血漿腎素活性測量的研究進展*

李瑾綜述，陳寶榮，徐蓓審校

(1.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義 563000；2.北京航天總醫(yī)院檢驗科，北京 100076；3.中國計量科學(xué)研究院化學(xué)所，北京 100029)

·綜述·

血漿腎素活性測量的研究進展*

李瑾1綜述，陳寶榮2，徐蓓3審校

(1.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義 563000；2.北京航天總醫(yī)院檢驗科，北京 100076；3.中國計量科學(xué)研究院化學(xué)所，北京 100029)

血漿腎素活性(PRA)作為繼發(fā)性高血壓最重要的實驗室篩查項目之一，對鑒別原發(fā)性與繼發(fā)性醛固酮增多癥有重要意義。為更好地開展PRA測量的標(biāo)準(zhǔn)化工作，給臨床提供準(zhǔn)確可比的檢驗結(jié)果，該文系統(tǒng)地闡述了腎素的理化特性與臨床應(yīng)用、各種測量方法的性能與優(yōu)劣、測量標(biāo)準(zhǔn)化的現(xiàn)狀與問題，指明了探尋PRA標(biāo)準(zhǔn)化的路徑。

血漿；腎素；血管緊張素Ⅰ；測量；標(biāo)準(zhǔn)化

血漿腎素活性(plasma renin activity，PRA)、醛固酮(aldosterone，ALD)和血管緊張素(angiotensin，Ang)Ⅱ水平是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosteronesystem，RAAS)失調(diào)所導(dǎo)致的代謝紊亂疾病輔助診斷及高血壓分類的重要依據(jù)[1-2]。腎素作為RAAS中一系列激素鏈的激發(fā)物質(zhì)，對機體的體液容量、電解質(zhì)平衡、血壓調(diào)節(jié)等起重要作用[3]。PRA檢測目前作為繼發(fā)性高血壓的實驗室篩查項目之一，是原發(fā)性和繼發(fā)性高血壓分型診斷的重要指標(biāo)。腎素分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜、血中含量少，目前實驗室多通過測量PRA來表示腎素含量，但PRA測量尚未標(biāo)準(zhǔn)化。因此，如何根據(jù)血漿腎素的特點，選擇并建立合適的PRA測量方法，為臨床提供準(zhǔn)確可比的測量結(jié)果具有重要意義。

1 腎素的理化特性與臨床應(yīng)用

1898年，Tigerstedt和Bergman首先在兔腎臟提取物中發(fā)現(xiàn)了一種強升壓物質(zhì)，被命名為腎素[4]。腎素在人體內(nèi)以無活性的腎素原、有活性的腎素原、腎素3種形式存在，其中后兩種具有腎素活性，能催化血管緊張素原(angiotensinogen，AGT)轉(zhuǎn)化為AngⅠ。在體外，腎素原可以通過酸激活、酶激活、冷激活的方式轉(zhuǎn)化成活性腎素[5]。腎素原是腎素的前體，與腎素的結(jié)構(gòu)十分相似，呈低活性，較腎素多43個氨基酸。腎素原在酶作用下生成腎素，也被稱為血管緊張素原酶。腎素由腎小球中入球小動脈上的近球細(xì)胞分泌，含340個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量約為40 000[6]，呈二葉體結(jié)構(gòu)，每個葉上有1個天冬氨酰基活性部位。腎素的活性位點在2葉間的裂隙內(nèi)，此裂隙能結(jié)合底物即AGT的7～8個氨基酸[7]。

腎素與Ang、ALD三者構(gòu)成RAAS。當(dāng)血壓降低時，腎臟分泌腎素，腎素經(jīng)腎靜脈進入血液，催化由肝臟分泌于血液中的AGT轉(zhuǎn)變成AngⅠ(10肽)，血液和肺組織中的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)使AngⅠ降解為AngⅡ(8肽)，后者可被氨基肽酶水解為AngⅢ(7肽)[6]。其中，AngⅡ能夠有效收縮血管，使血壓升高；也能刺激腎上腺皮質(zhì)球狀帶分泌ALD和抗利尿激素，促進腎臟對水和鈉離子的重吸收，增加體液容量，最終升高血壓[8]。

腎素作為RAAS的重要組成部分，其活性檢測對臨床高血壓病因篩查、高血壓用藥指導(dǎo)及循環(huán)系統(tǒng)疾病輔助診斷具有重要意義[3]。原發(fā)性醛固酮增多癥(primary aldosteronism，PA)是因腎上腺皮質(zhì)病變導(dǎo)致醛固酮分泌增多、腎素-血管緊張素(renin angiotensinsystem，RAS)系統(tǒng)受抑制，表現(xiàn)出以低PRA和高ALD水平為主要特征、伴(或不伴)低血鉀為主要臨床表現(xiàn)的綜合征，是一種常見的繼發(fā)性高血壓，占全部高血壓的5%～15%[9]。研究表明，用ALD與PRA的比值(ARR)篩查后，PA檢出率提高了5～15倍[10]。《原發(fā)性醛固酮增多癥的臨床診療指南》[11]中明確建議將ARR作為PA首選篩查指標(biāo)。宋愛羚等[12]研究了PRA、AngⅡ及ALD水平在不同病因高血壓患者中的差異，表明PA患者較原發(fā)性高血壓患者具有高ALD濃度、低PRA水平，而嗜鉻細(xì)胞瘤(pheochromocytoma)患者則PRA水平升高。對伴低鈉血癥慢性心衰患者，具有原發(fā)性高血壓遺傳因素者檢測PRA也具有臨床意義[13-14]。此外，PRA的測定還可用于指導(dǎo)原發(fā)性高血壓用藥，研究發(fā)現(xiàn)低腎素群高血壓患者利尿劑及鈣拮抗劑降壓效果好，高腎素群高血壓患者使用ACE抑制劑、AngⅡ受體拮抗劑及β受體阻滯劑降壓效果更佳[15]。

目前，PRA檢測的基本原理是通過間接測定AngⅠ的生成量來反映，即指血漿中內(nèi)源性腎素催化AGT產(chǎn)生AngⅠ的速率。

2 血漿腎素活性的實驗室檢測方法

20世紀(jì)60年代，Harber和Boyd等[16]首先提出用放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)檢測PRA，至今已發(fā)展出多個實驗室測定PRA的方法[17-28]。目前，臨床實驗室常用的是RIA[16-18]和化學(xué)發(fā)光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay，CLIA)[19-20]。此外，基于分子結(jié)構(gòu)建立的特異性好、靈敏度高的高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[21-22]、質(zhì)譜分析法[23-29]也逐步開始用于PRA的研究與測量。

2.1 放射免疫分析法 20世紀(jì)60年代，RIA[16]測定PRA開始應(yīng)用。1975年，Drayer改進RIA，在樣本中加入ACE抑制劑，提高了靈敏度[17]。2012年，邵嬌梅等[18]在RIA[16-17]基礎(chǔ)上，用液體閃爍計數(shù)器檢測PRA及ALD，使RIA測量性能得到很好提升，精密度可達6.18%～10.79%，AngⅠ、ALD回收率分別為87.61%～116.89%、82.98%～119.22%。盡管改良后RIA測量性能已顯著優(yōu)于原RIA[16]，但RIA法難于自動化、測量影響因素多和對環(huán)境的污染問題等限制了該方法的臨床應(yīng)用，將逐步被其他方法所取代。

2.2 化學(xué)發(fā)光免疫分析法 雷永富等[19]用CLIA檢測PRA及ALD濃度，輔助診斷PA。2016年，楊超一等[20]提出建立CLIA測量人AngⅠ計算PRA，測量范圍為0.1～7.8 μg·L-1·h-1，靈敏度0.024 3 μg·L-1·h-1，批內(nèi)變異5.6%～8.7%，批間變異6.8%～10.4%，經(jīng)方法學(xué)評價符合免疫分析的基本要求。該類方法市場已有商品試劑盒，測量簡便易行、可自動化、無環(huán)境污染，是臨床易于接受的方法，但測量性能還有待進一步評價。

2.3 高效液相色譜法 1982年，Klickstein等[21]首次將HPLC用于檢測AngⅠ，并提出該法可用于PRA測定。1992年，Nakamura等[22]將HPLC與熒光法相結(jié)合，用含熒光殘基的N-(2-pyridyl)glyeine代替AGT作為底物，用熒光HPLC探測處理后樣品的熒光信號，批內(nèi)變異系數(shù)小于6%，批間變異系數(shù)小于15%，與RIA相關(guān)性很好。但HPLC因測定費時、工作量大等缺點，尚未見臨床應(yīng)用報道。

2.4 質(zhì)譜法 質(zhì)譜技術(shù)近年逐步進入醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，并廣泛用于血液或體液中氨基酸、肽、維生素、激素、血藥濃度、微量元素等微量或痕量物質(zhì)的測量[30-31]。1999年，F(xiàn)redline等[13]率先用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)測定PRA。PRA檢出限0.14 μg·L-1·h-1，樣品回收率92.3%。2010年，Bystrom等[24]通過監(jiān)測AngⅠ的體外降解程度間接測量PRA。2012年，Chappell等[25]用LC-MS/MS檢測腎素作用生成的AngⅠ，得出PRA定量限為0.005 μg·L-1·h-1，加標(biāo)回收率達93%，AngI萃取絕對回收率達60%。Carter等[26]用在線固相萃取LC-MS/MS測定PRA，線性范圍0.12～1.75 nmol·L-1·h-1；并研究樣本室溫保存的穩(wěn)定性，證明樣本室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定。Owen等[27]用離線固相萃取LC-MS/MS測量PRA，同濃度樣本變異系數(shù)低于Carter等[26]的方法；對PRA小于0.3 nmol·L-1·h-1的樣本孵育不同時間，認(rèn)為不需要對低腎素活性樣本延長孵育時間，但該結(jié)論尚未見其他作者研究證實。2015年，Popp等[28]用免疫基質(zhì)輔助激光解離電離技術(shù)(iMALDI)測定PRA；PRA線性范圍0.04～5.3 ng·L-1·s-1；與LC-MS/MS法比較發(fā)現(xiàn)該法不僅樣本用量少且能顯著改善PRA的線性范圍(R2≥0.98)。2016年，Van Der Gugten等[29]用離線固相萃取LC-MS/MS對PRA定量，線性范圍0.11～10.0 μg·L-1·h-1，與Carter等[26]在線固相萃取方法相比降低了PRA檢出限，擴大了測量的線性范圍。

3 血漿腎素活性測量的標(biāo)準(zhǔn)化

由于腎素缺少國際公認(rèn)的PRA測量的參考方法和參考物質(zhì)，目前尚未實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。各實驗室測量設(shè)備、方法、條件、參考范圍不盡相同，PRA測量結(jié)果缺乏可比性，這使臨床醫(yī)生在用PRA結(jié)果診斷疾病時困惑很大。賀冶冰等[32]曾探討ARR測定方法，通過停用降壓藥、取固定體位、固定時間段采血、充分鈉攝入以及低血鉀者補鉀等，得出ARR大致范圍，認(rèn)為ARR檢測方法或條件標(biāo)準(zhǔn)化，將有助于臨床醫(yī)生依據(jù)其結(jié)果篩查PA。賴鳳華等[33]用RIA與CLIA檢測PRA和ALD，評價兩種方法對PA的篩查效率，發(fā)現(xiàn)CLIA具有更高的靈敏度，但RIA特異性更好。一方面，因PRA測定的是體內(nèi)有活性的腎素，所以測定過程中應(yīng)避免腎素原激活成腎素的影響。對低濃度樣本一般通過延長孵育時間，測定增加AngⅠ的生成量，但存在即使樣本孵育時間延長且有肽酶抑制劑存在的情況下，AngⅠ仍能很快降解的情況[24]。另一方面，AGT濃度也會影響PRA的測定，在肝硬化、充血性心力衰竭等情況下，AGT水平下降，PRA降低，而雌激素能增加AGT水平使PRA升高[9]。除此之外，溶血反應(yīng)、妊娠、pH、抑制劑、孵育時間、體位、空白底物、樣本的收集與貯存都可能成為影響PRA準(zhǔn)確測量的因素[26,34-36]。

質(zhì)譜分析技術(shù)是理想的候選參考測量技術(shù)之一。國際上已用該技術(shù)建立了醛固酮、皮質(zhì)醇等項目的參考方法[37]。盡管Fredline等[23]基于質(zhì)譜技術(shù)建立了測量PRA的方法，但目前的測量性能還遠(yuǎn)不能滿足國際臨床化學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(IFCC)對參考方法測量性能的要求。2014年，臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)又發(fā)布了C62-A文件[38]，旨在指導(dǎo)、規(guī)范LC-MS法的開發(fā)和應(yīng)用。Van Der Gugten等[29]提出應(yīng)按照文件C62-A及EP32-R要求評價并保證質(zhì)譜方法測量結(jié)果的可比性及溯源性。文件對基于質(zhì)譜技術(shù)建立的各測量方法的性能驗證提出了明確而具體的要求，對質(zhì)譜測量標(biāo)準(zhǔn)化及質(zhì)譜技術(shù)的廣泛應(yīng)用發(fā)揮積極的推動作用。

目前，盡管臨床急需標(biāo)準(zhǔn)化的人血漿腎素活性的測量結(jié)果，但限于血漿中腎素低含量、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、在機體內(nèi)的復(fù)雜代謝和測量形式的差異等問題的局限性，研究文獻仍很少，急需深入研究與探索。通過系統(tǒng)研究建立PRA參考測量程序、并在此基礎(chǔ)上研制具有互換性的PRA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并用于臨床實驗室的常規(guī)測量系統(tǒng)是最終實現(xiàn)PRA各實驗室測量結(jié)果準(zhǔn)確可比的關(guān)鍵，也是實現(xiàn)PRA標(biāo)準(zhǔn)化的必由之路。

4 小結(jié)與展望

血漿中腎素活性對于維持正常血壓起重要調(diào)節(jié)作用。由于PRA檢測的原理、方法不同，目前各實驗室仍無法向臨床提供準(zhǔn)確可比的測量結(jié)果，給臨床高血壓的診斷、鑒別診斷及合理治療帶來困擾。通過對腎素的理化特性、PRA實驗室檢測現(xiàn)狀及臨床應(yīng)用需求的了解，選擇并建立靈敏度高、特異性強、測量范圍寬、可自動化并易于標(biāo)準(zhǔn)化的測量方法是實驗室當(dāng)務(wù)之急。質(zhì)譜技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、測量范圍寬等優(yōu)勢，是理想的候選參考測量技術(shù)之一，但仍需系統(tǒng)研究并建立滿足ISO 15193性能要求的測量方法。在此基礎(chǔ)上若能將質(zhì)譜技術(shù)的研究成果與各類自動化方法結(jié)合必將對改進人PRA測量結(jié)果的準(zhǔn)確可比發(fā)揮積極的作用。

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(本文編輯：王海燕)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.02.13

國家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研指標(biāo)(201210066)。

李瑾，1992年生，女，碩士研究生，研究方向為臨床化學(xué)測量標(biāo)準(zhǔn)化。

陳寶榮，主任技師，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：jyk711@sina.com。

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A

2016-11-29)