特發(fā)性膜性腎病靶抗原及其自身抗體研究的新進(jìn)展

田彩霞 裘宇容

·綜述·

特發(fā)性膜性腎病靶抗原及其自身抗體研究的新進(jìn)展

田彩霞 裘宇容

膜性腎病(membranous nephropathy，MN)是一種以上皮下免疫復(fù)合物沉積為主，伴有尿蛋白排出增加為特征的腎小球疾病，是成人腎病綜合征的主要原因。該疾病影響各年齡段、各民族和種族，且在男性中更常見(男女發(fā)病比為2.1)，發(fā)病高峰年齡在40～60歲。在歐洲，成人MN每年發(fā)病率為十萬分之一，每年大約一萬新發(fā)病例[1]。在中國，MN占原發(fā)性腎小球疾病的比例逐漸升高，從2003年14.84%到2012的37.68%[2]。MN在沒有任何誘發(fā)因素下發(fā)生的自身免疫性腎小球疾病為特發(fā)性膜性腎病(idiopathic Membranous nephropathy，IMN)大約占總MN的70%～80%，另外的20%～30%的MN繼發(fā)于其他疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡，乙型、丙型肝炎或梅毒感染，藥物中毒或惡性腫瘤[3]。

既往的研究報(bào)道了中性肽鏈內(nèi)切酶，陽離子化牛血清白蛋白，α-烯醇化酶，醛糖還原酶和超氧化物歧化酶等是某些MN的靶抗原[4]。近年來，通過特異性自身免疫性反應(yīng)，人們認(rèn)識(shí)了新的足細(xì)胞靶抗原和相應(yīng)的自身抗體。在2009年和2014年，基于腎小球顯微解剖技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和質(zhì)譜分析技術(shù)，兩種IMN的抗原靶點(diǎn)被確認(rèn)——M型磷脂酶A2受體(M-type phospholipase A2 receptor，PLA2R)和1型血小板反應(yīng)蛋白7A域(trombospondin type-1 domaincontaining 7A，THSD7A)[5-6]。本文將IMN相關(guān)的這兩種抗原和自身抗體的研究進(jìn)展綜述如下。

一、PLA2R及其與IMN的病理機(jī)制

PLA2R屬于1型跨膜糖蛋白，是甘露糖受體家族成員之一，含有一個(gè)細(xì)胞外糖基化區(qū)域，由N端富含半胱氨酸的區(qū)域(CysR)、II型纖連蛋白樣區(qū)域(FnII)和8～10個(gè)C型凝集素樣區(qū)域(CTLD)三部分組成，介導(dǎo)了一系列生物活性，如誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和脂質(zhì)的生成。Fresquet等[7]描述了位于CysR、FnII、CTLD3、CTLD 1/2和CTLD 2/3之間的八個(gè)肽段，可作為潛在的PLA2R主要抗原表位的組成部分。這些肽并非連續(xù)貫穿在PLA2R的一級(jí)結(jié)構(gòu)，而是通過二硫鍵相互靠近，形成抗原表位的三維形態(tài)特征。而Kao等[8]首次確認(rèn)了PLA2R的免疫優(yōu)勢(shì)表位位于CysR-FnII-CTLD1區(qū)，缺乏CysR 或者 CTLD1區(qū)域會(huì)使剩下的片段失去抗原性，CTLD1在保持抗原表位的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面很重要。

IMN患者免疫反應(yīng)的主要特征是Th2淋巴細(xì)胞廣泛激活，然后產(chǎn)生某些細(xì)胞因子，尤其是IL-4，IL-10和 IL- 13。IL-4接下來激活B淋巴細(xì)胞合成IgG4，IgG4是IMN患者主要的免疫球蛋白亞型。IgG4與足細(xì)胞表面的PLA2R1的構(gòu)型表位結(jié)合，形成典型的上皮下免疫復(fù)合物。

免疫復(fù)合物的形成和聚集通過補(bǔ)體依耐的途徑打破了腎小球?yàn)V過屏障的功能完整性，IgG4抗PLA2R抗體含有缺乏半乳糖的側(cè)鏈，N-乙酰氨基葡萄糖可以在終端位置暴露并激活甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)，因此推測(cè)補(bǔ)體激活的MBL途徑是主要的。Lhotta等[9]確認(rèn)了MBL途徑在MN患者中的作用。MBL激活兩個(gè)絲氨酸蛋白酶(MASP 1/2，MBL相關(guān)的絲氨酸蛋白酶)，其作用類似C1r和C1s，可裂解C4和C2。C4b和C2a結(jié)合在一起形成C3轉(zhuǎn)化酶，如同經(jīng)典的通路，最終導(dǎo)致膜攻擊復(fù)合物的形成。然而，不是所有情況下IMN均由MBL途徑激活補(bǔ)體。Debiec等[10]描述了一位腎移植13 d后IMN復(fù)發(fā)的患者，腎臟穿刺活檢檢測(cè)提示存在典型的C3, C5bC9, C1q和IgG3的染色顆粒，但是沒有 MBL或IgG4染色顆粒，在這種特殊情況下，MN主要由補(bǔ)體經(jīng)典途徑激活。

膜攻擊復(fù)合物插入到足細(xì)胞膜后，被足細(xì)胞吞噬并激活足細(xì)胞，繼而發(fā)生一系列的不良反應(yīng)，如生成大量活性氧，細(xì)胞外基質(zhì)增多，足細(xì)胞骨架改變，足細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腎小球基底膜的功能改變，破壞腎小球?yàn)V過屏障的完整性，從而產(chǎn)生大量蛋白尿。

1.抗PLA2R自身抗體作為診斷IMN的特異性指標(biāo) 2009年，Beck等[5]報(bào)道了表達(dá)于足細(xì)胞表面的PLA2R可作為IMN的靶抗原，隨后大量的文獻(xiàn)對(duì)循環(huán)中抗PLA2R自身抗體進(jìn)行研究，確認(rèn)PLA2R是成人IMN的主要目標(biāo)抗原，對(duì)于IMN，抗PLA2R自身抗體具有很高的特異性，循環(huán)中，抗PLA2R抗體在約70%的IMN患者可檢測(cè)出來，其他腎病或者自身免疫性疾病或者正常人群均未檢測(cè)到抗PLA2R抗體，在繼發(fā)性MN中陽性頻率非常低[11]。

最近幾年的研究表明抗PLA2R抗體是診斷IMN的特異的和敏感的生物標(biāo)志物，抗 PLA2R自身抗體的檢測(cè)對(duì)區(qū)分原發(fā)性MN和繼發(fā)性MN有非常重要的作用。

腎穿刺組織樣本免疫沉積物中的PLA2R抗原的檢測(cè)也為診斷IMN提供了線索。當(dāng)循環(huán)抗體陰性時(shí)，同樣可以檢測(cè)到免疫沉積物中的抗原。在某些患者，循環(huán)抗PLA2R抗體與PLA2R沉積沒有相關(guān)性，沉積物中PLA2R抗原陽性經(jīng)常見于活動(dòng)性結(jié)節(jié)病或乙肝病毒感染相關(guān)性MN[12]。因此診斷IMN時(shí)，應(yīng)結(jié)合血清學(xué)和活檢分析。在最近的一個(gè)包含了1 160例患者的薈萃分析[13]數(shù)據(jù)顯示：血清抗PLA2R抗體總的靈敏度、特異性、診斷優(yōu)勢(shì)比和受試者工作特征曲線下面積分別為68% (95% CI，0.61-0.74)，97% (95% CI，0.85-1.00)，73.75 (95% CI，12.56-432.96) 和 82% (95% CI，0.78-0.85)，腎小球PLA2R 染色的總的靈敏度、特異性、診斷優(yōu)勢(shì)比和受試者工作特征曲線下面積分別為78%(95% CI，0.72-0.83)，91% (95% CI，0.75-0.97)，34.70 (95% CI，9.93-121.30) 和84% (95% CI，0.81-0.87)，血清學(xué)抗PLA2R抗體檢測(cè)具有診斷價(jià)值，血清抗PLA2R抗體陰性時(shí)，推薦行組織PLA2R染色。另一個(gè)來自15個(gè)研究的包含2 212位患者的薈萃分析[14]數(shù)據(jù)表明，抗PLA2R抗體的靈敏度為78% (95% CI，0.66-0.87)，特異性為99% (95% CI，0.96-1)。

循環(huán)中抗PLA2R抗體檢測(cè)試劑盒的開發(fā)以及臨床運(yùn)用實(shí)踐發(fā)展迅速，來自歐蒙的兩款標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)試劑盒已運(yùn)用于臨床，非常適合常規(guī)診斷，一個(gè)是間接免疫熒光檢測(cè)，另一個(gè)是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。間接免疫熒光檢測(cè)基于轉(zhuǎn)染人長(zhǎng)段PLA2R cDNA并包被在HEK293細(xì)胞上的生物芯片技術(shù)[15]。

基于人PLA2R細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的酶聯(lián)免疫度吸附試驗(yàn)試劑盒能定量并快速檢測(cè)抗PLA2R抗體，與免疫熒光法有很好的相關(guān)性[16]。在一項(xiàng)275例穿刺確診IMN的隊(duì)列研究中[15]，使用ELISA方法，抗PLA2R自身抗體特異性可達(dá)到100%，靈敏度可以達(dá)到77%。

2.抗PLA2R自身抗體可監(jiān)測(cè)疾病的活動(dòng)性 Beck等[5]人首次描述了抗PLA2R抗體和IMN活動(dòng)性之間存在密切關(guān)系，隨后一些研究也證實(shí)，抗PLA2R抗體和IMN活動(dòng)性指標(biāo)如尿蛋白、血清白蛋白水平之間存在相關(guān)性，抗體水平升高，表示尿蛋白濃度增加，尿蛋白減低往往在抗體濃度減低之后[17]。在一篇來自意大利腎病中心實(shí)驗(yàn)室的系統(tǒng)性回顧分析性文章中，通過縱向設(shè)計(jì)，分析了PLA2R的變化與PLA2R陽性IMN患者臨床進(jìn)展的相關(guān)性[18]，他們發(fā)現(xiàn)PLA2R抗體的降低與尿蛋白的含量成正相關(guān)，與血清白蛋白的含量成負(fù)相關(guān)。抗PLA2R自身抗體水平與IMN患者疾病活動(dòng)性相關(guān)。

根據(jù)抗PLA2R抗體的滴度可以預(yù)測(cè)患者處于活動(dòng)性或部分緩解還是完全緩解。疾病的活動(dòng)期抗體水平高，自發(fā)緩解或治療緩解后，則抗體水平降低，疾病復(fù)發(fā)則抗體濃度再次增加[19]。此外，抗PLA2R抗體水平與腎損傷指標(biāo)，如尿β2-微球蛋白、尿IgG、血清肌酐呈正相關(guān)，進(jìn)一步支持血清抗PLA2R抗體效價(jià)與疾病活動(dòng)性的相關(guān)。

3.抗PLA2R自身抗體可預(yù)測(cè)疾病預(yù)后 通常，IMN可以自發(fā)緩解或者表現(xiàn)為持續(xù)性蛋白尿而無腎功能損傷，但是30%～40%的患者可以在數(shù)年內(nèi)發(fā)展為終末期腎病。自身抗體濃度的檢測(cè)也可以預(yù)測(cè)臨床結(jié)果：在一個(gè)多中心的回顧性研究[20]中，包括了133例未接受免疫抑制劑治療的IMN患者，經(jīng)免疫抑制劑治療3個(gè)月后，抗PLA2R自身抗體降低了81%，同時(shí)蛋白尿降低了39%。經(jīng)12個(gè)月治療后蛋白尿得到緩解的患者的抗PLA2R自身抗體最初水平與那些蛋白尿未緩解的患者相比，顯著降低。因此，具有較高效價(jià)抗PLA2R 抗體的患者提示疾病處于活動(dòng)期，不可能自發(fā)緩解，他們可能受益于早期及時(shí)使用免疫抑制劑方案。

抗體水平可預(yù)測(cè)預(yù)后，高滴度與復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，與非腎病患者的發(fā)生腎病綜合征高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，并與腎功能惡化相關(guān)[21]。在另一份報(bào)告中，高抗PLA2R 抗體患者無論是自發(fā)或治療后都不易緩解，抗體的效價(jià)成為無法緩解的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[22]。抗PLA2R抗體還是敏感的提示治療效果的標(biāo)志物?？筆LA2R抗體部分或完全消失預(yù)測(cè)腎在數(shù)周或數(shù)月可恢復(fù)，抗體的重新出現(xiàn)或升高預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)[23]。

據(jù)報(bào)道，抗PLA2R自身抗體在評(píng)估腎臟移植后IMN復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)有一定作用[24]。大于40%的IMN患者經(jīng)腎移植后，可復(fù)發(fā)。如果抗PLA2R自身抗體在器官移植后6個(gè)月內(nèi)持續(xù)表達(dá)，那么腎移植后IMN復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)非常高[25]。因此，自身抗體水平的檢測(cè)，在評(píng)估移植后免疫抑制劑治療的必要性和強(qiáng)制性方面是有用的。除了鑒別診斷IMN，抗PLA2R自身抗體還可以評(píng)估疾病的活動(dòng)度和預(yù)測(cè)疾病轉(zhuǎn)歸的靈敏度，同時(shí)可預(yù)測(cè)腎移植后IMN復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。另外，也有益于治療策略的選擇和治療效果的監(jiān)測(cè)。

4.抗PLA2R自身抗體可指導(dǎo)治療 抗PLA2R 自身抗體檢測(cè)標(biāo)志著IMN患者的個(gè)性化醫(yī)療管理的開始，抗體滴度高的患者，從開始使用免疫抑制劑治療到緩解的時(shí)間間隔顯著延長(zhǎng)[26]?？贵w滴度下降后，蛋白尿仍然持續(xù)數(shù)月，延遲的臨床反應(yīng)可能是由于恢復(fù)腎小球基底膜功能完整性，如清除免疫復(fù)合物，足細(xì)胞的恢復(fù)需要時(shí)間。

通過測(cè)定抗PLA2R抗體效價(jià)，可獲得與疾病的免疫活性相關(guān)的信息，并可用于監(jiān)測(cè)IMN的治療效果。在這方面，Beck等[27]對(duì)35例使用利妥昔單抗治療后的患者做了遠(yuǎn)期療效評(píng)價(jià)，經(jīng)過12個(gè)月的治療，抗體轉(zhuǎn)陰的患者59%病情完全或部分緩解，而抗體持續(xù)陽性的患者無一人緩解，經(jīng)24個(gè)月治療后，抗體轉(zhuǎn)陰的患者88%病情完全或部分緩解，而抗體持續(xù)陽性的患者33% 完全或部分緩解。同樣，Bech等[28]觀察到在完成免疫抑制劑治療的患者，抗體水平可預(yù)測(cè)長(zhǎng)期治療的效果：在治療結(jié)束時(shí)，抗體陰性的患58%在之后5年，病情處于持續(xù)緩解狀態(tài)。因此，抗PLA2R抗體檢測(cè)在評(píng)估IMN患者對(duì)治療的反應(yīng)性和預(yù)測(cè)遠(yuǎn)期效果方面是有意義的?？筆LA2R抗體滴度可能成為疾病結(jié)果和藥物反應(yīng)的預(yù)測(cè)指標(biāo)，通過抗PLA2R抗體的檢測(cè)，選擇一種有效的治療手段，可限制患者暴露于毒性藥物，而不影響治療效果，且降低治療費(fèi)用。

有學(xué)者提出應(yīng)該修改“改善全球腎臟病預(yù)后組織的指南”，在診斷IMN時(shí)應(yīng)包括抗PLA2R抗體檢測(cè)。推薦在開始使用免疫抑制劑治療之前，抗體每?jī)蓚€(gè)月檢測(cè)一次，對(duì)進(jìn)入免疫緩解的患者可避免不必要的治療。在使用免疫抑制劑治療的頭6個(gè)月每月檢測(cè)一次抗PLA2R抗體。

抗PLA2R抗體檢測(cè)應(yīng)用到臨床實(shí)踐很有必要，但是抗PLA2R 抗體滴度的臨界值仍有待確定。總之，抗PLA2R抗體的測(cè)定是一個(gè)有用的工具，抗PLA2R抗體陽性，且通過臨床體檢和實(shí)驗(yàn)室檢查能夠確定IMN的患者，原則上可以避免腎穿刺活檢，為患者減少痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，國家應(yīng)該盡快增補(bǔ)抗PLA2R抗體的物價(jià)收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)，讓更多的醫(yī)院能夠合法地開展抗PLA2R抗體的檢查，讓IMN患者受益。

本課題組用兩種方法檢測(cè)血清抗PLA2R抗體，在中國人群中驗(yàn)證了抗PLA2R抗體可以作為原發(fā)性膜性腎病的敏感的特異性指標(biāo)，并且抗PLA2R抗體濃度與腎性蛋白尿濃度密切相關(guān)，可以作為監(jiān)測(cè)膜性腎病活動(dòng)性的理想指標(biāo)[29]。

二、抗THSD7A 自身抗體

2014年，Tomas等[6]發(fā)現(xiàn)15例(大約2.5%～5%)IMN患者的血清中存在針對(duì)1型血小板反應(yīng)蛋白7A域(THSD7A)的循環(huán)抗體，并且證實(shí)THSD7A是參與成人IMN發(fā)病的第二個(gè)靶抗原，針對(duì)這個(gè)抗原的循環(huán)自身抗體在5%～10%的抗PLA2R陰性的IMN患者中被檢測(cè)到。

THSD7A與PLA2R結(jié)構(gòu)和生化特性類似，含有一個(gè)由許多重復(fù)的二硫鍵所組成的大型胞內(nèi)區(qū)域和N-糖基化區(qū)域，表達(dá)于足細(xì)胞膜上，并且只有在非還原狀態(tài)下才與血清抗體發(fā)生反應(yīng)。為了確定抗THSD7A抗體的IgG亞型，研究者使用了針對(duì)IgG1-IgG4的第二抗體。發(fā)現(xiàn)雖然其它IgG亞型在大多數(shù)血清樣本中有微弱表達(dá)，但I(xiàn)gG4才是抗THSD7A抗體的主要亞型。在血清抗THSD7A抗體陽性的IMN患者的腎活檢樣本中也發(fā)現(xiàn)THSD7A與IgG4共定位。

有趣的是，血清THSD7A抗體全部表達(dá)于抗PLA2R抗體陰性的患者，這些患者代表著一種獨(dú)特的疾病亞型?；颊邔?duì)PLA2R或者THSD7A產(chǎn)生自身免疫，而不是同時(shí)產(chǎn)生，這表明PLA2R和THSD7A相關(guān)的IMN是兩種獨(dú)立的分子實(shí)體，這些抗原在該疾病是主要抗原。研究者比較了其各自陽性患者的臨床特點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)兩組患者在年齡，尿蛋白水平，血清白蛋白，血肌酐和診斷后6個(gè)月內(nèi)對(duì)免疫抑制治療的反應(yīng)之間無顯著性差異。但是抗THSD7A抗體陽性組的女性患者更多(65% vs 27%)，因?yàn)闃颖玖啃?，這一結(jié)論尚存在偏倚。

Iwakura等[30]報(bào)道了THSD7A在日本IMN患者中腎穿刺樣本中的表達(dá)水平，9.1%(5例)IMN患者THSD7A陽性，且均來自PLA2R陰性的IMN患者。隨后，Hoxha[31]在198例IMN患者發(fā)現(xiàn)4例THSD7A抗體陽性，157例PLA2R抗體陽性，無患者兩種抗體均陽性?？筎HSD7A抗體可作為抗PLA2R抗體陰性的IMN患者的診斷指標(biāo)，特異性100%，與抗PLA2R自身抗體類似，抗THSD7A自身抗體水平與疾病活動(dòng)性的關(guān)系被證實(shí)。且抗THSD7A和PLA2R抗體均陰性的患者有較好的預(yù)后。

然而，2016年，Larsen等[32]報(bào)道了THSD7A和PLA2R并非相互排斥的，發(fā)現(xiàn)2例IMN患者腎臟穿刺組織同時(shí)檢測(cè)到THSD7A和PLA2R抗原，血清中也同時(shí)出現(xiàn)抗THSD7A和PLA2R自身抗體，推測(cè)其中一個(gè)自身抗體可能是足細(xì)胞抗原暴露于疾病后形成的機(jī)會(huì)致病性抗體，或者兩種抗原均有致病性，某些患者從基因水平上易于產(chǎn)生兩種抗體。

三、展望

目前自身抗體作為IMN的診斷的發(fā)展包括抗PLA2R 和THSD7A。基于THSD7A的間接免疫熒光檢測(cè)試劑盒目前正在研究，不久的將來也可運(yùn)用于臨床，然而在中國人群廣泛開展抗PLA2R 和THSD7A自身抗體的檢測(cè)還有很長(zhǎng)的一段路要走，一方面，政府要盡快制定物價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，另一方面，研究者要提供中國人群抗PLA2R 和THSD7A自身抗體聯(lián)合診斷IMN的靈敏度和特異性。此外，目前仍有部分 IMN 患者的靶抗原未明確， 尋找靶抗原及相應(yīng)抗體的研究仍有必要繼續(xù)進(jìn)行。

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2016-07-19

2016-11-25)

湖北省衛(wèi)生計(jì)生委面上項(xiàng)目(No.WJ2017M217)

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.09.014

442000 十堰，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院檢驗(yàn)科(田彩霞)；510515 廣州，南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院檢驗(yàn)科(田彩霞，裘宇容)

裘宇容，E-mail: qiuyuronggz@126.com