微生物輔因子平衡的代謝調(diào)控

陳修來，劉佳，羅秋玲，劉立明

1 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

3 江南大學(xué) 食品微生物制造工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

微生物輔因子平衡的代謝調(diào)控

陳修來1,2,3，劉佳1,2,3，羅秋玲1,2,3，劉立明1,2,3

1 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

3 江南大學(xué) 食品微生物制造工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

輔因子平衡對(duì)于酶制劑、藥品和化學(xué)品的生產(chǎn)具有重要的作用。為了滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求，維持輔因子長期有效的平衡是實(shí)現(xiàn)代謝流高效化導(dǎo)向目標(biāo)代謝產(chǎn)物的必要手段。本文在總結(jié)輔因子生理功能的基礎(chǔ)上，從生化工程和代謝工程兩方面分析歸納了輔因子的代謝調(diào)控策略，并展望了輔因子進(jìn)一步精深調(diào)控的發(fā)展方向。

輔因子，NADH，代謝工程，合成生物學(xué)，調(diào)控策略

廣義的輔因子平衡是指借助生化工程或代謝工程的相關(guān)技術(shù)策略，實(shí)現(xiàn)輔因子的轉(zhuǎn)變速率與細(xì)胞生理功能及目標(biāo)代謝物合成速率的平衡。狹義的輔因子平衡是指在細(xì)胞代謝過程中輔因子對(duì)被氧化的速率與被還原的速率之間的平衡。輔因子NADH/NAD+、NADPH/NADP+、ATP/ADP等是微生物細(xì)胞內(nèi)重要的代謝因子，作為底物或產(chǎn)物參與生物化學(xué)反應(yīng)，通過輔因子的再生和競(jìng)爭(zhēng)性利用，影響代謝網(wǎng)絡(luò)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而影響微生物細(xì)胞的生理功能。

控制胞內(nèi)輔因子平衡是維持細(xì)胞正常代謝的一項(xiàng)基本需求[1]。輔因子對(duì) NADH/NAD+和NADPH/NADP+作為細(xì)胞代謝中最重要的氧化還原載體，不僅作為催化底物分解代謝的電子受體，也為能量依賴型的氧化還原反應(yīng)提供還原力[2]。因此，NADH/NAD+和NADPH/NADP+的氧化與還原速率平衡是維持正常合成代謝與分解代謝平衡的必然需求[2]。目前，已經(jīng)有許多的實(shí)例證明了胞內(nèi)輔因子平衡對(duì)細(xì)胞代謝的必要性。在丙醇的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，通過在微生物胞內(nèi)表達(dá) Transenoyl-CoA還原酶，能夠有效地將胞內(nèi)積累的NADH轉(zhuǎn)化為介導(dǎo)丙醇合成的催動(dòng)力[3]。為了改善木糖發(fā)酵，通過表達(dá) NADP+依賴型的甘油醛-3-磷酸脫氫酶，能夠有效增加NADPH通道，創(chuàng)造一個(gè)更加良好的輔因子平衡[4]。

為了在輔因子層面上深入調(diào)控碳代謝流，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)碳代謝流的高效調(diào)節(jié)，科研人員提出了輔因子工程，即采用分子生物學(xué)的手段，改造細(xì)胞內(nèi)輔因子的再生途徑，調(diào)控微生物細(xì)胞內(nèi)輔因子的形式和濃度，定向改變和優(yōu)化微生物細(xì)胞代謝功能，實(shí)現(xiàn)代謝流最大化、快速化地導(dǎo)向目標(biāo)代謝產(chǎn)物[5]。然而，傳統(tǒng)的輔因子工程策略已經(jīng)無法滿足現(xiàn)實(shí)需求，也不能有效闡明由于胞內(nèi)輔因子不平衡而導(dǎo)致的一系列復(fù)雜的生理學(xué)現(xiàn)象。因此，本綜述在深入分析輔因子生理功能的基礎(chǔ)上，從生化工程和代謝工程兩個(gè)方面詳細(xì)論述了輔因子調(diào)控相關(guān)的現(xiàn)代生物技術(shù)，并展望了輔因子進(jìn)一步精深調(diào)控的發(fā)展方向。

1 輔因子的生理功能

輔因子為生物合成與分解反應(yīng)提供氧化還原載體，是細(xì)胞內(nèi)能量傳遞的重要原料因子[6]。換句話說，輔因子在生物化學(xué)反應(yīng)中具有重要的作用，合理控制輔因子水平有利于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)代謝物的高效生產(chǎn)[7]。根據(jù) BRENDA數(shù)據(jù)庫(http://www.brenda-enzymes.org/) 的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，輔因子NADH/NAD+、NADPH/NADP+、ATP/ADP依賴型代謝反應(yīng)的相關(guān)酶總計(jì)1 610個(gè)，主要涉及到氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶和連接酶。

對(duì)于輔因子NADH/NAD+和NADPH/NADP+，維持輔因子平衡是首要功能。其次是產(chǎn)生ATP，參與構(gòu)成細(xì)胞骨架系統(tǒng)。NADH/NAD+依賴型相關(guān)酶總計(jì)524個(gè) (圖1A)，包括：NADH依賴型3個(gè)、NADH/NAD+共依賴型505個(gè)和NAD+依賴型16個(gè) (圖1B)。另外，NADPH/NADP+依賴型相關(guān)酶總計(jì)582個(gè) (圖1A)，包括：NADPH依賴型3個(gè)、NADPH/NADP+共依賴型575個(gè)和NADP+依賴型 4個(gè) (圖 1B)。NADH/NAD+和NADPH/NADP+依賴型相關(guān)酶主要集中于氧化還原酶 (圖1A)，一方面作為NADH和NADPH的供體，另一方面以輔因子依賴型分子作為受體氧化金屬離子。

對(duì)于源于底物水平磷酸化和氧化磷酸化的輔因子 ATP/ADP，能夠以底物、產(chǎn)物、激活劑和抑制劑等多種方式進(jìn)入微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)，從而控制細(xì)胞的生理功能，參與構(gòu)成細(xì)胞骨架系統(tǒng)[8]。ATP/ADP依賴型相關(guān)酶總計(jì) 504個(gè)(圖1A)，包括：ATP依賴型125個(gè)、ATP/ADP共依賴型361個(gè)和ADP依賴型18個(gè) (圖1B)。ATP/ADP依賴型相關(guān)酶主要集中于轉(zhuǎn)移酶、水解酶和連接酶 (圖1B)。轉(zhuǎn)移酶主要用于轉(zhuǎn)移一碳基團(tuán)、含磷基團(tuán)，如：?；D(zhuǎn)移酶、糖基轉(zhuǎn)移酶等。水解酶主要用于水解酯鍵、碳氮鍵，而不作用于肽鍵、酸酐。連接酶主要用于形成碳氧鍵、碳硫鍵、碳氮鍵、碳碳鍵、磷酯鍵和氮金屬鍵。

上述微生物輔因子參與的代謝反應(yīng)表明，輔因子是大量生物化學(xué)反應(yīng)的必需因子，能夠顯著影響胞內(nèi)的輔因子平衡。同時(shí)，也賦予了輔因子一系列的生理功能，包括：控制能量代謝[9]、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原態(tài)、控制碳代謝流、改善線粒體的功能與活性[10]、控制細(xì)胞的生命周期[11]和控制細(xì)胞的毒性[12]等。

2 基于生化工程的輔因子平衡調(diào)控

微生物胞內(nèi)氧化還原態(tài)可以通過 2個(gè)方面得以改善 (圖 2)：一方面，提供能夠作為電子受體或 NAD+前體的復(fù)合物，如底物氧化還原態(tài)、共底物等；另一方面，改變培養(yǎng)條件，如碳源、溶氧、溫度、氧化還原電位等。因此，輔因子平衡的生化工程調(diào)控策略，通常能夠控制不同氧化還原態(tài)之間的轉(zhuǎn)換，從而改善微生物對(duì)發(fā)酵條件的適應(yīng)能力。

圖1 輔因子依賴型酶的分類與數(shù)量Fig. 1 The classification and quantity of different cofactor-dependent enzymes. (A) The classification of different cofactor-dependent enzymes. (B) The quantity of different cofactor-dependent enzymes.

電子受體或 NAD+前體復(fù)合物能夠通過修飾改善NADH的再氧化影響電子傳遞鏈，從而實(shí)現(xiàn)輔因子水平的改變，達(dá)到改善輔因子平衡的目的。一個(gè)關(guān)于控制底物氧化還原態(tài)的典型例子是甘油的厭氧發(fā)酵[13]。在甘油厭氧發(fā)酵過程中，輔因子平衡主要通過兩條路徑進(jìn)行維持[14]：將電子轉(zhuǎn)移到內(nèi)源產(chǎn)生的有機(jī)化合物和將電子轉(zhuǎn)移到還原性產(chǎn)物。此兩種路徑為維持輔因子平衡和還原產(chǎn)物的最大化生產(chǎn)提供了有效的通道[15]。另一方面，共底物 (如：氰鐵酸鹽、硝酸鹽、有機(jī)酸、乙偶姻、乙醛和吩嗪) 能夠作為外源電子受體，促進(jìn)NADH的再氧化、維持NADH/NAD+比例與ATP水平的最優(yōu)化、實(shí)現(xiàn)輔因子平衡。在釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae TMB3001發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇的過程中，通過添加乙偶姻作為外源電子受體，有效地增加了胞內(nèi)NAD+含量, 提高了乙醇的產(chǎn)率[16]。

微生物胞內(nèi)輔因子平衡還可以通過控制營養(yǎng)及環(huán)境條件來實(shí)現(xiàn)NADH/NAD+與ATP/ADP比例的最優(yōu)化[5]。在琥珀酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌Escherichia coli NZN111中，由于丙酮酸甲酸裂解酶 (pflB) 和乳酸脫氫酶 (ldhA) 基因的敲除，引起NAD+不能再生，導(dǎo)致菌株生長緩慢、代謝能力差，嚴(yán)重影響琥珀酸的生產(chǎn)效率[17]。為了解決這一問題，葉勤教授課題組設(shè)計(jì)了好氧-厭氧兩階段培養(yǎng)策略[18]，即：好氧階段采用糖異生碳源 (如：乙酸、丙酮酸、甘油等) 調(diào)節(jié)E. coli NZN111的NAD+再生能力，恢復(fù)E. coli NZN111厭氧階段快速代謝葡萄糖，從而實(shí)現(xiàn)了琥珀酸的高效生產(chǎn)。當(dāng)NADH氧化為NAD+時(shí)，溶氧作為氧化磷酸化的電子受體，通過影響輔因子相關(guān)酶的活性來維持輔因子平衡，滿足細(xì)胞代謝的能量需求[19]。在丙酮酸發(fā)酵過程中，低溶氧條件 (20%) 會(huì)降低 NADH/NAD+的比率，導(dǎo)致丙酮酸的產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了68%、44%和45%[9]。另外，氧化還原電位也能夠影響某些酶的合成與穩(wěn)定性，如電子傳遞相關(guān)的酶[20]、NADH/NAD+依賴型酶[21]，最終導(dǎo)致 ATP得率、NADH/NAD+比例與代謝流的改變[22]。通過改變肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae發(fā)酵液的氧化還原電位，有效地提高了 NAD+/NADH比率，改善了 1,3-丙二醇的產(chǎn)量[23]。

3 基于代謝工程的輔因子平衡調(diào)控

圖2 輔因子平衡的生化工程調(diào)控策略Fig. 2 Strategies of biochemical engineering are used to regulate cofactor balance. The intracellular cofactor state can be improved by providing various compounds that can serve as electron acceptor (red), co-substrtes (green) and NAD+precursors (light blue), or by altering the environmental conditions such as dissolved oxygen (DO, yellow) and oxidoreduction potential (ORP, deep blue). Such strategies can affect electron transfer by modifying NADH reoxidation, and thus achieve cofactor transition to improve cofactor balance.

在典型的代謝路徑中，NAD(P)H/NAD(P)+能夠在一定程度上反映微生物胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)。當(dāng)輔因子的產(chǎn)生與消耗接近相等時(shí)，氧化還原達(dá)到平衡。然而，不平衡的氧化還原狀態(tài)會(huì)浪費(fèi)代謝能量、消耗碳代謝流和破壞細(xì)胞，甚至導(dǎo)致代謝休克。幸運(yùn)的是，不平衡的氧化還原路徑能夠通過調(diào)節(jié)輔因子重新達(dá)到平衡(圖3)：1) 啟動(dòng)子工程，精確調(diào)控輔因子依賴型基因的表達(dá)；2) 蛋白質(zhì)工程，改善輔因子依賴型酶的特異性；3) 結(jié)構(gòu)合成生物學(xué)，增強(qiáng)輔因子在合成路徑中的傳輸效率；4) 系統(tǒng)代謝工程，系統(tǒng)地探索與優(yōu)化輔因子對(duì)細(xì)胞的影響；5) 輔因子工程，重構(gòu)輔因子的代謝路徑。

3.1 啟動(dòng)子工程

圖3 輔因子平衡的代謝工程調(diào)控策略Fig. 3 Strategies of metabolic engineering are used to regulate cofactor balance. Promoter engineering (red) is used to regulate the gene expression levels by engineering promoter strengths, properties, ribosome binding and intergenic regions. Protein engineering (green) can be used to achieve cofactor balance by improving enzyme activity, changing substrate specificity, modifying cofactor specificity, constructing multi-enzyme complexes and creating bioorthogonal redox systems. Structural synthetic biotechnology (light blue) has fostered a variety of activities in cofactor-dependent metabolic pathways, aimed at designing and synthesizing DNA scaffolds, RNA scaffolds and protein scaffolds. Systems metabolic engineering (deep blue) is adopted to create new metabolic pathways, cellular regulatory circuits, and functions with the availability of necessary cofactors through the ‘omic’ techniques and computational techniques. Cofactor engineering (yellow) has provided an extra route to alter the intracellular cofactor pool and maintain the cellular redox balance by cytoplasmic H2O-forming NADH oxidase (NOX), mitochondrial alternative oxidase (AOX), phosphite dehydrogenase (PTDH), mitochondrial NADH kinase (POS5), soluble transhydrogenase (UdhA) and membrane-bound transhydrogenase (PntAB). Based on these strategies, the production and consumption of cofactors are approximately equal, and thus achieve cofactor transition to improve cofactor balance.

目前，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)化學(xué)品引起了人們的普遍關(guān)注。由于微生物代謝路徑多數(shù)由多基因共同編碼[24]，因此，化學(xué)品的產(chǎn)量與得率容易受到輔因子不平衡的限制，其主要原因在于合成路徑中輔因子依賴型酶的不平衡表達(dá)[13]。為解決此問題，啟動(dòng)子工程在合成生物學(xué)上的應(yīng)用已經(jīng)表現(xiàn)出強(qiáng)大的潛力，特別是在輔助控制基因精細(xì)化表達(dá)調(diào)控方面[25]。啟動(dòng)子工程常用的基因表達(dá)控制策略[26–29]，包括：改造啟動(dòng)子強(qiáng)度、性質(zhì)、基因間隔區(qū)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。改造啟動(dòng)子性質(zhì)已經(jīng)用于脂肪酸甲酯的生產(chǎn)[29]。在此實(shí)例中，通過采用動(dòng)力學(xué)敏感器控制系統(tǒng)，有效地改善了脂肪酸甲酯的生物合成路徑。該脂肪酸甲酯合成路徑主要包括 3個(gè)模塊，其中模塊B主要用于生產(chǎn)脂肪酸甲酯合成前體——乙醇，包括兩個(gè)酶：丙酮酸羧化酶和乙醇脫氫酶。當(dāng)模塊 B處于低表達(dá)水平時(shí)，脂肪酸甲酯的最高產(chǎn)量達(dá)到了1.5 g/L。該結(jié)果表明模塊B的低水平表達(dá)有利于平衡高水平表達(dá)乙醇脫氫酶所造成的輔因子過剩，同時(shí)也有利于改善輔因子積累所造成的代謝流失衡。另一個(gè)啟動(dòng)子工程應(yīng)用實(shí)例也與脂肪酸的合成相關(guān)[30]。該實(shí)例中，將外源引入的脂肪酸合成路徑分成 3個(gè)模塊：GLY模塊 (包含NAD (P)+依賴型的還原反應(yīng))、ACA模塊和FAS模塊 (包含NAD(P)H依賴型的氧化反應(yīng))。通過調(diào)節(jié)GLY模塊和FAS模塊啟動(dòng)子區(qū)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，有效地改善了相關(guān)基因的表達(dá)效率，進(jìn)一步提高了脂肪酸的產(chǎn)量。當(dāng)借助中等強(qiáng)度的核糖體結(jié)合位點(diǎn)表達(dá)GLY模塊時(shí)，脂肪酸的產(chǎn)量隨著FAS模塊核糖體結(jié)合位點(diǎn)強(qiáng)度的增強(qiáng)而提高。該結(jié)果表明：GLY模塊中NAD(P)+依賴型的還原反應(yīng)，能夠促進(jìn)FAS模塊中NAD (P)H依賴型的氧化反應(yīng)，從而將丙二酰-ACP成功轉(zhuǎn)化為脂肪酸。綜上兩個(gè)實(shí)例表明，借助啟動(dòng)子工程，能夠精細(xì)化調(diào)控合成路徑中輔因子依賴型基因的表達(dá)，在一定程度上實(shí)現(xiàn)碳流與輔因子平衡的優(yōu)化。3.2 蛋白質(zhì)工程

隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，利用可再生資源生產(chǎn)化學(xué)品已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)，如生物燃油、藥品等[31]。但是，僅僅將自然界中的路徑單元簡(jiǎn)單組合在一起所構(gòu)成的合成生物學(xué)路徑，在新的底盤微生物中并不能很好地發(fā)揮其應(yīng)有的生物學(xué)功能[32]，部分原因可能歸結(jié)為輔因子的影響。為有效實(shí)現(xiàn)輔因子平衡，充分發(fā)揮合成代謝路徑的生物學(xué)功能，在蛋白質(zhì)工程方面的研究主要側(cè)重于[33–38]：改善酶的活性、改變底物特異性、修飾輔因子特異性、構(gòu)建多功能酶復(fù)合體、創(chuàng)造生物徑向氧化還原系統(tǒng)。例如：通過修飾輔因子特異性可以有效提高維生素C的生產(chǎn)[39]。該實(shí)例中，將來源于谷氨酸棒桿菌 Corynebacterium glutamicum 的 2,5-二酮基-D-古龍酸還原酶(2,5-DKG)，在5個(gè)位點(diǎn)上通過一系列的定點(diǎn)突變擴(kuò)大輔因子結(jié)合口袋，發(fā)現(xiàn)四重突變體2,5-DKG-F22Y/K232G/R238H/A272G對(duì)NADH的親和力提高了2倍，成功實(shí)現(xiàn)了2,5-DKG輔因子偏好性由NADPH向NADH的轉(zhuǎn)變。該結(jié)果表明，借助蛋白質(zhì)工程改變合成代謝路徑中關(guān)鍵酶的輔因子偏好性，能夠?qū)崿F(xiàn)胞內(nèi)輔因子的平衡，進(jìn)而提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。另一方面，通過構(gòu)建生物徑向氧化還原系統(tǒng)也能夠?qū)崿F(xiàn)輔因子的平衡。將NAD+依賴型蘋果酸酶 (ME)、D-乳酸脫氫酶 (DLDH) 和蘋果酸脫氫酶(MDH) 突 變 成 ME-L310R/Q401C 、DLDH-V152R和MDH-L6R，成功實(shí)現(xiàn)NAD+依賴型酶的輔酶由NAD+轉(zhuǎn)變?yōu)镹AD+的結(jié)構(gòu)類似物 NFCD，而且能夠保持酶的活性不變[34]。由于生物徑向氧化還原系統(tǒng)能夠消除代謝路徑中輔因子的影響，使得該系統(tǒng)在系統(tǒng)生物學(xué)與合成生物學(xué)中具有廣闊的應(yīng)用前景。綜上所述，通過改善合成路徑中關(guān)鍵酶的輔因子的偏好性，有利于降低合成路徑系統(tǒng)中輔因子的影響，消除輔因子失衡所造成的負(fù)面效應(yīng)，這對(duì)于構(gòu)建高效的合成路徑具有非常重要的意義。

3.3 結(jié)構(gòu)合成生物學(xué)

結(jié)構(gòu)合成生物學(xué)，利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)與合成生物學(xué)的理論方法與技術(shù)手段，以生物活性結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)與控制細(xì)胞代謝或代謝路徑效率，為定位與增強(qiáng)細(xì)胞氧化還原路徑提供了新的渠道，同時(shí)也為控制輔因子介導(dǎo)的生物合成過程提供了借鑒[40]。目前，該技術(shù)在輔因子相關(guān)的代謝路徑改造方面，已經(jīng)取得了一定的研究進(jìn)展，主要體現(xiàn)在設(shè)計(jì)與合成蛋白質(zhì)腳手架、RNA 腳手架和 DNA 腳手架[41–43]。利用重組E. coli生產(chǎn)丁酸的過程中，考慮了一系列實(shí)現(xiàn)輔因子平衡的化學(xué)計(jì)量策略[44–45]。首先，改造本源的輔因子再生系統(tǒng)，如：刪除乙醇脫氫酶、乳酸脫氫酶和富馬酸還原酶。其次，利用源于丙酮丁醇梭菌 Clostridium acetobutylicum和齒垢密螺旋體Treponema denticola的5個(gè)基因，構(gòu)建丁酸合成途徑，該路徑的特點(diǎn)在于丁酸是NAD+再生的唯一最終電子受體。雖然上述策略重置了本源的輔因子再生系統(tǒng)，并借助還原力驅(qū)動(dòng)丁酸的合成，但是該異源合成路徑并不能有效地將碳流導(dǎo)向丁酸。因此，需要對(duì)丁酸合成途徑進(jìn)一步的優(yōu)化，提高路徑的底物傳輸效率。借助蛋白質(zhì)腳手架將丁酸合成途徑中的關(guān)鍵酶3-羥基丁酰CoA脫氫酶、3-羥基丁酰CoA脫水酶和轉(zhuǎn)脂酰CoA還原酶進(jìn)行空間定位，最終使得丁酸產(chǎn)量提高了 3倍。該結(jié)果表明，蛋白質(zhì)腳手架能夠有效縮短代謝反應(yīng)距離，驅(qū)動(dòng)合成路徑的高效進(jìn)行，降低中間代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的毒害作用[46]。上述策略的運(yùn)用，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞代謝功能的三維空間調(diào)控，對(duì)代謝調(diào)控的發(fā)展具有重要的指導(dǎo)作用，對(duì)于控制輔因子影響范圍方面，具有重要的參考意義。

3.4 系統(tǒng)代謝工程

系統(tǒng)代謝工程是在整合系統(tǒng)生物學(xué)、合成生物學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化工程的理論方法與技術(shù)手段的基礎(chǔ)上，提出的一套概念性的技術(shù)操作框架，主要用于指導(dǎo)合成新酶與代謝途徑，或者優(yōu)化已存在的代謝路徑，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)代謝物的高效生產(chǎn)[47]。因此，系統(tǒng)代謝工程能夠在充分考慮輔因子代謝的基礎(chǔ)上，創(chuàng)造新的代謝路徑及其代謝產(chǎn)物，精細(xì)化控制細(xì)胞代謝回路。系統(tǒng)代謝工程常用的技術(shù)手段，主要包括2個(gè)方面：組學(xué)技術(shù)，包括轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組[48]；計(jì)算機(jī)技術(shù)，包括以化學(xué)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的計(jì)算方法和以理性設(shè)計(jì)為基礎(chǔ)的計(jì)算方法[47]。例如，通過比較E. coli木糖醇生產(chǎn)與非生產(chǎn)條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將下調(diào)的56個(gè)基因作為抑制NADPH供應(yīng)的候選因子，并測(cè)定相應(yīng)基因缺陷型菌株的木糖醇生產(chǎn)水平[49]，發(fā)現(xiàn)只有yhbC缺陷型菌株有效地改善了木糖醇的生產(chǎn)、縮短了菌株的延遲期，其主要原因在于yhbC缺陷有效地提高了NADPH供應(yīng)。另一個(gè)系統(tǒng)代謝工程的應(yīng)用實(shí)例是丁醇的生產(chǎn)[50]。采用生物代謝路徑預(yù)測(cè)算法，闡釋了源自不同代謝中間產(chǎn)物的多種丁醇生物合成路徑。由于將4-羥基丁酸轉(zhuǎn)化為丁醇需要借助2步脫氫酶催化的還原反應(yīng)，利用限制性基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型iJR904與OptKnock模擬算法，設(shè)計(jì)了一株以丁醇生產(chǎn)為唯一實(shí)現(xiàn)輔因子平衡的菌株，并保證其能夠在厭氧條件下生長。首先，阻斷自然發(fā)酵產(chǎn)物代謝路徑，如乙醇、甲酸、乳酸、琥珀酸等，迫使菌株借助丁醇積累實(shí)現(xiàn)輔因子平衡。其次，采用一系列的代謝工程策略，并借助高NADH條件，將碳流導(dǎo)入TCA循環(huán)，如過量表達(dá)NADH敏感性的檸檬酸合成酶、替換NADH不敏感性的丙酮酸脫氫酶、刪除蘋果酸脫氫酶等。上述策略表明，系統(tǒng)代謝工程能夠在充分考慮輔因子平衡的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)目標(biāo)代謝物的高效生產(chǎn)菌株。因此，借助模型技術(shù)與組學(xué)技術(shù)的系統(tǒng)生物學(xué)方法，有助于我們更加精確地理解細(xì)胞生理功能，擴(kuò)大代謝工程可改造的范圍，有效地解決關(guān)鍵代謝瓶頸。3.5 輔因子工程

輔因子工程為改變胞內(nèi)輔因子通道，維持胞內(nèi)的輔因子平衡，提供了一條額外的路徑。因此，作為胞內(nèi)輔因子狀態(tài)預(yù)測(cè)器的胞質(zhì)水合NADH氧化酶(NOX)[51]、線粒體選擇性氧化酶(AOX1)[52]、磷酸脫氫酶(PTDH)[53]、線粒體NADH激酶(POS5)[54]、可溶性轉(zhuǎn)氫酶(UdhA)和膜連接轉(zhuǎn)氫酶(PntAB)[55]等，能夠直接影響NAD(P)H/NAD(P)+比例和胞內(nèi)ATP水平。在乳酸乳球菌Lactococcus lactis中，通過構(gòu)建noxE啟動(dòng)子庫調(diào)控 NOX的表達(dá)與 NADH/NAD+比例，能夠精確控制乳酸與雙乙酰的合成[51]。通過在S. cerevisiae中引入異源AOX1有效地實(shí)現(xiàn)了輔因子平衡、增強(qiáng)了電子傳遞速率、克服了Crabtree效應(yīng)和降低了乙醇代謝[52]。PTDH是一個(gè)不常用的生化反應(yīng)，利用NADH或NADPH作為氫化物供體，通常用于輔因子的回收利用[53]。PTDH三維結(jié)構(gòu)的解析，有利于進(jìn)一步改善其催化效率、擴(kuò)展輔因子的功能。利用POS5的表達(dá)，改善NADPH有效性，能夠有效提高鳥苷酸二磷酸 L-果糖的生產(chǎn)[54]。通過在E. coli MBS602中過量表達(dá)UdhA，能夠有效地將NADH轉(zhuǎn)變成NADPH，提高NADPH的有效性，使得(S)-2-氯丙酸酯的產(chǎn)量提高了150%，而過量表達(dá) PntAB，卻降低了(S)-2-氯丙酸酯的產(chǎn)量[55–56]。類似的，在E. coli GJT001中，過量表達(dá)UdhA，使得聚羥基丁酸的產(chǎn)量和單位細(xì)胞得率分別提高了 82.4%和 66%[56]。上述重置代謝結(jié)果表明，針對(duì)特定輔因子的代謝工程策略可能是一種更加直接的控制代謝、實(shí)現(xiàn)輔因子平衡的方法。為了研究輔因子擾動(dòng)與發(fā)酵動(dòng)態(tài)變化特性的關(guān)系，在 S. cerevisiae中分別表達(dá)NOX、AOX1、POS5、UdhA和 PntAB，分析NADH/NAD+、NADPH/NADP+和ATP/ADP的變化范圍對(duì)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響，如：菌體最大比生長速率 (μmax)、比葡萄糖消耗速率(γglu)、比甘油生成速率 (γgly)、比乙醇生成速率(γeth) 和比CO2生成速率 (γco2)[57]，結(jié)果表明：提高線粒體 NADH/NAD+的范圍，有利于提高γeth；提高胞質(zhì)NADH/NAD+的范圍，有利于提高γgly；提高NADPH/NADP+的范圍，有利于提高μmax；提高ATP/ADP的范圍，有利于降低γglu。上述研究初步實(shí)現(xiàn)了輔因子變化與碳流分布的關(guān)聯(lián)。

4 結(jié)論與展望

針對(duì)微生物輔因子平衡的代謝調(diào)控，國內(nèi)外研究人員采用生化工程和代謝工程等策略，開展了卓有成效的研究工作。特別是在代謝工程調(diào)控策略方面，發(fā)展了輔因子平衡調(diào)控的新技術(shù)，包括：?jiǎn)?dòng)子工程、蛋白質(zhì)工程、結(jié)構(gòu)合成生物學(xué)、系統(tǒng)代謝工程、輔因子工程等，擴(kuò)展了微生物輔因子系統(tǒng)的改造能力，實(shí)現(xiàn)了理性設(shè)計(jì)與輔因子控制的有效結(jié)合。然而，由于輔因子代謝與功能的復(fù)雜性，現(xiàn)有的輔因子平衡調(diào)控策略并不能有效地俘獲與控制胞內(nèi)輔因子的整體代謝平衡，從而影響了目標(biāo)代謝物的積累。因此，一方面，結(jié)合輔因子的代謝控制機(jī)制，發(fā)展高效的多重輔因子平衡調(diào)控技術(shù)，重置細(xì)胞整體對(duì)輔因子平衡的應(yīng)激性，優(yōu)化目標(biāo)代謝流的輔因子動(dòng)力學(xué)調(diào)控能力；另一方面，根據(jù)輔因子的生化特性，設(shè)計(jì)輔因子關(guān)聯(lián)性化學(xué)信號(hào)，通過實(shí)時(shí)檢測(cè)信號(hào)變化對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物合成的影響，建立輔因子變化與目標(biāo)產(chǎn)物合成的動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)輔因子對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物合成的高效調(diào)節(jié)。

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其次，要控制好材料的使用。嚴(yán)格按照設(shè)計(jì)要求采購使用材料，不采用超標(biāo)的材料，質(zhì)量和型號(hào)不符一律不予使用，標(biāo)號(hào)高的材料也不建議使用，因?yàn)楦邩?biāo)號(hào)材料不僅僅是浪費(fèi)，而且要考慮到是否與材料配套，尤其是不能使用質(zhì)量差的材料。在材料使用的設(shè)計(jì)上，要考慮整體統(tǒng)一性，不能有“大馬拉小車”和“老牛破車”的現(xiàn)象發(fā)生。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Manipulation of cofactor balance in microorganisms

Xiulai Chen1,2,3, Jia Liu1,2,3, Qiuling Luo1,2,3, and Liming Liu1,2,3

1 State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
2 Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
3 Laboratory of Food Microbial-Manufacturing Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Cofactor balance plays an important role in producing enzymes, pharmaceuticals and chemicals. To meet the demand of industrial production, microbes should maintain a maximal carbon flux towards target metabolites without fluctuations in cofactor. We reviewed the physiological function of cofactor and discussed detailed strategies to manipulate cofactor balance through biochemical engineering and metabolic engineering. Furthermore, we indicated future research needs to further regulate cofactor balance.

cofactor, NADH, metabolic engineering, synthetic biology, manipulation strategy

Liming Liu. Tel/Fax: +86-510-85197875; E-mail: mingll@jiangnan.edu.cn

10.13345/j.cjb.160232

Received: June 14, 2016; Accepted: September 23, 2016

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 21422602), the Key Technologies R & D Program of Jiangsu Province (No. BE2014652), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. JUSRP51611A), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. JUSRP116022), the Research Program for State Key Laboratory of Food Science and Technology of Jiangnan University (No. SKLF-ZZA-201602).

國家自然科學(xué)基金 (No. 21422602)，江蘇省科技支撐計(jì)劃社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目 (No. BE2014652)，江南大學(xué)自主科研計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目 (No. JUSRP51611A)，江南大學(xué)自主科研計(jì)劃青年基金 (No. JUSRP116022)，江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自由探索課題

(No. SKLF-ZZA-201602) 資助。

時(shí)間：2016-10-24

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20161024.1100.002.html

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