檢測(cè)方法精密度的表達(dá)與確定—以HPLC-MS檢測(cè)海洋沉積物中六溴環(huán)十二烷方法為例

冉麗紅，郭遠(yuǎn)明，孫秀梅，張 帥，陳雪昌

（浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021）

六溴環(huán)十二烷（HBCD）是一種高溴含量的脂環(huán)族添加阻燃劑，HBCD還被認(rèn)定是一種持久性有機(jī)污染物[1]。具有持久性、遷移性、生物蓄積性、并且可導(dǎo)致血清激素濃度下降，抑制神經(jīng)遞質(zhì)正常吸收、引起肝組織病理學(xué)改變、且具有致畸、致癌潛力[2-3]。也因此HBCD受到國際社會(huì)的廣泛關(guān)注[4]，被斯德哥爾摩公約列為POPs之一，在海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)和海洋生物體質(zhì)量檢測(cè)中也越來越受到關(guān)注[5]。目前對(duì)國內(nèi)海洋環(huán)境和生物體中HBCD的測(cè)定方法有很多種，也有多種評(píng)價(jià)檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)。但是尚未見到用重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差、再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差、重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差、再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差指標(biāo)來評(píng)價(jià)相關(guān)檢測(cè)方法的文章。因此用這些指標(biāo)評(píng)價(jià)檢測(cè)方法精密度有很重要的意義。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 檢測(cè)方法

海洋環(huán)境中HBCD的檢測(cè)方法的開發(fā)對(duì)大洋、近海、河口及咸淡混合水域海洋沉積物中六溴環(huán)十二烷的測(cè)定具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)海洋沉積物中的HBCD進(jìn)行測(cè)定。海洋沉積物中的六溴環(huán)十二烷經(jīng)正己烷提取后，旋蒸濃縮經(jīng)硅膠固相萃取柱凈化，氮?dú)獯蹈捎眉状级ㄈ荩ㄟ^高效液相色譜柱分離，以甲醇、乙腈和水為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD的含量，內(nèi)標(biāo)法定量。除有特殊說明外，試驗(yàn)所用試劑均為分析純。所用儀器設(shè)備有高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀，色譜柱（C18柱100 mm×2.1 mm，1.7 μm），或者其他性能相當(dāng)?shù)纳V柱。硅膠固相萃取柱：6 mL，含1 000 mg硅膠等。沉積物樣品的采集、預(yù)處理、制備和保存，按GB 17378.3中5的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。實(shí)驗(yàn)步驟按提取、凈化、空白試驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制以及樣品測(cè)定的要求進(jìn)行。試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理按GB 17378.2的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

1.2 精密度測(cè)試方法

制定一個(gè)六溴環(huán)十二烷的檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)，重要的任務(wù)之一就是確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法的精密度。通常情況下精密度是表征隨機(jī)誤差的大小，用標(biāo)準(zhǔn)差表示。但是這種方法多是針對(duì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)進(jìn)行精密度分析時(shí)所使用的。但是更好的評(píng)價(jià)新檢測(cè)方法的精密度，需要通過組織試驗(yàn)室間的協(xié)同試驗(yàn)，用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算并確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法的重復(fù)性限r(nóng)和再現(xiàn)性R與質(zhì)量分?jǐn)?shù)m的函數(shù)關(guān)系，即方法精密度[6]。精密度數(shù)值是測(cè)試方法的質(zhì)量指標(biāo)，是評(píng)價(jià)、選擇測(cè)試方法和制修訂標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)[7]。需要用到重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差、再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差、重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差以及再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差這些指標(biāo)[8]。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)海洋沉積物中的HBCD進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定數(shù)據(jù)來自國家海洋局東海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)中心、舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局、農(nóng)業(yè)部黑龍江流域漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、寧波市漁業(yè)環(huán)境與產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)中心、浙江省舟山海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)站和浙江省海洋水產(chǎn)研究所 7 個(gè)實(shí)驗(yàn)室。測(cè)試濃度有 0.3、0.5、1、2、5、10、20、50 μg/kg，每個(gè)濃度測(cè)定 6 次。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)室原始數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)海洋沉積物中六溴環(huán)十二烷進(jìn)行加標(biāo)回收。對(duì)7個(gè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行收集并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和精密度分析。原始數(shù)據(jù)用表1的格式進(jìn)行表示，以海洋沉積物α-HBCD為例：

表1 海洋沉積物α-HBCD加標(biāo)回收測(cè)得值Tab.1 Marine sediment α-HBCD plus standard recovery measured value μg/kg

2.2 結(jié)果計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法以及正在標(biāo)準(zhǔn)化的測(cè)試方法或某些非標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法，都應(yīng)給出測(cè)試方法的精密度[9]。精密度是評(píng)價(jià)分析方法的一個(gè)重要指標(biāo)，它是指使用同一方法，對(duì)同一樣品進(jìn)行多次測(cè)定所得測(cè)定結(jié)果的一致程度。或者說它表示多次測(cè)量所得測(cè)定結(jié)果的一致程度?；蛘咚硎径啻螠y(cè)量某一量時(shí)的測(cè)定值的離散程度。通常用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來量度分析方法的精密度[10]。采用重復(fù)性限和再現(xiàn)性限來表示方法的精密度[11]。

2.2.1 單元平均值的計(jì)算

單元平均值計(jì)算公式：（yi是檢測(cè)值，n是檢測(cè)值數(shù)）

平均值計(jì)算結(jié)果見表2。

表2 單元平均值Tab.2 Unit average

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)差Sij的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算公式：（yi是檢測(cè)值，n是檢測(cè)值數(shù)yˉ是平均值）

標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算結(jié)果見表3。

表3 單元平均值Tab.3 Unit average

2.2.3 總平均值、重復(fù)性方差Srj和再現(xiàn)性方差SRj的計(jì)算

以上指標(biāo)的計(jì)算公式如下：

計(jì)算結(jié)果見表4。

表4 總平均值、重復(fù)性方差和再現(xiàn)性方差Tab.4 The total average value,the variance of the repeatability and reproducibility of variance

重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差的最小值是0.018；最大值是2.671。

再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差的最小值是0.018；最大值是3.689。

2.2.4 重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算

重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差=Sr/水平j(luò)；

再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差=SR/水平j(luò)；

重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算結(jié)果見表5。

表5 重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.5 Repeatability relative standard deviation and reproducibility relative to standard deviation

重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的最小值是0.019；最大值是0.102。

再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的最小值是0.019；最大值是0.094。

2.3 結(jié)果討論

運(yùn)用重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差、再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差、重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差及再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差是目前最優(yōu)的評(píng)價(jià)方法精密度的方法。對(duì)海洋沉積物中六溴環(huán)十二烷加標(biāo)回收精密度分析，參照以上對(duì)海洋沉積物α-HBCD加標(biāo)回收值進(jìn)行精確度相關(guān)指標(biāo)的計(jì)算，參照國標(biāo)（GBT 6379.2-2004）測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度。對(duì)7個(gè)實(shí)驗(yàn)室的海洋沉積物中α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差、再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差、重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果見表6。

表6 海洋沉積物中六溴環(huán)十二烷測(cè)定結(jié)果相關(guān)指標(biāo)Tab.6 Correlative indicators of determination of hexabromocyclododecane in marine sediments

對(duì)海洋沉積物中六溴環(huán)十二烷測(cè)定結(jié)果分析：

回收率在70%～120%之間，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%。

根據(jù)GB/T 6379.2-2004測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）第2部分：確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法和GB/T 20001.4-2015標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，求得方法精密度和準(zhǔn)確度。海洋沉積物中α-HBCD的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差不大于2.67×10-9，重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于10%；再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差不大于3.68×10-9，再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于9.4%。海洋沉積物中β-HBCD的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差不大于2.25×10-9，重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于4.9%；再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差不大于2.70×10-9，再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于6.3%。海洋沉積物中γ-HBCD的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差不大于2.27×10-9，重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于6.7%；再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差不大于3.00×10-9，再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于6.4%。

根據(jù)GB 17378.2-2007海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第2部分：數(shù)據(jù)處理與分析質(zhì)量控制，得知分析結(jié)果所在數(shù)量級(jí)10-9的相對(duì)偏差容許限為30%[12]。以海洋沉積物中α-HBCD為例：添加量為2 μg/kg時(shí)的相對(duì)偏差容許限為10.8%；添加量為20 μg/kg時(shí)的相對(duì)偏差容許限為9.8%；添加量為50 μg/kg時(shí)的相對(duì)偏差容許限為14.0%；添加量為0.3 μg/kg時(shí)的相對(duì)偏差容許限為6.8%；添加量為1 μg/kg時(shí)的相對(duì)偏差容許限為6.9%；添加量為5μg/kg時(shí)的相對(duì)偏差容許限為3.9%；添加量為0.5 μg/kg時(shí)的相對(duì)偏差容許限為2.4%；添加量為10 μg/kg時(shí)的相對(duì)偏差容許限為2.5%。由計(jì)算結(jié)果可以得知相對(duì)偏差在合理范圍內(nèi)。說明可以運(yùn)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)海洋沉積物中的六溴環(huán)十二烷含量進(jìn)行測(cè)定。而且此方法分離效果好，靈敏度高，能滿足環(huán)境樣品和生物樣品的分析要求。

3 結(jié)論

由以上結(jié)果可以得出，檢測(cè)結(jié)果的精密度的分析對(duì)海洋沉積物中六溴環(huán)十二烷含量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法進(jìn)行了很好的驗(yàn)證。重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差、重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差、再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等指標(biāo)精密度分析，對(duì)于新檢測(cè)方法的驗(yàn)證有很好的實(shí)用性。本計(jì)算方法具有很好的參考價(jià)值。

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