彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤BCL-2、BCL-6基因重排特點及預(yù)后分析

張 淼，畢曉芳，蔡海燕，賀海燕，李 晶，王 平，牛牧文

非霍奇金淋巴瘤(HHL)是一類高度惡性的淋巴造血系統(tǒng)疾病，死亡率居惡性腫瘤第10位。而彌漫大B細(xì)胞性淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最常見的一種類型，占西方成人的30%～40%。研究表明，DLBCL的分子遺傳學(xué)和免疫表型存在差異，導(dǎo)致治療效果和預(yù)后顯著不同[1]。BCL-2、BCL-6、C-myc基因是DLBCL中最常發(fā)生異常的基因[2]。BCL-2、BCL-6基因重排在寧夏地區(qū)DLBCL中有何特點，與臨床預(yù)后是否存在相關(guān)性有待研究。雖然近年來DLBCL的診治水平不斷提高，但生存率仍不理想，30%～50%的患者耐藥或復(fù)發(fā)最終死亡[3]。因此，判斷寧夏地區(qū)DLBCL的預(yù)后影響因素，并有針對性地個體化治療是我們研究的目的。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集寧夏人民醫(yī)院病理科2010年1月-2015年10月初次收治的DLBCL患者，選擇符合條件的59例(按照WHO2008版組織學(xué)分型)。所有DLBCL患者術(shù)前均未接受過治療，且臨床實驗室資料完整。對所有患者進(jìn)行電話隨訪，每3個月隨訪1次，按照總生存期(OS)計算，即以月為單位，從初次診斷到任何原因?qū)е碌氖гL、死亡，隨訪日期終止。

1.2 治療方法:收集患者性別、年齡、名族、臨床分期(AnnArbor分期，胃腸道為Lugano分期)、有無B癥狀、血清乳酸脫氫酶(LDH)有無升高、結(jié)外病種累及數(shù)量、國際預(yù)后指數(shù)評分(IPI)和行為狀態(tài)評分(ECOG)。按照DLBCL診療規(guī)范選擇以蒽環(huán)類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，一線方案選擇CHOP或CHOP樣方案，二線選擇ICE方案。中位療程4個周期，部分患者聯(lián)合放射治療，有條件者給予利妥昔單抗注射治療。

1.3 免疫組化染色(ICH):所有標(biāo)本均使用Dako全自動免疫組化染色機(jī)，SP試劑盒均購自北京中杉金橋生物公司，嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)程序操作，用試劑盒提供的陽性切片進(jìn)行對照，用PBS做陰性對照，DAB顯色。按照Hans分型標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)CD10、BCL-6、MUM-1的表達(dá)情況將所有病例分為GCB組和non-GCB組。BCL-2、BCL-6蛋白表達(dá)情況見圖1-圖4(目錄后)。

1.4 熒光原位雜交(FISH)檢測:所用探針均購置于北京金菩嘉醫(yī)療科技公司。BCL-6雙色斷裂分離探針(重排時顯示1個紅色與綠色的融合信號，另見1個紅色和綠色的分離信號)和BCL-2/IGH雙色融合易位探針(易位時顯示1個紅色信號，1個綠色信號及2個融合信號)，當(dāng)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)3個以上紅色信號時判讀為染色體區(qū)段的擴(kuò)增[5]。所用病例均行BCL-2和BCL-6基因檢測，同時選取淋巴組織反應(yīng)性增生患者20例作為對照，操作方法參見說明。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，對于分類變量資料的描述采用例數(shù)與百分比的形式表示，各因素對預(yù)后生存時間的影響采用Kaplan-meier檢驗進(jìn)行分析，采用Cox模型(最大似然比法)對隨訪結(jié)果預(yù)期進(jìn)行多因素影響因素分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點：59例DLBCL患者，結(jié)內(nèi)34例(57.6%)，結(jié)外25例(42.3%)。結(jié)外DLBCL發(fā)生部位以胃腸多見為12例(20.3%)，其他部位包括眼部3例(5.0%)，鼻咽、縱膈各2例(各3.4%)，扁桃體、甲狀腺、腹膜后、脾臟、子宮、椎體各1例(各1.7%)。59例DLBCL患者中男性34例，女性25例；中位年齡54歲(26～81歲)，≥60歲26例。發(fā)生BCL-2基因易位2例，BCL-6基因斷裂15例；出現(xiàn)B癥狀31例，血清LDH升高29例。臨床分期Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期29例；IPI評分≥3分25例；ECOG評分>2分25例；結(jié)外受累病灶>1個病灶25例；發(fā)生骨髓浸潤1例。59例患者均接受以蒽環(huán)類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，39例接受手術(shù)治療，7例化療加局部放療，4例給予利妥昔單抗治療。本組中位隨訪時間 22.7個月，中位總生存期33.36個月；隨訪期間死亡30 例，總死亡率50.8%，3年死亡率56.91%，5年生存率69.78%。

2.2 分類及基因重排情況：按照Hans分型標(biāo)準(zhǔn)將患者分為GCB和non-GCB 2組，其中GCB組20例(33.9%)，non-GCB組39例(66.1%)。2組生存曲線見圖3(目錄后)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析(χ2=14.318,RR=5.357，P<0.05)，GCB組預(yù)后好于non-GCB組。本組患者發(fā)生BCL-2基因易位2例(3.4%)，(χ2=16.554,P<0.05，RR=由于重排失訪0，故算不出，值趨向無窮大)發(fā)生BCL-2基因融合的預(yù)后較差。BCL-6基因斷裂15例(25.4%)(χ2=3.225,RR=0.276，P<0.05)，發(fā)生BCL-6基因重排的與沒有發(fā)生重排的預(yù)后差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 臨床預(yù)后因素分析:將所有臨床相關(guān)的單因素參數(shù)進(jìn)入Cox模型中進(jìn)行預(yù)后多因素分析，變量的選擇采用LR向后法。相對危險度分別為：Hans分型RR(non-GCB/GCB)=0.067(95%CI0.692～3.773)，RR(BCL-2基因重排/未重排)=0.015(95%CI0.156～1.818)，RR(Ⅲ～Ⅳ期/Ⅰ～Ⅱ期)=0.006(95%CI0.027～0.552)，RR(LDH升高/正常)=0.056(95%CI0.106～1.031)，RR(≥60歲/<60歲)=0.031(95%CI1.004～1.089)，RR(IPI≥3分/<3分)=0.011(95%CI1.012～1.096)。本組數(shù)據(jù)提示，Hans分型non-GCB組、BCL-2基因發(fā)生融合、年齡>60歲，臨床分期較晚(Ⅲ-Ⅳ期)、血清LDH升高、IPI評分>3分，均為影響預(yù)后的高危險因素。

3 討論

應(yīng)用熒光原位雜交(FISH)技術(shù)對形態(tài)學(xué)診斷為DLBCL的59例淋巴瘤標(biāo)本進(jìn)行了遺傳學(xué)異常的檢測，與免疫組化染色法結(jié)果比對，20例淋巴組織反應(yīng)性增生患者均未發(fā)生基因重排，提示FISH技術(shù)在病變性質(zhì)的判斷上較免疫組化染色法更有意義。FISH檢測不僅能夠確定淋巴組織病變性質(zhì)，還為淋巴瘤進(jìn)一步分型提供了重要的診斷性依據(jù)。FISH技術(shù)可以避免由于免疫組化染色缺陷及醫(yī)師判讀差異等造成的錯誤診斷，有助于提高淋巴瘤診斷分型的準(zhǔn)確性。

由于DLBCL的分子遺傳學(xué)的差異，導(dǎo)致療效和預(yù)后顯著不同。雖然近年來的診治水平不斷提高，但生存率仍不理想。因此，個體化精準(zhǔn)診斷和治療，有助于提高患者的生存質(zhì)量。在DLBCL中最常發(fā)生異常的基因為BCL-2、BCL-6、C-myc基因。本組研究只針對BCL-2、BCL-6基因重排情況進(jìn)行了研究。在寧夏地區(qū)DLBCL中發(fā)生BCL-2基因融合的患者預(yù)后較差，基因融合與患者臨床特征如年齡、臨床分期、LDH水平、IPI評分等差異有統(tǒng)計學(xué)(P<0.05)。但因為選取病例數(shù)及發(fā)生基因融合的病例數(shù)有限，BCL-2基因融合是否可以作為寧夏地區(qū)DLBCL中的一個獨(dú)立預(yù)后因素還有待研究。本組患者的BCL-6基因重排發(fā)生于患者的臨床特征各項指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示BCL-6基因重排在寧夏地區(qū)DLBCL中不能作為一個獨(dú)立的預(yù)后因素，與國外文獻(xiàn)報道一致[6]。

依據(jù)生物標(biāo)記物進(jìn)行免疫分型，目前應(yīng)用較為普遍，尤其是Hans分型，但對DLBCL預(yù)后的影響尚存在爭議，不同研究小組在免疫分型和預(yù)后相關(guān)性報道也存在分歧[7]。本組患者GCB組和non-GCB組的臨床指標(biāo)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，GCB組預(yù)后顯著優(yōu)于non-GCB組，因此Hans分型可以作為寧夏地區(qū)DLBCL的一項預(yù)后指標(biāo)。

由于DLBCL具有分子遺傳學(xué)上的異質(zhì)性，按照標(biāo)準(zhǔn)方案治療，仍有30%～50%的患者最終死亡[3]。風(fēng)險指數(shù)，能夠更好地管理患者和指導(dǎo)風(fēng)險調(diào)整后的治療策略[8]；IPI評分為DLBCL患者的管理提供預(yù)后指導(dǎo)，易于實施，是目前流行的臨床預(yù)后評估工具。本組患者中IPI評分高，是顯著的預(yù)后不良因素，尤其是IPI評分中以60歲為界限的年齡評估，在本組試驗中的得到充分證實。一些研究對年齡和預(yù)后的關(guān)系也提出了不同看法[9-10]，提示初診年齡超過50歲已經(jīng)提示預(yù)后不良，因為年輕患者有更強(qiáng)烈接受治療的愿望[11]。同時，本組患者通過多因素統(tǒng)計分析提示，患者初診時的臨床分期晚、血清LDH顯著升高均可作為判斷預(yù)后不良的有價值的指標(biāo)，與國內(nèi)報道一致[11]。本組性別被排除在高危險因素外，但有報道顯示男性預(yù)后較女性差[11]。出現(xiàn)B癥狀、ECGO評分>2分也被排除，與文獻(xiàn)報道不一致[12]，考慮為B癥狀的判斷和ECGO評分主觀因素較大。本組患者死亡30例，總死亡率50.8%，較國內(nèi)報道死亡率略高[13],可能因為寧夏地區(qū)經(jīng)濟(jì)落后，延誤最佳診療時間，而且治療也相對滯后造成的。本組中只有4例患者使用了利妥昔單抗治療，因為例數(shù)較少，未納入Cox模型進(jìn)行臨床預(yù)后分析，但有研究顯示利妥昔單抗治療患者預(yù)后較好。

總之，隨著對DLBCL研究的深入，更多的分子遺傳學(xué)信息將被引入評估中。本組患者通過構(gòu)建Cox模型多因素分析，提示Hans分型、BCL-2基因融合、年齡、臨床分期、LDH水平IPI評分，均為寧夏地區(qū)DLBCL的預(yù)后不良因子。將在后續(xù)的工作中進(jìn)一步深入研究，同時把相關(guān)有意義的數(shù)據(jù)及時提供給臨床，為提高患者的生存率不斷努力。

[1] Nagano O，Okazaki S，Saya H.Redox regulation in stem-like cancer cell by CD44 variant isoforms[J].Oncogene，2013，32(44):5191-5198.

[2] Wang HK，Geng JL，Wen XM，et al.The transcription factor FOXP1 is a critical regular of the differentiation of follicular helper T cell[J].Nat Immunol，2014，15(7):667-675.

[3] Tilly H，Vitolo U，Walewski J，et al.Diffuse large B-cell lymphoma [J].Crit Rev Oncol Hematol ,2013,87(2):146.

[4] Meric K，KilleenRP，Abi Ghanem AS，et al.The use of 18F-FDG PET ratios in the differential diagnosis of common malignant brain tumors[J].Clin Imaging，2015，39(6):970-974.

[5] Hu S，Xu Monette ZY.MYC/BCL-2 protein coexpression contributes to the inferior of activated B-cell subtype of Diffuse large B-cell lymphoma and demonstrates high- risk gene expression signatures:a report from the International DLBCL Rituximab-CHOP Consortium Program[J].Blood，2013，121(20):1021-1031.

[6] 彭鵬，鄒文蓉，王瑜，等.R-CHOP與CHOP方案治療生發(fā)中心和非生發(fā)中心來源DLBCL療效評價[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2013，29(16):2467.

[7] Cairo MS，Sposto R，Gerrard M，et al.Advanced stage，increased lactate dehydrogenase，and primary site，but not adolescentage (≥15 years)，are associated with an increased risk of treatment failure in children and adolescents with mature B-cell non-Hodgkin’s lymphoma:results of the FAB LMB 96 study[J].J Clin Oncol,2012,30(4):387-393.

[8] Zhou Z，Sehn LH，Rademaker AW，et al.An enhanced International Prognostic Index (NCCN-IPI) for patients with diffuse large B-cell lymphoma treated in the rituximab era[J].Blood,2014,123(6):837-842.

[9] 傅志英，朱軍，宋玉琴，等.2525例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤預(yù)后影響因素分析[J].北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2014,46(3):405-411.

[10] 李小秋，李甘地，高子芬，等.中國淋巴瘤病理研究協(xié)作組中國淋巴瘤亞型分布:國內(nèi)多中心性病例10002例分析[J].診斷學(xué)理論與實踐，2012，11(2):111-115.

[11] Zelenetz A，Abramson J，Advani R，et al.NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology:non-Hodgkin’s lymphomas[J].J Natl Compr Canca Netw，2010，8(3):288-334.

[12] 趙茜，傅衛(wèi)軍，張春陽，等.147例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者的臨床特點及預(yù)后分析[J].中華血液學(xué)雜志，2013，34(9):737-740.

[13] Yu BH，Zhou XY，Li Bz，et al.FOXP1expression and its clinic pathologic significance in nodal and extranodal diffuse large B-cell lymphoma [J].Ann Hematol，2011，90(6):701-708.