UCB-MSCs)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有毒性和抑制增殖的作用。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)將不同人源的UCB-MSCs混合，比較單份(1例孕婦來(lái)源的UCB-MSCs)與混合的UCB-MSCs(2例孕婦來(lái)源的UCB-MSCs)對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。采用免疫組化法檢測(cè)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的Caspase-8、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 間接共培養(yǎng)(Transwell小室)檢測(cè)UCB-MSCs對(duì)EGFP-C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用 為了檢測(cè)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞與UCB-MSCs之間的間接接觸相互作用，通過(guò)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的熒光強(qiáng)弱來(lái)觀察干細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞毒性作用，T(target，靶細(xì)胞即C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞)，E(effector，效應(yīng)細(xì)胞即UCB-MSCs)。在Transwell板內(nèi)，2×104個(gè)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于下室，UCB-MSCs接種于上室，中間由孔徑為0.4 μm薄膜將上下室分開(kāi)，從而檢測(cè)UCB-MSCs分泌抑制性蛋白對(duì)C6膠質(zhì)瘤的作用。單份UCB-MSCs和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞數(shù)量比例(E/T)分別為01、11、51、101；混合UCB-MSCs和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞數(shù)量比例(E/T)分別為(0.5 +0.5)1、(2.5+2.5)1、(5+5)1。Transwell板置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育3 d后通過(guò)共聚焦顯微鏡和計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白強(qiáng)度，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2 間接共培養(yǎng)細(xì)胞免疫組化檢測(cè)Caspase-8、Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達(dá) 固定細(xì)胞：吸棄培養(yǎng)基，3次PBS沖洗，每次4 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定25 min。內(nèi)源性過(guò)氧化物酶消除：3次PBS沖洗，每次4 min，體積分?jǐn)?shù)3% H2O2去離子水孵育10 min。封閉血清：滴加山羊血清工作液，室溫孵育15 min，傾去，不洗。孵育一抗：滴加一抗(適當(dāng)比例稀釋)，4 ℃過(guò)夜。PBS沖洗3次，每次3 min。孵育二抗：滴加生物素化二抗工作液，室溫孵育15 min。PBS沖洗3次，每次3 min。辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，室溫孵育15 min。PBS沖洗3次，每次3 min。顯色：DAB顯色劑。沖洗：自來(lái)水充分沖洗。復(fù)染：蘇木素約5 min使細(xì)胞核顯色。光鏡下觀察：中性樹(shù)膠封片觀察。

2 結(jié)果

2.1 UCB-MSCs與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞間接共培養(yǎng)的熒光強(qiáng)度 在Transwell培養(yǎng)板內(nèi)，按照不同比例UCB-MSCs處理C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下檢測(cè)熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示，E/T=51組的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞熒光強(qiáng)度與E/T=01組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，E/T=(2.5+2.5)1、101、(5+5)1作用于的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，強(qiáng)度均明顯減弱(P<0.05)。C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的熒光強(qiáng)度隨著E/T比例增高而減低，呈現(xiàn)反比例依賴關(guān)系；同比例時(shí)，混合組比單份組的細(xì)胞強(qiáng)度低，其中E/T=(5+5)1時(shí)其強(qiáng)度最低。見(jiàn)圖1。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè) Caspase-8、Bax、Bcl-2和Caspase-3 蛋白 Caspase-8、Bax和Caspase-3蛋白在E/T=01即有表達(dá)，染色強(qiáng)度淺，E/T=51時(shí)，蛋白表達(dá)水平較E/T=01有升高趨勢(shì)，但比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著E/T比例增加，表達(dá)水平逐漸升高，染色強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，E/T=(2.5+2.5)1、101、(5+5)1時(shí)，Caspase-8蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與E/T=01比較顯著升高(P<0.05)，其中E/T=(5+5)1時(shí)，其表達(dá)陽(yáng)性率最高。Bcl-2在E/T=01染色強(qiáng)度高，E/T=51時(shí)，蛋白表達(dá)水平較E/T=01有減低趨勢(shì)，但比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著E/T比例增加，表達(dá)水平逐漸減低，染色強(qiáng)度逐漸減弱，E/T=(2.5+2.5)1、101、(5+5)1時(shí)，Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與E/T=01比較顯著降低(P<0.05)。

圖1 UCB-MSCs與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞間接共培養(yǎng)的熒光強(qiáng)度

1)與E/T=51和E/T=(2.5+2.5)1，比較，P<0.05；2)與E/T=101，P<0.05

3 討論

MSC具有向膠質(zhì)瘤趨化的特性[1-4]及抑制腫瘤的生長(zhǎng)已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道，而且臍血在獲取材料、存儲(chǔ)、移植等方便優(yōu)于骨髓[5]。UCB-MSCs克服了神經(jīng)干細(xì)胞存在的倫理等問(wèn)題，具有向膠質(zhì)瘤細(xì)胞趨化的特性[6]。Bcl-2是細(xì)胞凋亡研究中重要的癌基因之一，Bcl-2家族目前己經(jīng)發(fā)現(xiàn)有20多個(gè)成員，例如凋亡蛋白Bax、Bik等，抗凋亡蛋白Bcl-2、Bfl-1、Bcl-W等。Bcl-2基因主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜上及線粒體外膜的漿膜面，其功能是阻止線粒體釋放細(xì)胞色素C、Caspase及活化因子AIF，穩(wěn)定線粒體膜。Bcl-2/Bax比值決定細(xì)胞是否凋亡[7]，Bax和Bcl-2具有拮抗作用，可以異源二聚體形式存在，也可形成同源二聚體[8]，Bax和Bcl-2可能是抗腫瘤治療潛在靶點(diǎn)，Bax由6個(gè)外顯子組成，產(chǎn)生4種mRNA，分別編碼相對(duì)分子質(zhì)量45 000、21 000和24 000的蛋白質(zhì)。細(xì)胞中的Bax蛋白與Bcl-2蛋白形成異源二聚體復(fù)合物，使Bcl-2失活，也可自身形成同源二聚體。Bax表達(dá)增多時(shí)，Bax/Bax二聚體增加，使凋亡作用增強(qiáng)。Caspase激活可分為[9-10]：切開(kāi)小亞基和大亞基；切開(kāi)大亞基和前導(dǎo)區(qū)；大亞基和小亞基構(gòu)成活性Caspase。另一種為效應(yīng)的Caspase，包括Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7等，有的不含死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，其與起始型Caspase結(jié)合后進(jìn)一步被激活，凋亡的終結(jié)者是效應(yīng)Caspase。

為了研究其具體機(jī)制，本研究應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞Caspase-8、Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白，Caspase-8、Bax和Caspase-3在E/T=51時(shí)，蛋白表達(dá)較E/T=01有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著E/T比例增加，蛋白表達(dá)水平逐漸升高，Caspase-8、Bax和Caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)與E/T比例正相關(guān)，同比例時(shí)，混合組比單份組的陽(yáng)性表達(dá)數(shù)量多，其中E/T=(5+5)1時(shí)，數(shù)量最多，但是Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)數(shù)量與上述相反。

綜上所述，混合的UCB-MSCs分泌各種細(xì)胞因子，如IL-2 和INF-γ等，作用于C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，抑制細(xì)胞的增殖，通過(guò)上調(diào)Bax表達(dá)和下調(diào)Bcl-2表達(dá)，開(kāi)放PTP孔，使細(xì)胞外膜破壞，線粒體膜電位消失，線粒體膜外的小分子進(jìn)入到膜內(nèi)，使得線粒體內(nèi)外膜之間的細(xì)胞色素C等促凋亡因子的釋放，凋亡蛋白活化因子與細(xì)胞色素C互相結(jié)合后，激活Caspase-8，使Caspase-3活化，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。

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