中藥材青蛙七的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

代文勝，徐金波，孫 靜

青蛙七為鳶尾科植物鳶尾Iris tectorum Maxim.的根狀莖，因其略似蛤蟆，故名“青蛙七”，是太白七藥中的一種。青蛙七味苦，辛，性寒，有毒，具有消積殺蟲、破瘀行水、解毒的功效。黃酮類化合物是青蛙七藥材的主要有效成分，根莖含有蘆丁、盾葉夾竹桃苷(androsin)[1]，鳶尾甲黃素(iristectorigenin)A、B[2]，鳶尾黃酮新苷(iristectorin)A、B[3]等異黃酮苷。本試驗(yàn)前期研究表明，青蛙七在小鼠耳廓微循環(huán)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)突出，已有的成分中蘆丁降低毛細(xì)血管脆性、改善微循環(huán)的作用明確，所以選擇了與活血作用相關(guān)的有效成分作為指標(biāo)，并對(duì)青蛙七的水分、灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物等常規(guī)項(xiàng)目含量進(jìn)行測定，以期為青蛙七藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料：高效液相色譜儀(配四元泵)，DAD(二極管陣列)檢測器，電子天平 (奧克斯公司)，高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，箱式實(shí)驗(yàn)電阻爐(常州市昊江電熱器材廠)，儀表恒溫水浴鍋(上海樹立儀器儀表有限公司)，循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。實(shí)驗(yàn)用青蛙七藥材采自陜西秦嶺太白山地區(qū)，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)胡本祥教授鑒定為鳶尾科植物鳶尾的根狀莖；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(購自上海圻明生物有限公司，批號(hào)：KB140327，純度99%)；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥材性狀[4]：根莖呈不規(guī)則結(jié)節(jié)狀、扁長條形或扁塊狀，有的一端膨大，另一端漸呈扁圓錐形。根莖大小不一，長可達(dá)10 cm左右，直徑1～2 cm、膨大處可達(dá)3～4 cm。表面棕色至淡黃色，稍皺縮，密生環(huán)節(jié)，節(jié)上有分枝，有縱橫紋及殘留須根，或有凹陷或突出的圓點(diǎn)狀根痕。上端有莖基殘痕，可見淡棕色或棕黑色葉鞘，質(zhì)地稍脆，具有纖維性，斷面為淡黃白色，味微苦，辛[5]。

1.2.2 粉末顯微特征[6]： 棕黃色，草酸鈣柱晶較多，為大型，也有極少方晶；導(dǎo)管常見，螺紋、梯紋、網(wǎng)紋，木栓細(xì)胞多角形，木化，偶見壁增厚的厚壁細(xì)胞，淀粉粒大小不均。

1.2.3 常規(guī)項(xiàng)目測定

1.2.3.1 水分測定：按照《中華人民共和國藥典》(2015年版)四部0832 第二法(烘干法)[6]測定，即稱取青蛙七粉末(過二號(hào)篩)2～5 g，精密稱定，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，要求其厚度不超過5 mm。將加入藥材粉末的扁形稱量瓶精密稱定后，打開瓶蓋在101～105 ℃的烘箱中干燥5 h，將瓶蓋蓋好，移至干燥器中；冷卻0.5 h后精密稱定，然后再在上述溫度下干燥1 h，冷卻，稱重，直至連續(xù)2次稱重的差異不超過5 mg為止。

1.2.3.2 總灰分測定：按照《中華人民共和國藥典》(2015年版)四部 2302總灰分測定法測定[6]。稱取青蛙七粉末(過二號(hào)篩)約3 g，置熾灼至恒重的坩堝中，稱定重量(準(zhǔn)確至0.01 g)，緩緩加熱，注意避免燃燒，至完全炭化時(shí)，置于馬弗爐中逐漸升高溫度至500～600 ℃，使其完全灰化并至恒重。根據(jù)殘?jiān)亓?，?jì)算供試品中總灰分的含量。

1.2.3.3 酸不溶性灰分測定：按照《中華人民共和國藥典》(2015年版)四部 2303酸不溶性灰分測定法測定[7]。按1.2.3.1中所取得的灰分，在坩堝中加入稀鹽酸約10 mL，用表面皿覆蓋坩堝，置水浴上加熱10 min，表面皿用5 mL熱水沖洗，洗液并入坩堝中，用無灰濾紙濾過，坩堝內(nèi)的殘?jiān)盟从跒V紙上，并洗滌至洗液不顯氯化物反應(yīng)為止。濾渣連同濾紙移至同一坩堝中，干燥，熾灼至恒重。根據(jù)殘?jiān)亓?，?jì)算供試品中酸不溶性灰分的含量。

1.2.3.4 水溶性浸出物含量測定：按照《中華人民共和國藥典》(2015年版)四部 2201水溶性浸出物測定法中的熱浸法測定[6]。稱取青蛙七藥材粉末(過二號(hào)篩)約2 g，精密稱定，置250 mL的錐形瓶中，精密加水75 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量。除另有規(guī)定外，以干燥品計(jì)算供試品中水溶性浸出物的含量。

1.2.4 薄層鑒別[6]

1.2.4.1 供試品溶液制備：精密稱取青蛙七粉末(過二號(hào)篩)2 g，精密量取甲醇10 mL，置于100 mL的錐形瓶中，在60 ℃的水浴鍋中溫浸1 h，濾過后取續(xù)濾液供薄層色譜使用。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備：精密稱取蘆丁和槲皮素各2 mg，用甲醇超聲溶解于10 mL的容量瓶中，再定容至刻度，供薄層色譜使用。

1.2.4.3 方法：吸取上述兩種溶液各10 μl分別點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上(薄層板用硅膠G濕法鋪板，干燥后在105 ℃下活化30 min)，以三氯甲烷-丙酮-甲酸[7](8∶4∶2)為展開劑，上行展開，展距為10 cm；展好后取出晾干，噴以足夠的三氯化鋁顯色劑，放于105 ℃的烘箱內(nèi)烘2～3 min后取出，觀察在對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，是否顯相同顏色的斑點(diǎn)。

1.2.5 含量測定[6]

1.2.5.1 色譜條件:BDS HYPERSIL C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μl)，以乙腈-水[9](15∶85)為流動(dòng)相，柱溫25 ℃，檢測波長255 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μl。

1.2.5.2 供試品溶液的制備：取本品粉末(過二號(hào)篩)2 g，加入甲醇10 mL，精密稱重后放于60 ℃水浴1 h，冷卻至常溫，用甲醇補(bǔ)足重量后，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.2.5.3 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取蘆丁對(duì)照品5 mg置于25 mL的容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得0.2 mg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.2.5.4 線性關(guān)系考察：按1.2.5.3項(xiàng)下配置好的對(duì)照品溶液中精密量取5 mL置于10 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配置成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并依次稀釋成0.05、0.025、0.012 5、0.006 25 mg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣2次，每次10 μl，注入高效液相色譜儀，按1.2.5.1項(xiàng)下色譜條件測定峰面積分別為29.25、76.45、169、367.7、782.4。以濃度X為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.5 精密度試驗(yàn):精密吸取按1.2.5.3項(xiàng)下濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣5次，注入色譜儀中，測定其峰面積。

1.2.5.6 重復(fù)性試驗(yàn):取同一產(chǎn)地青蛙七按1.2.5.2項(xiàng)下所述方法平行制備5份樣品，分別注入高效液相色譜儀測定其峰面積。

1.2.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn):以選定濃度為準(zhǔn)(0.006 25 mg/mL)的供試溶液，分別在0、1、2、4、6 h時(shí)間段內(nèi)測定峰面積。

1.2.5.8 加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取一定量的青蛙七5份，分別測定蘆丁含量，再分別向其中加入蘆丁對(duì)照品0.2 mg，按1.2.5.1項(xiàng)下的色譜條件測定蘆丁含量，并計(jì)算樣品加樣回收率。含量測定：根據(jù)上述色譜條件，平行3次測定供試品的峰面積，并計(jì)算其平均值。

2 結(jié)果

按照以上方法,測得青蛙七藥材水分平均含量為7.76%，總灰分的含量為9.07%，酸不溶性灰分的含量為8.57%;3組水溶性浸出物的測定結(jié)果平均值為24.19%，薄層色譜所顯主斑點(diǎn)的位置和顏色與對(duì)照藥材相同。在含量測定中，得到蘆丁的線性回歸方程為：Y=8 047.7X-26.89(r=0.999 8)，說明蘆丁的濃度在0.006 25～0.100 mg/mL的范圍內(nèi)與峰面積積分值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；由精密度實(shí)驗(yàn)測得蘆丁的峰面積，分別為1 774.3、1 779.7、1 774.7、1 776.7、1 766.5,RSD值為0.11%，結(jié)果表明儀器精密度良好；由重復(fù)性實(shí)驗(yàn)測得蘆丁的峰面積，分別為2 097.9、2 094.71、2 095.8、2 096.6、2 097.67，RSD值為0.6%，表明本實(shí)驗(yàn)的方法重復(fù)性良好；由穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果供試溶液在6 h內(nèi)測定峰面積，分別為30.7、29.8、31.1、30.5、29.6，RSD值為1.84%，說明樣品穩(wěn)定性良好；由加樣回收實(shí)驗(yàn)測得平均回收率為100.3%，RSD值為1.85%，表明本法回收率良好。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)鳶尾科植物鳶尾的根狀莖藥材青蛙七[8]做了一系列測定。對(duì)青蛙七的藥材性狀做了常規(guī)鑒別，可知藥材為秦嶺太白七藥之青蛙七；并對(duì)藥材的橫切面及粉末圖進(jìn)行顯微鑒別，初步建立藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在對(duì)藥材進(jìn)行初步鑒別之后，對(duì)藥材的常規(guī)檢查項(xiàng)目(水分、總灰分及酸不溶性灰分、水溶性浸出物)進(jìn)行測定，并對(duì)青蛙七中有效成分蘆丁的含量進(jìn)行定性定量測定。本實(shí)驗(yàn)研究可以初步得到關(guān)于青蛙七的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：水分不得大于10%，總灰分不得超過10%，酸不溶性灰分不得超過9%，水溶性浸出物不得少于20%，蘆丁的含量不得少于0.3%。

前期研究表明[9]，青蛙七在小鼠耳廓微循環(huán)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)突出，已有的成分中蘆丁具有確切的降低毛細(xì)血管脆性、改善微循環(huán)的作用，而改善微循環(huán)又為活血化瘀的機(jī)理之一，所以選擇了與活血作用相關(guān)的有效成分作為指標(biāo)。在薄層鑒別實(shí)驗(yàn)中，比較了藥典收錄與文獻(xiàn)報(bào)道的展開系統(tǒng)，結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)選擇的三氯甲烷-丙酮-甲酸(8∶4∶2)的展開系統(tǒng)，斑點(diǎn)清晰，分離度好。該實(shí)驗(yàn)研究為青蛙七藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了依據(jù)。

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