蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病機制的研究進展

21世紀,糖尿病(diabetes Mellitus，DM)已經(jīng)逐漸成為一種流行病，其患病率為2%～6%[1]。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy ，DR)，是糖尿病的一種微血管并發(fā)癥，病變晚期可導(dǎo)致失明。過去常認為，DR的發(fā)生及進展與糖尿病的病程長、血糖控制不佳及高血脂有關(guān)。事實上，DR的病理變化是涉及到微血管病變、神經(jīng)退化、免疫、繼發(fā)性炎癥反應(yīng)等多種因素相互作用的結(jié)果。目前，DR的治療方法主要包括：視網(wǎng)膜光凝，球內(nèi)注藥(抗VEGF)，以及玻璃體切除術(shù)，適用于該疾病的晚期，且病人之間療效差異較大。差異表達的生物標志物能客觀預(yù)示疾病的發(fā)生，監(jiān)控疾病的進展，評估治療的療效，有助于DR的預(yù)防及治療。蛋白質(zhì)組(proteome)概念在1994年由Wilkins與Williams[2]提出，是指在特定的時間和空間內(nèi)，一個基因組、一種組織或一種生物、細胞所表達的包括所有亞型以及經(jīng)過修飾的全部蛋白質(zhì)。而蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)就是從整體水平上來認識蛋白質(zhì)的存在及其活動方式(表達、修飾、功能、相互作用等)，從而更好的闡明生命科學(xué)本質(zhì)的學(xué)科[3]。以玻璃體、房水，血液、淚液、唾液等為研究對象，運用蛋白質(zhì)組學(xué)從分子水平研究DR的發(fā)病機制，能對其進行早期診斷，尋找新的治療靶點，從而改善其預(yù)后。

一、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究概況

根據(jù)研究目的和手段的不同，蛋白質(zhì)組學(xué)可以分為表達蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)。表達蛋白質(zhì)組學(xué)用于細胞內(nèi)蛋白樣品表達的定量研究。其研究技術(shù)為經(jīng)典的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)即雙向凝膠電泳和圖像分析。在蛋白質(zhì)組水平上研究蛋白質(zhì)表達水平的變化等，是應(yīng)用最為廣泛的蛋白質(zhì)組學(xué)的研究模式[4]。

1.蛋白質(zhì)主要分離技術(shù) ：二維凝膠電泳(two dimensional electrophoresis，2DE)及液相色譜法(liquidchromatographic，LC)是兩種常見的分離技術(shù)。2DE是一種用途廣泛，以凝膠為基礎(chǔ)，通過蛋白質(zhì)電荷及分子大小，定性及定量分析的技術(shù)[5]。LC是一種不以凝膠為基礎(chǔ)的高效分離技術(shù)。是利用待分離的物質(zhì)在分離相與固定相的分配系數(shù)、吸附能力等親和能力的不同來進行分離的[6]。

2.基于質(zhì)譜的定量研究技術(shù)：質(zhì)譜法(mmass spectrometry，MS)是用電場和磁場將運動的離子按它們的質(zhì)荷比分離后進行檢測的方法，可獲得化合物的分子量及化學(xué)結(jié)構(gòu)[7]。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)能夠飛速發(fā)展的最大功臣非質(zhì)譜莫屬。根據(jù)生物大分子的特性，基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)和電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)主要應(yīng)用于生物質(zhì)譜。基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分為同位素標記技術(shù)(ICAT，iTRAQ，TMT，雙甲基化，SILAC)，及非同位素標記(Lable-free)蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)。SILAC法是在細胞培養(yǎng)時，采用含有輕、中、重同位素型必需氨基酸的培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，細胞經(jīng)傳代后其蛋白質(zhì)被同位素穩(wěn)定標記，再通過質(zhì)譜對蛋白進行鑒定及相對定量。ICAT法是將來源不同處理的蛋白質(zhì)分別用重型ICAT試劑和輕型ICAT 試劑標記，等量混合后經(jīng)胰蛋白酶酶切，進行質(zhì)譜分析。ICAT法不能用于標記不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白質(zhì)，且ICAT分子量相對較大，與蛋白質(zhì)連接后可能會造成分子的空間位組。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進步，iTRAQ技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中已成為熱點，它幾乎可以標記所有的蛋白質(zhì)，一次可同時處理8個樣本[8]，具有靈敏度高、分辨率高、重復(fù)性好等諸多優(yōu)點,這使其在醫(yī)學(xué)和生物制藥領(lǐng)域受到高度關(guān)注和廣泛應(yīng)用[9]。非同位素標記蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)，不需要昂貴的同位素進行標記，所需樣本總量少，且不受樣品數(shù)量的限制，直接采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對蛋白質(zhì)酶解肽段進行質(zhì)譜分析，比較不同蛋白質(zhì)樣品二級質(zhì)譜的肽段離子的數(shù)量，并根據(jù)肽段數(shù)量進行相對定量[10]。

二、蛋白質(zhì)組學(xué)在DR發(fā)病機制中的應(yīng)用

1.增生膜中的生物分子標志物：因為視網(wǎng)膜是DR的病變部位，所以選取的研究對象與視網(wǎng)膜關(guān)系越緊密，越能夠揭示DR的發(fā)生與發(fā)展。2010年Takada等[11]用LC/MS 技術(shù)，以特發(fā)性黃斑前膜(idiopathic epiretinal membranes ，ERMs)患者為對照組取其前膜，PDR患者為實驗組取其增生膜，發(fā)現(xiàn)226種蛋白表達于PDR組，154種蛋白表達于ERM組，其中102種蛋白特異性存在于PDR中，30種蛋白特異性存在于ERM中，經(jīng)過數(shù)據(jù)分析及RT-PCR對其驗證發(fā)現(xiàn)，骨膜素(periostin)在PDR組中的表達量明顯上調(diào)，該蛋白在細胞粘附中發(fā)揮重要作用，可能參與PDR的發(fā)生。

2.玻璃體中的生物分子標志物：玻璃體含有可溶性蛋白質(zhì)及一些生物大分子，較易通過玻璃體切除術(shù)獲取，且其貼近視網(wǎng)膜，能一定程度上反應(yīng)視網(wǎng)膜的病變。Angi[12]等用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法證實了DR組玻璃體的蛋白質(zhì)含量比非DR組的高。Sirpa[13]等用LC/MS技術(shù)選取138位患者的玻璃體進行分析，鑒定出了2482種蛋白質(zhì)，并對其中的1351種蛋白質(zhì)進行定量分析。與NPDR組相比，PDR組中有230種蛋白質(zhì)顯著上調(diào)，其中氧化應(yīng)激及活性氧物質(zhì)(PRDX2, PRDX6, CATA， ROMO1)在PDR組中顯著上調(diào)，參與補體級聯(lián)反應(yīng)的(C1Q, CFAB, CFAD,CFAH, CFA)等因子及A1AT, A2MG, ANT3等凝血因子也在PDR組中顯著上調(diào)。此外，該研究還指出，PDR組經(jīng)抗VEGF治療后，有72種蛋白被顯著下調(diào)，其中包括(CNTN2, FAT4, FLNC)等細胞粘附因子，(APOBR和APOH)載脂蛋白等。

3.房水中的生物分子標志物：房水經(jīng)睫狀體分泌，從后房途經(jīng)瞳孔流進前房，實現(xiàn)眼內(nèi)循環(huán)。Chiang[14]等通過以凝膠為基礎(chǔ)的蛋白組學(xué)研究技術(shù)與MALDI-TOF-MS聯(lián)用，鑒定出了DR組與對照組房水中差異性表達的11種蛋白質(zhì)，這些蛋白與營養(yǎng)運輸、組織重組、血管生成、抗氧化及神經(jīng)保護等生命活動相關(guān)(見表1)。Grigsby[15]等指出，DM的發(fā)病與炎癥反應(yīng)有關(guān)，而其機制之一是神經(jīng)膠質(zhì)細胞(retinal glial cells，RGC)的活化。隨后，Stela[16]等用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法證實，與對照組相比，DR患者房水中RGC相關(guān)的炎性因子表達上調(diào)(見表1)。

4.血漿中的生物分子標志物：增生膜、玻璃體、房水因為與DR的發(fā)病部位聯(lián)系緊密，所以是最為合適的研究對象。但它們必須通過手術(shù)獲得，適合揭示疾病的進展，不適用于疾病的診斷。由于血漿相對容易獲取，能為DR的診斷提供重要信息。雖然，研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多生物分子標志物與DR相關(guān)，有研究表明，當糖化血紅蛋白每減少1%，DR的發(fā)生率將下降40%，DR的進展將減少25%[17]。Song和Xu分別通過meta分析發(fā)現(xiàn)，C反應(yīng)蛋白的水平在DR患者中有所上升，同型半胱氨酸在I型糖尿病中與DR的發(fā)生密切相關(guān)[18，19]。然而，它們都是非特異性的炎性標志物，故限制了其應(yīng)用。目前，只有糖化血紅蛋白應(yīng)用于臨床監(jiān)測DR的發(fā)生及進展。Gopalakrishnan[20]等用2DE與MALDI-TOF-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)血漿中RBP1、NUD10、NGB、HBG2、CD160在DR組中表達上調(diào)，其與物質(zhì)運輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧傳遞及免疫應(yīng)答相關(guān)。Yeh[21]等用親和去除系統(tǒng)提取出2型糖尿病患者血漿中14種高豐度蛋白，再用LC-ESI-MS技術(shù)對低豐度蛋白進行分析，發(fā)現(xiàn)L1CAM在DR患者血漿顯著上調(diào)。

5.淚液中的生物分子標志物：淚液是一種由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、粘液素、水和鹽組成的一種復(fù)雜混合物。與血漿相比，其較少受全身疾病影響，取材更方便，且具有非侵入性，所以近些年，成為了尋找生物標志物的重要對象。DR的發(fā)生是由于眼內(nèi)血管內(nèi)血液成分的變化，所引起的視網(wǎng)膜的病變。雖然淚液并不直接與視網(wǎng)膜接觸，但血液成分的變化也可能影響淚腺的分泌，從而造成淚液成分的改變。有研究指出，DR患者淚液中的載脂蛋白A-1[22]、糖化終產(chǎn)物[23]、氨基多糖[24]等物質(zhì)表達上調(diào)。Aass[25]等通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在淚液中鑒定出了1526種蛋白質(zhì)。 Nguyen-Khuong[26]等用LC-ESI-IT-MS和串聯(lián)MS技術(shù)對DR組及對照組淚液蛋白中的糖基化修飾進行分析，發(fā)現(xiàn)兩組中的聚糖結(jié)構(gòu)大多保守，只有一些低豐度蛋白質(zhì)發(fā)生N-糖基化修飾，在DM與DR的發(fā)病中也恰巧存在N-糖基化修飾。這能為尋找提示DR的診斷及進展的生物標志物提供依據(jù)。

6.唾液中的生物分子標志物：除了淚液以外，唾液也具有取材方便、非侵入性等特點。唾液由唾液腺、口腔黏膜、牙周組織及口腔微生物共同參與分泌，能為唾液腺疾病、口腔疾病甚至系統(tǒng)性疾病提供診斷依據(jù)。Castagnola[27]等發(fā)現(xiàn)唾液中存在某些生物標志物能反映患者健康及疾病的狀態(tài)。Chee[28]等用iTRAQ技術(shù)及LC-MS技術(shù)對唾液進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定出了315種蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其中119種在NPDR組及PDR組中發(fā)生了差異性表達，它們與多種生物途徑有關(guān)，說明DR的發(fā)病是多種機制相互作用的結(jié)果(見表1)。

三、結(jié)語

2030年，DR患者及嚴重視力損害的DR患者數(shù)量將可能分別達到1億9100萬及5630萬[29]。 然而以上所提到的這些生物標志物，并沒有像糖化血紅蛋白一樣應(yīng)用于臨床。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)展迅速，廣泛地應(yīng)用于各個領(lǐng)域。運用蛋白質(zhì)組學(xué)尋找DR組與對照組中的差異蛋白，能更好的闡述DR的發(fā)病機制，有助于DR的早期預(yù)警。大規(guī)模以及多中心研究將能更客觀地為DR找到生物標志物，從而為改善DR的預(yù)后提供幫助。

[1] Pettitt DJ, Talton J, Dabelea D,et al. Prevalence of diabetes in U.S. youth in 2009: the SEARCH for diabetes in youth study.Diabetes Care，2014，37：402-408.

[2] Wilkins MR,Sanchez JC,Gooley AA,et al. Progress with proteome projects: why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it. Biotechnol Genet Eng Rev，1996，13：19-50.

[3] 董書偉，李巍，嚴作廷,等．蛋白質(zhì)組學(xué)及其在奶牛蹄葉炎研究中的應(yīng)用前景.動物醫(yī)學(xué)進展, 2012,33:174-178.

[4] 尹穩(wěn)，伏旭，李平. 蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用研究進展. 生物技術(shù)通報,2014,25：32-38.

[5] Sandra M，Paul D,Kay O. Comparative skeletal muscle proteomics using two-dimensional gel electrophoresis.Proteomics,2016,4:27.

[6] Callesen AK,Madsen JS,Vach W,et al. Serum protein profiling by solid phase extraction and mass spectrometry: a future diagnostics tool?.Proteomics,2009,9:1428-1441.

[7] 應(yīng)萬濤，錢小紅.生物質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用及進展.軍事醫(yī)學(xué)院院刊，2000，30：146-150.

[8] Jiao J,Wang S,Zhang R,et al.iTRAQ-based quantitative proteomics discovering potential serum biomarkers in locoweed poisoned rabbits. Chem Biol Interact,2017, 268:111-118.

[9] Nú?ez EV, Guest PC, Martins-de-Souza D,et al.Application of iTRAQ shotgun proteomics for measurement of brain proteins in studies of psychiatric disorders. Adv Exp Med Biol,2017, 974:219-227.

[10] Zhu W,Smith JW,Huang CM,Mass spectrometry-based label-free quantitative proteomics. J Biomed Biotechnol, 2010 :8.

[11] Takada M, Ban Y, Yamamoto G,et al. Periostin, discovered by nano-flow liquid chromatography and mass spectrometry, is a novel marker of diabetic retinopathy, Biochem. Biophys. Res Commun,2010,399：221-226.

[12] Angi M,Kalirai H,Coupland SE,et al. Proteomic analyses of the vitreous humour. Mediators Inflamm,2012：2012.

[13] Sirpa L, Helka N,Fitsum T,et al,Quantitative proteomics analysis of vitreous humor from diabetic retinopathy patients. Proteome Res, 2015, 14:51315143.

[14] Chiang SY, Tsai ML, Wang CY, et al.Proteomic analysis and identification of aqueous humor proteins with a pathophysiological rolein diabetic retinopathy. J Proteomics.,2012,75:2950-2959.

[15] Grigsby JG, Cardona SM, Pouw CE, et al.The role of microglia in diabetic retinopathy. J Ophthalmol,2014:705783.

[16] Vujosevic S,Micera A,Bini S,et al. Proteome analysis of retinal glia cells-related inflammatory cytokines in the aqueous humourof diabetic patients. Acta Ophthalmol.,2016,94:56-64.

[17] Mohamed Q, Gillies MC, Wong TY. Management of diabetic retinopathy: a systematic review. JAMA, 2007，298:902-916.

[18] Song J, Chen S, Liu X,et al. Relationship between C-reactive protein level and diabetic retinopathy: a systematic review and meta-analysis. PLoS One, 2015,10.

[19] Xu C, Wu Y, Liu G,et al. Relationship between homocysteine level and diabetic retinopathy: a systematic review and meta-analy. Diagn Pathol,2014,9:167.

[20] Gopalakrishnan V, Purushothaman P, Bhaskar A. Proteomic analysis of plasma proteins in diabetic retinopathy patients by two dimensional electrophoresis and MALDI-TOf-MS. J Diabetes Complicat,2015,29:928-936.

[21] Yeh SH, Chang WC, Chuang H,et al.Differentiation of type 2 diabetes mellitus with different complications by proteomic analysis of plasma low abundance proteins. J Diabetes Metab Disord,2016,15：24.

[22] Kawai S, Nakajima T, Hokari S,et al.Apolipoprotein A-I concentration in tears in diabetic retinopathy.Ann Clin Biochem, 2002,39:56-61.

[23] Zhao Z, Liu J, Shi B,et al. Advanced glycation end product(AGE)modified proteins in tears of diabetic patients. Mol Vis, 2010,16:1576-1584.

[24] Moschos MM, Rouvas AA, Papadimitriou S,et al.Apostolopoulos M. Quantitative determination of glycosaminoglycans in tears of diabetic patients. Clin Ophthalmol,2008,2:581-584.

[25] Aass C, Norheim I, Eriksen EF,et al. Single unit filter-aided method for fast proteomic analysis of tear fluid. Anal Biochem,2015;480:1-5.

[26] Nguyen-Khuong T, Everest-Dass AV, Kautto L, et al.Packer NH.Glycomic characterization of basal tears and changes with diabetes and diabetic retinopathy. Glycobiology,2015,25:269-283.

[27] Castagnola M,Picciotti PM,Messana I,et al.Potential applications of human saliva as diagnostic fluid. Acta Otorhinolaryngol Ital,2011,3:347-357.

[28] Chee CS, Chang KM, Loke MF,et al. Association of potential salivary biomarkers with diabetic retinopathy and its severity in type-2 diabetes mellitus:a proteomic analysis by mass spectrometry.Peer J,2016,12;4:e2022.

[29] International Diabetes Federation.Diabetesatlas.6thed.Brussels:International Diabetes Federationm,2015.