異養(yǎng)硝化菌的分離及在養(yǎng)殖廢水處理中的應(yīng)用

錢春園，郭曉澤，高 鋒，陶 瓊，鄭 舟，薛 彬，郭遠(yuǎn)明

（1.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021）

近年來隨著人們消費(fèi)水平的提高，對(duì)于水產(chǎn)品的需求日益增加，國內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展。水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)日益向集約化、高密度養(yǎng)殖模式發(fā)展[1-4]。在養(yǎng)殖過程中，為了滿足養(yǎng)殖生物的生長需求，需要大量投放餌料，由于餌料的吸收和利用率較低，大部分都以殘餌糞便的形式存在于養(yǎng)殖水體中[4]，造成養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝酸鹽以及有機(jī)物等污染物的含量嚴(yán)重超標(biāo)，水質(zhì)逐步惡化，養(yǎng)殖水體的環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞，養(yǎng)殖生物受到毒害，引起病害的頻繁發(fā)生[5-11]。為了滿足養(yǎng)殖生物的生長需求，養(yǎng)殖場通過頻繁更換水的辦法來改善水質(zhì)。未經(jīng)處理的養(yǎng)殖廢水排放到環(huán)境中，增加了水體的化學(xué)耗氧量，并造成水體富營養(yǎng)化，有害藻類大量繁殖，導(dǎo)致赤潮和水華現(xiàn)象發(fā)生，破壞了生物的棲息地，使生物多樣性和生態(tài)平衡遭到破壞[12-15]。

目前對(duì)養(yǎng)殖廢水的凈化處理大多都是利用傳統(tǒng)的污水處理方法如活性污泥法和生物膜法等，專門針對(duì)養(yǎng)殖廢水的凈化處理技術(shù)較少。人們一直以為在污水處理系統(tǒng)中執(zhí)行硝化功能的是自養(yǎng)型的微生物，硝化過程一般定義為微生物在有氧的條件下將氨氮氧化為亞硝酸鹽氮，再進(jìn)一步氧化為硝酸鹽氮，因此脫氮工藝是按照自養(yǎng)硝化菌的特性來設(shè)計(jì)的[16-18]。在實(shí)踐應(yīng)用中，人們發(fā)現(xiàn)自養(yǎng)硝化菌增長速度比較緩慢，對(duì)環(huán)境條件要求嚴(yán)格，其最佳溫度為35～42℃，在低溫時(shí)（尤其是冬季）硝化速率低，硝化過程需要較高的溶解氧濃度（＞3 mg/L），中性偏堿（7.0～8.0）的pH條件以及非常低的C/N值[19]，為了提高硝化速率，往往需要更長的水力停留時(shí)間，這些條件增加了生物脫氮的難度與成本，限制了自養(yǎng)硝化菌的應(yīng)用。

與自養(yǎng)硝化菌相比，異養(yǎng)硝化菌具有生長速度快，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)，近年來受到了國內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注。KILLHAM[20]總結(jié)了以前關(guān)于異養(yǎng)硝化的研究進(jìn)展，指出在某些環(huán)境中，異養(yǎng)菌可以將有機(jī)氮氧化為硝酸鹽氮，而這個(gè)硝化過程是由異養(yǎng)硝化控制的。CASTIGNETTI，et al[21]初次報(bào)道了土壤中常見的反硝化菌能夠產(chǎn)生異養(yǎng)硝化的現(xiàn)象。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明，與自養(yǎng)硝化菌相比，異養(yǎng)硝化菌的數(shù)量和生長速率高，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，能耐受酸性環(huán)境，需要的溶解氧濃度低，活性高，而且許多異養(yǎng)硝化菌如假單胞菌Pseudomonas spp與糞產(chǎn)堿菌Alcaligenes faecalis[22]，具有硝化-反硝化能力[19,23-24]，大大的降低了工程應(yīng)用的成本。將其投加在常規(guī)的廢水中或者應(yīng)用于生物修復(fù)某些特定污染水域，具有重要的價(jià)值和意義。

對(duì)于異養(yǎng)硝化菌的研究起步較晚，將其應(yīng)用于高濃度氨氮廢水處理的研究比較少，能夠?qū)⑵鋺?yīng)用于實(shí)際廢水處理的研究更少。因此，篩選出一株具有較高脫氮能力的異養(yǎng)硝化菌，并將其應(yīng)用到氨氮濃度較高的養(yǎng)殖廢水中，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的廢水處理具有重要的意義。針對(duì)以上問題，本文從土壤中篩選出一株高效異養(yǎng)硝化菌，并將該菌株應(yīng)用于高氨氮濃度的甲魚養(yǎng)殖廢水凈化中，旨在為高氨氮養(yǎng)殖廢水的生物脫氮處理提供一種有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

農(nóng)田土壤中有機(jī)質(zhì)和氮元素的含量較為豐富，符合異養(yǎng)硝化菌對(duì)于環(huán)境的要求，在本實(shí)驗(yàn)中菌株分離自農(nóng)田土壤，土壤樣品取自浙江省舟山市長峙島馬鞍村。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集馴化培養(yǎng)基：（NH4）2SO42.0 g，丁二酸鈉23.85 g，維氏鹽溶液50 mL（維氏鹽溶液組成：K2HPO45.0 g/L；MgSO4·7H2O 2.5 g/L；NaCl 2.5 g/L；FeSO4·7H2O 0.05 g/L；MnSO4·4H2O 0.05 g/L），加水進(jìn)行溶解，補(bǔ)充蒸餾水至1 L；固體培養(yǎng)基：瓊脂粉20 g，其他成分同馴化培養(yǎng)基。異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基：同馴化培養(yǎng)基。各培養(yǎng)基在高壓滅菌鍋中滅菌后使用。

1.2 高效異養(yǎng)硝化菌株的分離純化

1.2.1 異養(yǎng)硝化菌的馴化、富集

取1 g的土樣放入盛有200 mL馴化培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，30°C，180 r/min條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)，馴化以3 d為一個(gè)周期。每一周期結(jié)束后將培養(yǎng)液靜置片刻，取部分菌液至另外一個(gè)錐形瓶中，將新鮮的馴化培養(yǎng)基加入原來的培養(yǎng)液中，補(bǔ)足至200 mL。取出的菌液按馴化的周期依次從50 mL降至10 mL，補(bǔ)充的培養(yǎng)基也從開始150 mL升至190 mL，定期檢測氨氮去除情況。當(dāng)將氨試劑滴加在馴化的菌液后，呈現(xiàn)無色時(shí)，表示馴化完成。

1.2.2 菌株的分離純化

將馴化好的溶液進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋至10-5。在制備好的固體培養(yǎng)基上，從各個(gè)稀釋梯度溶液中取0.1 mL進(jìn)行稀釋涂布（每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行），在生化培養(yǎng)箱中30°C恒溫培養(yǎng)3 d。在形成菌落的平板上挑取圓形規(guī)則的單個(gè)菌落，劃線分離，等到形成菌落后再用接種環(huán)將其接種到固體培養(yǎng)基上，放在30°C生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)3 d。然后挑取一接種環(huán)的細(xì)菌與無菌水中，充分震蕩，以此為細(xì)菌懸液。將細(xì)菌懸液按照活菌數(shù)測定的辦法在平板上涂布，使其在培養(yǎng)皿上形成20～30個(gè)單菌落，然后將單菌落按以上的方法再挑菌一次[25]。經(jīng)分離純化得到15株菌。

1.2.3 高效異養(yǎng)硝化菌篩選

將篩選得到的15株菌分別接入已滅菌的裝有100 mL異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基的錐形瓶中，30°C，180 r/min條件下進(jìn)行恒溫?fù)u床培養(yǎng)。3 d后檢測OD600、pH、氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮。選出一株脫氮效率高且培養(yǎng)過程中亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮生成較少的菌株。

1.3 菌株的硝化特性研究

在裝有200 mL培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶（已滅菌）中接入菌株，30°C，180 r/min條件下進(jìn)行恒溫?fù)u床培養(yǎng)。每隔12 h檢測異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中的OD600、pH、氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮，制作菌株生長曲線和脫氮速率曲線。

1.4 異養(yǎng)硝化菌株對(duì)養(yǎng)殖廢水的脫氮效果

1.4.1 養(yǎng)殖廢水

養(yǎng)殖廢水取自浙江省桐廬溫室大棚甲魚養(yǎng)殖基地，水體有惡臭味，呈暗黃色，有黑色沉淀物。養(yǎng)殖廢水水質(zhì)指標(biāo)見表1。

表1 養(yǎng)殖廢水水質(zhì)指標(biāo)Tab.1 Characteristics of aquaculture wastewater

1.4.2 菌株在養(yǎng)殖廢水中的異養(yǎng)硝化作用研究

將在250 mL錐形瓶中裝有200 mL的養(yǎng)殖廢水滅菌后接入菌株，30℃，180 r/min條件下進(jìn)行恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每隔24 h檢測氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮的濃度。在250 mL的錐形瓶中加入200 mL養(yǎng)殖廢水，滅菌，不接種菌株，以此為對(duì)照試驗(yàn)。

1.4.3 接種量對(duì)養(yǎng)殖廢水氨氮去除效果的影響

將菌株的細(xì)菌懸液OD600調(diào)至1.0，接種至6個(gè)裝有200 mL養(yǎng)殖廢水的250 mL錐形瓶中，接種的體積分別占廢水體積的1%、3%、5%、7%、9%和11%。在30℃，180 r/min條件下進(jìn)行恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每隔24 h檢測氨氮濃度。

1.4.4 溫度對(duì)養(yǎng)殖廢水氨氮去除效果的影響

將菌株接種于已滅菌過的裝有200 mL養(yǎng)殖廢水的250 mL的錐形瓶中，分別在不同溫度（10、20、30、35、40℃）下以180 r/min進(jìn)行恒溫?fù)u床培養(yǎng)。每隔24 h檢測檢測氨氮濃度。

1.5 分析方法

NH4+-N：納氏試劑光度法；NO3--N：酚二磺酸光度法；NO2--N：（1-萘基）-乙二胺光度法；NO3--N：紫外分光光度法；菌體生長密度的測定采用濁度法（OD600）；TN：堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法；COD：重鉻酸鉀法。異養(yǎng)硝化菌胞內(nèi)氮：凱氏定氮法，pH值直接采用pH計(jì)測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化和篩選

經(jīng)過約4個(gè)月的馴化、富集和3輪劃線分離，得到能夠在異養(yǎng)硝化固體培養(yǎng)基上生長的15株菌株。將15株菌株依次接入異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基中，以未接種菌株的異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基（原水）為空白對(duì)照，檢測其濁度（OD600）以及NH4+-N、NO2--N和NO3--N的濃度。從圖1中可以看出，15株菌株對(duì)于異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中的氨氮都有一定的降解能力，1號(hào)菌株和13號(hào)菌株生長較為旺盛，13號(hào)菌株的氨氮去除能力最強(qiáng)。并且這15株菌株在培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液中NO2--N和NO3--N的濃度均較低，因此，經(jīng)過對(duì)比分析，將13號(hào)菌株作為本研究的對(duì)象，將其命名為HY13。

2.2 菌株HY13在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中的生長

菌株在培養(yǎng)基中的生長曲線及pH的變化如圖2所示。菌株生長呈現(xiàn)4個(gè)時(shí)期：適應(yīng)期、對(duì)數(shù)增長期、穩(wěn)定期、衰亡期。菌株在12 h之前生長緩慢，可以看作適應(yīng)期。12 h之后進(jìn)入對(duì)數(shù)增長期，在對(duì)數(shù)增長期，菌株HY13生長迅速，之后菌株的生長進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期。另外，從圖2中可以觀察到，隨著菌株的生長，液體培養(yǎng)基的pH值呈上升的趨勢，pH值從培養(yǎng)開始時(shí)的6.95上升至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的9.15。傳統(tǒng)的自養(yǎng)硝化反應(yīng)是將堿性物質(zhì)氨轉(zhuǎn)化為酸性物質(zhì)亞硝酸和硝酸的過程，通常會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)過程pH值的下降。本實(shí)驗(yàn)過程觀察到的pH變化明顯不同于自養(yǎng)硝化過程，間接說明了菌株HY13的異養(yǎng)硝化能力。實(shí)驗(yàn)中pH值升高的原因可能是由于培養(yǎng)基內(nèi)丁二酸鈉被大量利用后Na+濃度升高所致。

2.3 菌株HY13的脫氮特性

菌株在培養(yǎng)基中的氨氮降解速率特征如圖所示。從圖3可以看出，氨氮濃度在12 h之前降解緩慢，12 h之后下降迅速，96 h氨氮濃度降到最低，氨氮降解速率為61.8%，氨氮濃度降低迅速發(fā)生在菌株的對(duì)數(shù)增長期和穩(wěn)定期。另外從圖中可以看出，菌株HY13培養(yǎng)過程中在氨氮濃度不斷降低的同時(shí)，硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮濃度沒有明顯的上升，而是維持在較低的濃度水平，表明菌株HY13去除水中氨氮的過程與傳統(tǒng)自養(yǎng)硝化過程不同，本實(shí)驗(yàn)篩選的菌株HY13具有異養(yǎng)硝化能力。

2.4 菌株HY13在養(yǎng)殖廢水中的硝化特性

將異養(yǎng)硝化菌株HY13接種至高氨氮含量的養(yǎng)殖廢水中進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中養(yǎng)殖廢水中NH4+-N、NO2--N、NO3--N濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的變化如圖4所示。從圖4可以看出，隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，養(yǎng)殖廢水中的NH4+-N濃度出現(xiàn)了明顯的降低，從培養(yǎng)開始時(shí)的634.28 mg/L降低至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的226.13 mg/L，去除率達(dá)到64.3%，說明菌株HY13對(duì)于高濃度的養(yǎng)殖廢水，具有較好的脫氮效果。對(duì)于養(yǎng)殖場廢水處理的實(shí)際應(yīng)用，具有很大的潛能。并且由圖4可見，在整個(gè)培養(yǎng)過程中廢水中NO2--N和NO3--N的濃度穩(wěn)定維持在較低的水平，沒有出現(xiàn)明顯的上升。培養(yǎng)結(jié)束和培養(yǎng)開始時(shí)NO2--N的濃度分別為0.051 mg/L和0.057 mg/L，NO3--N的濃度分別為0.377 mg/L和0.378 mg/L，培養(yǎng)結(jié)束后測定得到培養(yǎng)液中胞內(nèi)氮的濃度為236.73 mg/L（表2）。這表明在培養(yǎng)過程中廢水中的銨鹽沒有被氧化成亞硝酸鹽和硝酸鹽，而是大部分被轉(zhuǎn)化成了菌體內(nèi)的胞內(nèi)氮。這明顯不同于傳統(tǒng)硝化細(xì)菌的硝化反應(yīng)，培養(yǎng)結(jié)束后廢水中的NO2--N和NO3--N濃度均很低，無需在通過反硝化反應(yīng)進(jìn)行脫除?？梢姴捎卯愷B(yǎng)硝化方法進(jìn)行高氨氮含量養(yǎng)殖廢水的脫氮處理，可以使處理工藝變得更為簡單，具有明顯的優(yōu)勢。

圖1 異養(yǎng)硝化菌菌株的篩選Fig.1 Screening of heterotrophic nitrifying bacteria

圖2 菌株HY13的生長曲線以及pH變化Fig.2 Growth curve of strain HY13 and the changes of pH during cultivation

圖3 菌株HY13氨氮降解速率特征曲線Fig.3 Denitrification rate characteristiccurve of the strain HY13

圖4 菌株HY13在養(yǎng)殖廢水中的脫氮速率特征曲線Fig.4 Curves of nitrogen removal of strain HY13 in aquaculture wastewater

表2 菌株HY13的硝化功能Tab.2 Nitrification of strain HY13

2.5 接種量對(duì)養(yǎng)殖廢水氨氮去除效果的影響

接種量的大小會(huì)影響到菌株的繁殖速度。高濃度的接種量可以提高脫氮的效率[28]，在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到比較好的效果。接種量過低，菌株的適應(yīng)期會(huì)延長，培養(yǎng)時(shí)間則會(huì)增加，影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。從圖6可以看出，當(dāng)在養(yǎng)殖廢水中接入不同濃度的菌株時(shí)，經(jīng)過24 h的培養(yǎng)，氨氮濃度都有不同程度的降解，接種量為5%的降解量最多。經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)在相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，適當(dāng)?shù)脑黾咏臃N量，會(huì)提高氨氮的轉(zhuǎn)化率。當(dāng)接種量為5%時(shí)，菌株對(duì)養(yǎng)殖廢水的氨氮去除效果最好。當(dāng)接種量大于5%時(shí)，菌株對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的需求增加，但是養(yǎng)殖廢水的底物和營養(yǎng)物質(zhì)有限，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，底物與供氧不足，使菌株HY13大量死亡，氨氮降解率降低。

2.6 溫度對(duì)養(yǎng)殖廢水氨氮去除效果的影響

對(duì)于微生物的生長來說，溫度是一個(gè)重要的因素，每個(gè)微生物的最適溫度不同。過高或者過低的溫度都會(huì)影響菌株的酶活性，導(dǎo)致微生物的生長代謝緩慢或者停滯，從而影響對(duì)氨氮的去除能力[29-31]。養(yǎng)殖水體溫度季節(jié)變化幅度較大，要找到菌株HY13在養(yǎng)殖廢水中適應(yīng)生長的溫度，一般通過設(shè)置溫度梯度來判斷。從圖7可以看出，菌株HY13在不同的溫度條件下對(duì)養(yǎng)殖廢水的氨氮都有一定的去除能力，進(jìn)一步說明異養(yǎng)硝化菌對(duì)環(huán)境的要求不高，能夠應(yīng)用于各種環(huán)境。當(dāng)溫度為10℃時(shí)，菌株HY13對(duì)養(yǎng)殖廢水的氨氮去除能力最弱，溫度逐漸升高，氨氮去除能力逐漸提高。當(dāng)溫度為35℃時(shí)，菌株對(duì)養(yǎng)殖廢水氨氮去除效果最好。當(dāng)溫度高于35℃時(shí)，菌株的氨氮降解能力又變?nèi)?。?shí)驗(yàn)證明，過高或過低的溫度都不適宜菌株HY13的生長。

圖6 接種量對(duì)菌株去除養(yǎng)殖廢水中氨氮的影響Fig.6 Influence of inoculation amount of HY13 on ammonia nitrogen removal from aquaculture wastewater

圖7 溫度對(duì)菌株氨氮去除特性的影響Fig.7 Influence of temperature on ammonia nitrogen removal from aquaculture wastewater by HY13

3 討論

本實(shí)驗(yàn)篩選的菌株HY13接種于高氨氮濃度的水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水，實(shí)現(xiàn)了對(duì)廢水中氨氮的異養(yǎng)硝化脫除，經(jīng)216 h培養(yǎng)，去除率達(dá)到64.3%。并且出水中NO2--N和NO3--N的濃度均很低。氨、亞硝酸鹽和硝酸鹽均為廢水中的氮素污染物，在水體中三者還能互相轉(zhuǎn)化。傳統(tǒng)的生物硝化反應(yīng)僅將氨氧化為硝酸鹽或亞硝酸鹽，往往還需要后續(xù)在厭氧環(huán)境及有機(jī)物存在的情況下進(jìn)行反硝化反應(yīng)才能徹底去除廢水中的氮素污染物，達(dá)到真正脫氮的目的。本實(shí)驗(yàn)中HY13未將氨氧化為亞硝酸鹽或硝酸鹽，根據(jù)實(shí)驗(yàn)中菌株胞內(nèi)氮含量的測定，大部分被去除的氨轉(zhuǎn)化為了菌株細(xì)胞體內(nèi)的氮。在實(shí)際的污水處理過程中，這部分的氮將轉(zhuǎn)移至剩余污泥中，從而提高了剩余污泥中氮的含量及肥效，有利于通過堆肥等過程將養(yǎng)殖場廢水處理產(chǎn)生的污泥開發(fā)成作物肥料。

另外，值得注意的是本實(shí)驗(yàn)經(jīng)菌株HY13處理后，養(yǎng)殖廢水中NH4+-N的含量仍然達(dá)到200 mg/L以上，這主要與原水中NH4+-N濃度較高有關(guān)。在之前文獻(xiàn)中的一些關(guān)于異養(yǎng)硝化菌的研究中，培養(yǎng)液中NH4+-N濃度約在90～180 mg/L[23,32]，均低于本實(shí)驗(yàn)所用廢水中的NH4+-N濃度。廢水中較高的NH4+-N濃度或許對(duì)異養(yǎng)硝化菌的生長起到了一定的抑制作用，這方面有待于后續(xù)的進(jìn)一步研究。

本研究通過異養(yǎng)硝化菌篩選及廢水處理實(shí)驗(yàn)，初步證明了異養(yǎng)硝化菌能有效應(yīng)用于高氨氮濃度的水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的脫氮處理，但由于實(shí)驗(yàn)中采用的甲魚養(yǎng)殖場廢水中氨氮濃度較高，實(shí)驗(yàn)中未能將廢水中的氨氮降低至排放標(biāo)準(zhǔn)以下，這有待于后續(xù)通過進(jìn)一步改進(jìn)培養(yǎng)及研究方案，從而實(shí)現(xiàn)廢水中氨氮較徹底的去除。

4 結(jié)論

（1）本文以丁二酸鈉為唯一碳源，從土壤中篩選出一株能夠高效去除氨氮的菌株，并且在培養(yǎng)過程中只有少量的硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮產(chǎn)生，命名為HY13。

（2）將菌株接種與初始氨氮濃度為634.28 mg/L的甲魚養(yǎng)殖廢水中，經(jīng)過216 h培養(yǎng)，氨氮濃度降為226.13 mg/L，氨氮降解率達(dá)到64.3%。

（3）養(yǎng)殖水體中，生態(tài)因子如溫度、接種量等都會(huì)對(duì)水體氨氮的降解產(chǎn)生一定的影響。實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)菌株HY13接種于養(yǎng)殖廢水中，接種量為5%，溫度為35℃時(shí)，氨氮降解率較高。

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