全基因組水平掃描鑒定粗糙脈孢菌糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其在釀酒酵母己糖發(fā)酵中的評(píng)價(jià)

高婧芳，王邦，韓曉云，田朝光

1 黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080

2 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 系統(tǒng)微生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

3 溫州醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院、醫(yī)院 眼視光學(xué)和視覺(jué)科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 衛(wèi)生部視覺(jué)科學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325027

全基因組水平掃描鑒定粗糙脈孢菌糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其在釀酒酵母己糖發(fā)酵中的評(píng)價(jià)

高婧芳1,2，王邦2,3，韓曉云1，田朝光2

1 黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080

2 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 系統(tǒng)微生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

3 溫州醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院、醫(yī)院 眼視光學(xué)和視覺(jué)科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 衛(wèi)生部視覺(jué)科學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325027

木質(zhì)纖維素降解真菌粗糙脈孢菌天然具有吸收利用多種單糖和寡糖的能力，但是目前基因組中注釋的預(yù)測(cè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白仍然有過(guò)半功能未知。本研究從全基因組水平系統(tǒng)分析了粗糙脈孢菌預(yù)測(cè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)底物。研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (NCU01868和 NCU08152) 具有轉(zhuǎn)運(yùn)多種己糖底物的功能，因此分別命名為NcHXT-1和 NcHXT-2。利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù) (FRET) 確認(rèn)了NcHXT-1/-2具有葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能。在己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白全缺釀酒酵母EBY.VW4000中分別過(guò)表達(dá)NcHXT-1/-2，能恢復(fù)其在葡萄糖、半乳糖或甘露糖的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并生成乙醇的能力。NcHXT-1/-2在很多纖維素降解真菌中均具有保守的同源蛋白。本研究通過(guò)全基因組掃描鑒定，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)保守的絲狀真菌己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，為真菌降解利用木質(zhì)纖維素及酵母利用單糖發(fā)酵提供了新的改造靶點(diǎn)。

粗糙脈孢菌，NcHXT-1，NcHXT-2，己糖轉(zhuǎn)運(yùn)

絲狀真菌粗糙脈孢菌Neurospora crassa作為古老的遺傳學(xué)模式生物，又是天然的纖維素快速降解菌[1-2]。粗糙脈孢菌能分泌一系列的木質(zhì)纖維素酶，將高聚化的植物細(xì)胞壁降解為可溶解、易利用的簡(jiǎn)單糖類，如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖以及各種寡糖，包括纖維寡糖 (二糖、三糖等) 和木寡糖[3]。細(xì)胞欲利用這些混合糖，首先必須擁有豐富的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白庫(kù)以吸收這些膜不透性營(yíng)養(yǎng)分子。纖維寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CDT-1、CDT-2的分子功能首次在粗糙脈孢菌中被解析[4]。CDT的同源蛋白在其他絲狀真菌中也陸續(xù)被報(bào)道，包括里氏木霉的Crt-1和草酸青霉的CdtC、CdtD及CdtG[5-6]。這些纖維寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (或感應(yīng)蛋白) 不僅對(duì)于本源宿主菌的纖維素酶表達(dá)調(diào)控具有重要的生理意義[7-8]，而且在纖維素燃料的生產(chǎn)中也有著非常顯著的應(yīng)用價(jià)值[2-9]。粗糙脈孢菌五碳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亦有多個(gè)被報(bào)道，包括An25、XAT-1、XYT-1、LAT-1等[10-12]。然而，粗糙脈孢菌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白目前僅有GLT-1被鑒定[11]，其在木質(zhì)纖維素條件下表達(dá)水平很低[13]。葡萄糖是木質(zhì)纖維素降解混合物中最主要的成分之一，所占比重為30%–40%[13]。粗糙脈孢菌利用纖維素基葡萄糖與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)元件發(fā)揮功能密不可分。

基于序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，粗糙脈孢菌全基因組約有39個(gè)假定糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[11]。除了上文介紹的纖維寡糖、戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及GLT-1，還有少量其他糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被鑒定，包括半乳糖醛酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GAT-1[14]、纖維二糖酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CBT-1/CLP-1[15-16]以及葡萄糖感應(yīng)蛋白R(shí)CO-3[17]。基于己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白全缺釀酒酵母 EBY.VW4000 (下文簡(jiǎn)稱 EBY)的生長(zhǎng)互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，我們測(cè)試了剩余所有預(yù)測(cè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能；發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NcHXT-1 (NCU01868) 和NcHXT-2 (NCU08152)具有轉(zhuǎn)運(yùn)多種己糖的功能。隨后通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)驗(yàn)證了其葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能。在EBY中分別過(guò)表達(dá)NcHXT-1/-2，能夠恢復(fù)EBY酵母細(xì)胞在多種己糖上的生長(zhǎng)并生成乙醇的能力，表明了NcHXT-1/-2具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。NcHXT-1/-2在纖維素降解絲狀真菌中具有較高的保守性，且與釀酒酵母的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顯著不同，其在絲狀真菌降解利用纖維素過(guò)程中的作用值得進(jìn)一步探索。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

粗糙脈孢菌野生型 (FGSC2489) 購(gòu)自國(guó)際真菌遺傳資源保藏中心 (Fungal genetics stock center)。粗糙脈孢菌預(yù)先在Vogel’s鹽[18]加2.0%蔗糖的斜面上28 ℃暗培養(yǎng)1–2 d，隨后放置在恒定光照條件下6–8 d以獲得足夠的孢子。液體培養(yǎng)時(shí)，以 106個(gè)/mL的孢子終濃度接入含有100 mL Vogel’s鹽加 2.0%蔗糖的三角瓶中，25 ℃、200 r/min培養(yǎng)16 h。隨后，用無(wú)菌六層紗布過(guò)濾，并用無(wú)菌水迅速洗滌菌絲 5次，轉(zhuǎn)接入100 mL無(wú)碳源或者2.0%葡萄糖作為碳源的Vogel’s鹽液體培養(yǎng)基，25 ℃、200 r/min誘導(dǎo)處理1 h，抽濾收樣，立即用液氮冷凍，存于–80 ℃，以備RNA提取使用。

釀酒酵母EBY.VW4000菌株[19]來(lái)自于法蘭克福大學(xué)教授Eckhard Boles的饋贈(zèng)。此菌株可在YPM (1.0%酵母提取物、2.0%蛋白胨、2.0%麥芽糖、2.0%瓊脂可選) 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。對(duì)于EBY.VW4000的重組菌，使用含缺少尿嘧啶(Ura-) 的氨基酸混合物 (Drop-out amino acids)的全合成培養(yǎng)基培養(yǎng) (Synthetic complete medium，SC)，以葡萄糖、半乳糖、果糖、山梨糖或麥芽糖作為唯一碳源 (2.0%瓊脂可選)。對(duì)于生長(zhǎng)互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，挑單克隆重組酵母于30 ℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜至菌體 OD600為 0.8–1.5，離心收集菌體 (4 000 r/min，5 min)，用無(wú)菌水洗3次，重懸至 OD600為 0.25–0.30，等梯度稀釋菌夜(100、10–1、10–2)。將等梯度稀釋的酵母點(diǎn)在以2.0%麥芽糖 (或葡萄糖、半乳糖、山梨糖、果糖等) 為唯一碳源的SC (Ura–) 平板中，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d (麥芽糖) 或6 d (其他碳源)，用佳能相機(jī) (Canon EOS207，日本) 拍照記錄。

1.2 RNA提取與cDNA合成

總RNA提取用Trizol試劑 (Invitrogen，美國(guó))，并用DNase Ⅰ(RNeasy Mini kit，Qiagen，德國(guó)) 純化以除去基因組污染。RNA濃度用Nanodrop 2000c (Thermo Scientific，美國(guó)) 測(cè)定，并用瓊脂凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。合格的RNA用以反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄參照ReverTra Ace qPCR RT Kit (TOYOBO，日本)。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

對(duì)于糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建，以粗糙脈孢菌 cDNA 作為模板，以含有 Spe Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)的引物PCR擴(kuò)增獲得目的片段(NCU06026和NCU04310除外，分別用BamH Ⅰ/ Hind Ⅲ和 BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ)。用 Spe Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切的質(zhì)粒 pRS424-GFP[4]作為骨架，連接PCR產(chǎn)物，獲得重組質(zhì)粒，所有克隆均通過(guò)測(cè)序確認(rèn)序列正確。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)質(zhì)粒pDRf1-2μ △13購(gòu)買(mǎi)自Addgene。該質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物——葡萄糖感應(yīng)蛋白的N和C端分別融合了CFP和YFP，當(dāng)感應(yīng)蛋白結(jié)合葡萄糖時(shí)，會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變，使得CFP和YFP相互靠攏，進(jìn)而滿足發(fā)生熒光共振的距離，CFP的熒光激發(fā)YFP產(chǎn)生二次熒光[20-21]?？蛰d質(zhì)粒pDRf1作為實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照。文中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白重組質(zhì)粒 pRS424-NcHXT-1/NcHXT-2/GLT-1與 pDRf1-2μ △13質(zhì)粒共表達(dá)的 EBY.VW4000簡(jiǎn)稱為NcHXT-1/NcHXT-2/GLT-1+pDRf1-2μ △13重組菌。

1.4 顯微拍照

重組釀酒酵母培養(yǎng)過(guò)夜至OD600為0.8–1.5，離心收集菌體并用ddH2O洗一次，重懸于PBS緩沖液中，使用熒光顯微鏡 (OLYMPUS，日本)觀察拍照。

1.5 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 測(cè)試

將連有糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的 pRS424質(zhì)粒和pDRf1-2μ △13質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入釀酒酵母EBY.VW4000中，在含2.0%麥芽糖的SC (Ura–Trp–) 的平板上生長(zhǎng) 2–3 d，挑單克隆到 5 mL麥芽糖 SC (Ura–Trp–) 液體培養(yǎng)基的試管中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。過(guò)夜培養(yǎng)到細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段 (OD600為 0.5–1.0)。用新鮮的缺乏任何碳源的 SC (Ura–Trp–) 培養(yǎng)基洗細(xì)胞兩次，并重懸收獲的細(xì)胞，在30 ℃、220 r/min饑餓培養(yǎng)8 h，即可用于測(cè)試FRET[21]。FRET測(cè)試時(shí)，用MES緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整OD600至0.75，用infinite 200Pro測(cè)量熒光信號(hào)，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)428 nm、發(fā)射波長(zhǎng)460–570 nm (步幅5 nm)。向加180 μL的MES細(xì)胞懸濁液中加入20 μL 100 mmol/L葡萄糖溶液，迅速充分混勻，測(cè)定3個(gè)循環(huán) (每個(gè)循環(huán)約15 min)。對(duì)照是加入20 μL MES緩沖液。CFP和 YFP的熒光信號(hào)分別用最大吸收峰對(duì)應(yīng)的發(fā)射波長(zhǎng)485 nm和525 nm表示[21]。F525nm/ F485nm越大，表示YFP相對(duì)CFP的熒光信號(hào)增強(qiáng)，因此葡萄糖[F525nm/F485nm]/MES[F525nm/F485nm]的比值變化能表示添加葡萄糖前后，因葡萄糖感應(yīng)蛋白結(jié)合葡萄糖而產(chǎn)生的CFP熒光向YFP轉(zhuǎn)移的過(guò)程[21]。

1.6 重組釀酒酵母發(fā)酵

先將NcHXT-1+pDRf1-2μ △13和NcHXT-2+ pDRf1-2μ △13重組菌在麥芽糖 SC (Ura–Trp–)的液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜至 OD600為 0.6–1.0，用無(wú)菌水洗兩次，重懸在一定體積無(wú)菌水中。將重懸的細(xì)胞分別接到含2.0%的葡萄糖、半乳糖或甘露糖的SC (Ura–Trp–) 的液體培養(yǎng)基中，使OD600值約為0.5，放入30 ℃搖床，220 r/min培養(yǎng)。每隔一定時(shí)間取樣一次，測(cè)OD600值，離心，上清用帶有示差檢測(cè)器和Aminex HPX-87H色譜柱 (Bio-Rad，美國(guó)) 的高效液相色譜儀(Waters，英國(guó)) 檢測(cè)培養(yǎng)基殘?zhí)呛鸵掖己俊ＩV柱在45 ℃，5 mmol/L硫酸作為流動(dòng)相，以0.5 mL/min流速工作。

1.7 遺傳進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

以轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列 NcHXT-1和 NcHXT-2 (http://www.broadinstitute.org/annotation/genome /neurospora/MultiHome.html) 進(jìn)行 BLASTp搜索，比對(duì)來(lái)自NCBI或JGI的物種的全基因組蛋白序列：Aspergillus nidulans，Aspergillus niger，Aspergillus oryzae，F(xiàn)usarium graminearum，Penicillium oxalicum，Trichoderma reesei，Talaromyces marneffei ， Myceliophthora thermophile。每個(gè)得分最高且具有 identity > 40%、E-value < 1E-10、coverage > 60%的靶標(biāo)序列，則被視為同源性較高的候選蛋白。取釀酒酵母的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為 out-group。將以上所有蛋白序列用 ClustalW[22]進(jìn)行多序列比對(duì)。然后用MEGA 5.2[23]以最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，并做1 000次自舉檢驗(yàn)。

1.8 數(shù)據(jù)作圖與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)作圖使用微軟辦公軟件Excel 2013。除特別標(biāo)注，文中所有顯著性統(tǒng)計(jì)分析采用雙尾Student’s t-test。*表示P < 0.05，**表示P < 0.01。

2 結(jié)果

2.1 粗糙脈孢菌假定糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白克隆

通過(guò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)粗糙脈孢菌全基因組共有 39個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[11]，除文獻(xiàn)報(bào)道外，仍然有21個(gè)功能未知 (圖1)。依據(jù)這21個(gè)候選轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在葡萄糖及無(wú)碳源條件下的表達(dá)水平 (圖 1)，我們使用cDNA模板成功克隆了其中17個(gè)基因的開(kāi)放閱讀框 (圖1，其中NCU06358和NCU07861通過(guò) cDNA模板擴(kuò)增，沒(méi)有獲得陽(yáng)性條帶；NCU07054和NCU08180幾乎不表達(dá))。

2.2 釀酒酵母 EBY.VW4000重組菌株的表型分析

釀酒酵母 EBY.VW4000 (下文簡(jiǎn)稱 EBY)缺失了所有的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因此不能在以己糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)[19]。如果某轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有己糖轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，那么過(guò)表達(dá)該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠恢復(fù)EBY.VW4000在己糖上的生長(zhǎng)能力?；诖朔椒?，我們一一測(cè)試了克隆成功的17個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。結(jié)果表明，兩個(gè)假定糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (NCU01868和 NCU08152) 能回補(bǔ)EBY.VW4000在葡萄糖或半乳糖上的生長(zhǎng)缺陷(圖2)。

圖1 21個(gè)預(yù)測(cè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在2.0%葡萄糖和無(wú)碳源條件下的表達(dá)值Fig. 1 Expression levels of 21 predicted sugar transporters on 2.0% glucose and carbon-free conditions. RPKM: reads per kilobase per million mapped reads.

圖2 17個(gè)預(yù)測(cè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的EBY.VW4000重組菌株在葡萄糖和半乳糖上的表型分析Fig. 2 Complementary growth of EBY.VW4000 harboring one of 17 predicted sugar transporters on glucose and galactose. The glucose transporter GLT-1 represents a positive control.

我們進(jìn)一步測(cè)試了含有這兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的EBY重組菌在其他碳源上的生長(zhǎng)能力，包括果糖、甘露糖、山梨糖。結(jié)果表明，重組菌株在這些糖上均能生長(zhǎng) (圖 3A)，表明 NCU01868和NCU08152能轉(zhuǎn)運(yùn)各種己糖底物。同時(shí)，融合GFP熒光定位顯示兩者均能定位到細(xì)胞膜上，說(shuō)明兩者是質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (圖 3B)。因此，我們將NCU01868和NCU08152分別命名為NcHXT-1/-2 (Neurospora c rassa HeXose Transporter 1/2)。

2.3 利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)評(píng)價(jià)NcHXT-1/-2的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能

基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的葡萄糖感應(yīng)蛋白，能夠?qū)崟r(shí)、靈敏地檢測(cè)葡萄糖的吸收[24]。利用此技術(shù)，我們將 pDRf1-2μ △13質(zhì)粒分別與 pRS424-NcHXT-1/NcHXT-2共轉(zhuǎn)化到EBY.VW4000中以驗(yàn)證NcHXT-1/-2的轉(zhuǎn)運(yùn)功能(圖 4A)。測(cè)試結(jié)果表明，當(dāng)向培養(yǎng)基中添加葡萄糖時(shí)，在表達(dá)有NcHXT-1/-2的細(xì)胞中，葡萄糖[F525nm/F485nm]/ MES[F525nm/F485nm]比值顯著增大 (圖4B)，其中485 nm是CFP的最大發(fā)射波長(zhǎng)，525 nm是YFP的最大發(fā)射波長(zhǎng)，表明胞內(nèi)發(fā)生了CFP熒光能量向YFP熒光的轉(zhuǎn)移。以上實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了 NcHXT-1/-2具有葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

圖3 NcHXT-1/-2 EBY.VW4000重組菌株在多種己糖底物上的表型分析及其亞細(xì)胞定位Fig. 3 Complementary growth of EBY.VW4000 harboring NcHXT-1/-2 on multiple hexose sources (A) and its subcellular localization (B). The glucose transporter GLT-1 represents a positive control, EBY.VW.4000 as a negative control.

圖4 基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)檢測(cè)NcHXT-1/-2的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能Fig. 4 Fluorescence resonance energy transfer analysis of NcHXT-1/-2. (A) The CFP and YFP of pDRf1-2μ △13 were successfully detected in recombinant EBY.VW4000. (B) [F525nm/F485nm]/MES[F525nm/F485nm] of recombinant EBY.VW4000 strain harboring various sugar transporter, using the EBY.VW4000 as the control.

2.4 過(guò)表達(dá)NcHXT-1/-2酵母的發(fā)酵測(cè)試

圖5 NcHXT-1 EBY重組菌株在葡萄糖 (A)、半乳糖 (B) 和甘露糖 (C) 條件下的液體培養(yǎng)和發(fā)酵Fig. 5 Submerged growth and fermentation of EBY strain harboring NcHXT-1 on glucose (A), galactose (B) and mannose (C).

圖6 NcHXT-2 EBY重組菌株在葡萄糖 (A)、半乳糖 (B) 和甘露糖 (C) 條件下的液體培養(yǎng)和發(fā)酵Fig. 6 Submerged growth and fermentation of EBY strain harboring NcHXT-2 on glucose e (A), galactose (B) and mannose (C).

我們分別進(jìn)一步測(cè)試了過(guò)表達(dá)NcHXT-1/-2的EBY重組菌株在葡萄糖、半乳糖、甘露糖中的糖消耗及發(fā)酵能力。兩個(gè)己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均能支持EBY在3種單糖中的生長(zhǎng) (圖5和圖6)，與平板生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合 (圖 3A)。過(guò)表達(dá)NcHXT-1的EBY酵母在3種己糖上的生物量積累很相似；但是糖消耗速率方面，葡萄糖>甘露糖>半乳糖，尤其是半乳糖顯著慢于其他兩者(圖5)。同時(shí)，在半乳糖上，產(chǎn)乙醇更慢且更易被當(dāng)作碳源利用 (圖 5)。過(guò)表達(dá) NcHXT-2的EBY酵母在葡萄糖上生長(zhǎng)反而最差，糖消耗方面的快慢順序?yàn)椋焊事短?半乳糖>葡萄糖 (圖6)，表明 NcHXT-2更加偏好轉(zhuǎn)運(yùn)甘露糖。過(guò)表達(dá)NcHXT-2的菌株在各種己糖條件下生產(chǎn)乙醇最高產(chǎn)量均沒(méi)有過(guò)表達(dá)NcHXT-1在相應(yīng)己糖底物上高 (圖 5和圖 6)，表明在釀酒酵母中，NcHXT-1比 NcHXT-2具有更高的乙醇發(fā)酵的應(yīng)用潛力。有趣的一點(diǎn)是，在半乳糖和甘露糖上，含有NcHXT-2比含有NcHXT-1的重組菌具有更高的菌體生長(zhǎng)濃度 (5B、5C、6B、6C)，推測(cè)被 NcHXT-2轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞內(nèi)的己糖，碳分流并沒(méi)有過(guò)多地用于生成乙醇，而是用于合成細(xì)胞。

2.5 NcHXT-1/-2的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

粗糙脈孢菌己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NcHXT-1/-2在許多絲狀真菌中具有較高的保守性，這些絲狀真菌包括曲霉、里氏木霉、草酸青霉、嗜熱毀絲霉以及病原菌鐮刀菌、黃色霉菌等 (圖 7)。NcHXT-2的同源蛋白之間比NcHXT-1的同源蛋白之間更加保守，但是兩個(gè)同源家族之間的親緣關(guān)系并不近 (圖7)。NcHXT-1/-2的同源蛋白與釀酒酵母的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相似性較低，表明絲狀真菌己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族進(jìn)化的多樣性。

圖7 NcHXT-1/-2的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析Fig. 7 Maximum likelihood phylogenetic analysis of fungal orthologs of NcHXT-1/-2.

3 討論

由于粗糙脈孢菌天然具有降解利用木質(zhì)纖維素的能力，并擁有豐富的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因庫(kù)[11]。因此本研究在全基因組范圍內(nèi)搜索了纖維素降解絲狀真菌粗糙脈孢菌的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，發(fā)現(xiàn)并功能表征了兩個(gè)新的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 NcHXT-1和NcHXT-2。NcHXT-1/-2與釀酒酵母己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列相似度很低 (圖 7)，推測(cè)粗糙脈孢菌與釀酒酵母腐生環(huán)境的差別，導(dǎo)致了前者多樣的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白庫(kù)[25]。NcHXT-1/-2均能夠支持己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白全缺失酵母EBY.VW4000在葡萄糖、半乳糖及甘露糖上發(fā)酵產(chǎn)乙醇 (圖5 A-C和圖6 A-C)，預(yù)示NcHXT-1/-2具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。特別值得注意的是，過(guò)表達(dá)NcHXT-2的EBY重組菌株利用甘露糖比葡萄糖、半乳糖顯著更快，且利用徹底 (圖6)，表明NcHXT-2對(duì)甘露糖的親和力較后兩者更高，這在混合糖的選擇利用方面有一定的應(yīng)用價(jià)值[26]。

糖轉(zhuǎn)運(yùn)是纖維素真菌利用木質(zhì)纖維素降解產(chǎn)物的第一步。糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不僅是真菌細(xì)胞吸收外界可溶糖的關(guān)鍵元件，同時(shí)在纖維素酶表達(dá)調(diào)控中起著重要作用[5,7,16]。盡管NcHXT-2在纖維素或葡萄糖條件下的表達(dá)水平都不高 (圖 1)，我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲除NcHXT-2能夠影響粗糙脈孢菌的纖維素酶產(chǎn)量，表明NcHXT-2在纖維素酶表達(dá)中發(fā)揮著某種調(diào)控作用。NcHXT-1/-2的同源蛋白在很多纖維素降解絲狀真菌中均存在，包括曲霉、里氏木霉、草酸青霉、嗜熱毀絲霉等，NcHXT-1/-2對(duì)于這些絲狀真菌調(diào)控纖維素酶表達(dá)、利用木質(zhì)纖維素產(chǎn)物有怎樣的作用值得進(jìn)一步探索。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Genome-wide screening of predicted sugar transporters in Neurospora crassa and the application in hexose fermentation by Saccharomyces cerevisiae

Jingfang Gao1,2, Bang Wang2,3, Xiaoyun Han1, and Chaoguang Tian2

1 College of Life Science, Heilongjiang University, Harbin 150080, Heilongjiang, China
2 Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China
3 School of Ophthalmology and Optometry, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, State Key Laboratory Cultivation Base and Key Laboratory of Vision Science, Ministry of Health and Zhejiang Provincial Key Laboratory of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou 325027, Zhejiang, China

The lignocellulolytic filamentous fungus Neurospora crassa is able to assimilate various mono- and oligo-saccharides. However, more than half of predicted sugar transporters in the genome are still waiting for functional elucidation. In this study, system analysis of substrate spectra of predicted sugar transporters in N. crassa was performed at genome-wide level. NCU01868 and NCU08152 have the capability of uptaking various hexose, which are named as NcHXT-1 and NcHXT-2 respectively. Their transport activities for glucose were further confirmed by fluorescence resonance energy transfer analysis. Over-expression of either NcHXT-1 or NcHXT-2 in the null-hexose-transporter yeast EBY.VW4000 restored the growth and ethanol fermentation under submerged fermentation with glucose, galactose, or mannose as the sole carbon source. NcHXT-1/-2 homologues were found in a variety of cellulolytic fungi. Functional identification of two filamentous fungal-conserved hexose transporters NcHXT-1/-2 via genome scanning would represent novel targets for ongoing efforts in engineering cellulolytic fungi and hexose fermentation in yeast.

Neurospora crassa, NcHXT-1, NcHXT-2, hexose transport

10.13345/j.cjb.160290

Received: July 29, 2016; Accepted: September 26, 2016

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31670042), Key Project of Tianjin (No. 11ZCZDSY08900) Corresponding authors: Xiaoyun Han. E-mail: zbjnefu@126.com

Chaoguang Tian. Tel: +86-22-84861947; Fax: +86-22-84861948; E-mail: tian_cg@tib.cas.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31670042)，天津?qū)ｍ?xiàng)(No. 11ZCZDSY08900)資助。

時(shí)間：2016-09-29

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160929.1013.001.html

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