酸性氧化電位水對(duì)銅綠假單胞菌的殺菌機(jī)制研究

趙凱麗，李武平，張曉娜，王 剛，莊玉晨

(1. 第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，陜西 西安 710032; 2. 第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院，陜西 西安 710032)

·論著·

酸性氧化電位水對(duì)銅綠假單胞菌的殺菌機(jī)制研究

趙凱麗1，李武平1，張曉娜1，王 剛2，莊玉晨2

(1. 第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，陜西 西安 710032; 2. 第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院，陜西 西安 710032)

目的 探討酸性氧化電位水(EOW)對(duì)銅綠假單胞菌的殺菌機(jī)制。方法 以銅綠假單胞菌作為研究對(duì)象，從蛋白質(zhì)滲漏，核酸和細(xì)胞膜鈣離子通透性等方面對(duì)EOW的殺菌機(jī)制進(jìn)行研究，同時(shí)以2%戊二醛作為陽(yáng)性對(duì)照組，以生理鹽水(NS)作為陰性對(duì)照組。結(jié)果 以EOW、2%戊二醛對(duì)銅綠假單胞菌作用30 s殺滅率>99.99%，作用60 s殺滅率可達(dá)100.00%。EOW、NS、2%戊二醛作用銅綠假單胞菌60 s后，經(jīng)BCA法檢測(cè)蛋白滲漏，分別為(96.00±7.42)、(94.15±7.49)、(216.97±10.35)μg/mL，總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=613.20，P<0.01)，2%戊二醛組高于EOW組、NS組；蛋白滲漏量不隨作用時(shí)間增加而改變(均P>0.05)。隨機(jī)多態(tài)性擴(kuò)增DNA電泳圖譜顯示，EOW組與NS組均在500～1 000 kb間顯示亮度較高的密集條帶，2%戊二醛組無擴(kuò)增條帶。EOW及2%戊二醛作用后鈣離子熒光強(qiáng)度均低于NS組。結(jié)論 EOW可能的殺菌機(jī)制是使銅綠假單胞菌細(xì)胞膜通透性受到一定程度的損傷，致使 Ca2+泄漏，但未能造成蛋白質(zhì)泄漏，對(duì)其核酸損傷作用不明顯，DNA可能并非EOW殺菌靶點(diǎn)。

酸性氧化電位水；戊二醛；銅綠假單胞菌；殺菌機(jī)制；蛋白質(zhì)泄漏；核酸；細(xì)胞膜通透性

[Chin J Infect Control，2017，16(1)：41-45]

酸性氧化電位水(electrolyzed oxidizing water，EOW)自1987年由日本研發(fā)問世后，其以安全、高效、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，在抗感染方面，包括國(guó)內(nèi)外醫(yī)療，食品等領(lǐng)域均發(fā)揮了顯著效果。以往對(duì)于EOW殺菌機(jī)制的研究主要側(cè)重于某一理化性質(zhì)，認(rèn)為EOW中起主導(dǎo)作用的殺菌因素包括低酸性，高氧化還原電位ORP，活性氧以及有效氯[1]，其中有效氯起主導(dǎo)作用。EOW 使細(xì)菌胞壁皺縮降解，進(jìn)而胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)變性酶失活[2]；抑制了細(xì)胞呼吸作用，降低了細(xì)胞膜上的Na+/K+-ATP 酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄漏[3]。關(guān)于EOW殺菌機(jī)制尚無統(tǒng)一定論，存在爭(zhēng)議，還需進(jìn)一步深入研究。本實(shí)驗(yàn)以銅綠假單胞菌作為研究對(duì)象，從蛋白質(zhì)滲漏，核酸和細(xì)胞膜鈣離子通透性等方面對(duì)EOW的殺菌機(jī)制進(jìn)行研究，同時(shí)以2%戊二醛作為陽(yáng)性對(duì)照組，以生理鹽水(normal saline，NS)作為陰性對(duì)照組進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 銅綠假單胞菌ATCC 15442由第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。EOW由酸性氧化電位水生成器日本圣太科(規(guī)格型號(hào)SONTECH-1000)生成，2%戊二醛購(gòu)于山東利爾康有限公司，SX-610型筆式pH計(jì)和ORP檢測(cè)筆，有效氯檢測(cè)儀SJ/S-CL501C，天根細(xì)菌DNA提取試劑盒，天根BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒，隨機(jī)引物序列設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[4]，為5’-AGCGGGCCAA-3’，由上海生工生物工程有限公司合成引物，普通 PCR儀MyCycler，cwbio2×Taq MasterMix購(gòu)于北京康為世紀(jì)，碧云天生物技術(shù)Fluo-3 AM(鈣離子熒光探針)，酶標(biāo)儀Model680，紫外分光度計(jì)DU-530。圖像處理采用image J軟件。

1.2 中和劑鑒定試驗(yàn) 試驗(yàn)菌銅綠假單胞菌為ATCC 15442，EOW中和劑為1%硫代硫酸鈉，2%戊二醛中和劑為甘氨酸+吐溫100+卵磷脂，中和劑均用PBS配制后經(jīng)高壓蒸汽滅菌，進(jìn)行中和劑鑒定。根據(jù)2002版《消毒技術(shù)規(guī)范》試驗(yàn)平行設(shè)置6組。

1.3 殺菌效果測(cè)定 取24 h細(xì)菌新鮮培養(yǎng)液，配制試驗(yàn)用菌懸液，取 1 mL菌懸液加入至9 mL消毒劑中，混勻，分別作用60、120 s后，立即取1 mL混合液加入到9 mL中和劑中作用10 min，對(duì)照組用NS進(jìn)行同樣操作。吸取0.2 mL采用平板傾注計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定，TSA培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 蛋白滲漏量測(cè)定

1.4.1 樣本制備 配制實(shí)驗(yàn)用菌懸液，取4支無菌試管中分別加入0.5 mL菌懸液，試驗(yàn)組分別加入4.5 mL EOW(pH=2.7)、2%戊二醛及NS，作用至預(yù)定時(shí)間后，分別經(jīng)φ=0.22 μm微孔濾過膜濾過，取濾液備用。

1.4.2 二喹啉甲酸法(BCA法)標(biāo)準(zhǔn)蛋白配制及測(cè)定 參照天根BCA蛋白定量試劑盒說明書：(1)用NS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；(2)根據(jù)樣本數(shù)量按50∶1配制BCA工作液，充分混勻；(3)吸取25 μL BSA標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)細(xì)菌濾液加入到96孔板；(4)每孔加入220 μL BCA工作液，混勻，加蓋37℃孵育30 min后冷卻至室溫，酶標(biāo)儀檢測(cè)562 nm處吸光度。(5)以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算3組蛋白滲漏量。

1.5 對(duì)銅綠假單胞菌DNA的作用

1.5.1 對(duì)銅綠假單胞菌提純DNA的作用 DNA樣本制備：取24 h新鮮細(xì)菌培養(yǎng)液，參照天根細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取。取1 μL 提純DNA，分別加入至9 μL EOW、2%戊二醛、NS中作用60 s，迅速加入至90 μL 中和劑混勻，作用10 min備用。

1.5.2 銅綠假單胞菌隨機(jī)多態(tài)性擴(kuò)增 隨機(jī)引物5’-AGCGGGCCAA-3’，10 μL 反應(yīng)體系：引物2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 1 μL，Taq MasterMix 6 μL；擴(kuò)增條件：94℃ 2.5 min，變性94℃45 s，退火41℃ 1 min，延伸72℃ 1.5 min，共30個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min，擴(kuò)增完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 對(duì)銅綠假單胞菌細(xì)胞膜通透性的作用 制備菌懸液，取100 μL 分別加入至900 μL EOW、2%戊二醛及NS中混勻，作用60 s后取混合液100 μL 分別加入到900 μL 中和劑中作用10 min，每管避光加1 μL 熒光探針Fluo-3AM，使其終濃度5 μmol/L，震蕩混勻后置于37℃恒溫箱孵育45 min進(jìn)行探針裝載，裝載完成后將各管離心8 000 r/min，3 min，棄上清后加入1 000 μL 無菌PBS緩沖液漂洗2次，進(jìn)行激光共聚焦觀察。

2 結(jié)果

2.1 中和劑鑒定結(jié)果 中和劑鑒定結(jié)果顯示，第1組無菌生長(zhǎng)，第2組菌落生長(zhǎng)較第1組多，第3、4、5組菌落生長(zhǎng)數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第6組無菌生長(zhǎng)。EOW組間菌落數(shù)誤差率為9.112%，2%戊二醛組間菌落誤差率為9.086%，中和劑鑒定合格。見表1。

2.2 殺菌試驗(yàn)結(jié)果 以EOW(pH=2.7，有效氯含量40 mg/L)及2%戊二醛對(duì)銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 15442作用30 s殺滅率>99.99%，作用60 s殺滅率可達(dá)100.00%，兩種消毒劑對(duì)銅綠假單胞菌殺菌效果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。NS對(duì)照組平均菌落數(shù)為20.20×106CFU/mL。

表1 不同組別中和劑鑒定結(jié)果(平均回收菌落數(shù)，×106CFU/mL)

Table 1 Identification results of neutralizer in different groups (Average number of recovered bacteria, ×106CFU/mL)

實(shí)驗(yàn)分組EOW組2%戊二醛組第1組:消毒劑+菌懸液00第2組:(消毒劑+菌懸液)+中和劑7.99.2第3組:中和劑+菌懸液21.920.1第4組:(消毒劑+中和劑)+菌懸液18.621.7第5組:稀釋液+菌懸液17.316.9第6組:稀釋液+中和劑+培養(yǎng)基00

2.3 蛋白質(zhì)滲漏測(cè)定結(jié)果 EOW、NS、2%戊二醛作用銅綠假單胞菌60 s后，經(jīng)BCA法檢測(cè)蛋白滲漏，分別為(96.00±7.42)、(94.15±7.49)、(216.97±10.35)μg/mL，總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=613.20，P<0.01)，2%戊二醛組高于EOW組、NS組。蛋白滲漏量不隨作用時(shí)間增加而改變(均P>0.05)。見表2、圖1～2。

表2 銅綠假單胞菌EOW、2%戊二醛及NS作用不同時(shí)間后蛋白滲漏情況±s，μg/mL)

***：表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ns：表示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

圖1 銅綠假單胞菌EOW、2%戊二醛及NS作用60 s后蛋白滲漏情況(μg/mL)

Figure 1 Protein leakage ofP.aeruginosaafter 60-second contact with EOW, 2% glutaraldehyde, and NS(μg/mL)

圖2 銅綠假單胞菌EOW、2%戊二醛及NS作用不同時(shí)間后蛋白滲漏情況

Figure 2 Protein leakage ofP.aeruginosaafter different contact time with EOW, 2% glutaraldehyde, and NS(μg/mL)

2.4 對(duì)銅綠假單胞菌DNA的作用結(jié)果 EOW作用于銅綠假單胞菌DNA 60 s后，經(jīng)擴(kuò)增后于電泳檢測(cè)兩組DNA指紋圖譜，均在500～1 000 kb間顯示亮度較高的密集條帶。2%戊二醛作用后的銅綠假單胞菌DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)無DNA條帶顯示。見圖3。

2.5 對(duì)銅綠假單胞菌作用后細(xì)胞膜鈣離子通透性測(cè)定結(jié)果 激光共聚焦結(jié)果顯示，EOW、2%戊二醛、NS處理后銅綠假單胞菌鈣離子熒光強(qiáng)度分別為40.50±4.42、47.63±3.77、1 903.75±16.12，總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=82 580，P<0.01)，EOW組、2%戊二醛組均低于NS組，僅散在分布于各視野。見圖4。

EOW：為酸性氧化電位水；GLU：為2%戊二醛；NS：為生理鹽水；編號(hào)1、2、3為三組樣本：M為分子量為2 000kb的DNAmarker

圖3 EOW、2%戊二醛及NS對(duì)銅綠假單胞菌DNA作用后PCR擴(kuò)增電泳圖譜

Figure 3 Electrophoresis map of PCR amplifiedP.aeruginosaDNA after contact with EOW, 2% glutaraldehyde, and NS

a:EOW;b:2%戊二醛;c:NS

3 討論

3.1 EOW對(duì)銅綠假單胞菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)滲漏的作用情況 EOW獨(dú)特的理化性質(zhì)(pH<3，高ORP>1 100 mv，低濃度有效氯30～60 mg/L)使其殺菌能力非單一因素所決定，文獻(xiàn)[5]已報(bào)道中性EOW滅菌效果未發(fā)生改變，而有效氯濃度改變很大程度影響了其滅菌效果。氯可氧化細(xì)菌-SH基，次氯酸鹽可與胞質(zhì)成分作用形成氮氯復(fù)合物干擾細(xì)胞代謝，而胞內(nèi)物質(zhì)的滲漏與細(xì)菌致死并無確切聯(lián)系[6]。銅綠假單胞菌屬革蘭陰性細(xì)菌，其細(xì)胞壁的外膜及細(xì)胞膜上均鑲嵌有蛋白質(zhì)大分子，并且胞膜內(nèi)包裹的細(xì)胞質(zhì)由水、蛋白質(zhì)、脂類、核酸及少量糖和無機(jī)鹽組成，若EOW使其細(xì)胞外膜破裂，則細(xì)菌濾液中會(huì)有蛋白質(zhì)滲漏[1]，通過BCA法檢測(cè)的蛋白質(zhì)滲漏量應(yīng)高于對(duì)照組，結(jié)果顯示，EOW作用60 s后與NS組相比蛋白滲漏差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而2%戊二醛組蛋白滲漏高于EOW及NS組，為排除作用時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響，于不同作用時(shí)間后經(jīng)BCA測(cè)定，結(jié)果顯示，3組蛋白質(zhì)滲漏量未呈現(xiàn)出隨時(shí)間改變趨勢(shì)，推測(cè)EOW的殺菌機(jī)制可能不是使細(xì)菌細(xì)胞壁細(xì)胞膜破裂蛋白大分子滲漏。

3.2 EOW對(duì)銅綠假單胞菌核酸的作用情況 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA，無需專門設(shè)計(jì)特定引物，由于隨機(jī)引物在較低的復(fù)性溫下能與基因組DNA非特異性的結(jié)合，當(dāng)相鄰兩個(gè)引物間DNA小于2 000 bp時(shí)，就能得到擴(kuò)增產(chǎn)物，可檢測(cè)由于堿基發(fā)生缺失、插入、突變、重排等所引發(fā)的DNA多態(tài)性[7]。戊二醛的殺菌機(jī)制是對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)和核酸的烷化作用，烷化后G(鳥嘌呤)發(fā)生改變導(dǎo)致和T錯(cuò)配；G結(jié)構(gòu)破壞；DNA不能復(fù)制，且DNA斷裂，因此經(jīng)2%戊二醛作用后的銅綠假單胞菌DNA無法進(jìn)行PCR，而EOW作用后DNA指紋圖譜與對(duì)照組無差異，推測(cè)EOW未使銅綠的DNA發(fā)生斷裂損傷。此結(jié)論與以往文獻(xiàn)[8]報(bào)道，EOW作用后細(xì)菌DNA 的限制性片段多態(tài)性并未改變相符。DNA損傷是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，損傷類型包括點(diǎn)突變、缺失、插入、倒位或轉(zhuǎn)位、雙鏈斷裂等，更進(jìn)一步判斷DNA損傷類型需進(jìn)行DNA序列檢測(cè)。

3.3 EOW對(duì)銅綠假單胞菌細(xì)胞膜通透性的作用情況 細(xì)菌的生命狀態(tài)與其細(xì)胞膜通透性密切相關(guān)，反映膜通透性改變的指標(biāo)包括細(xì)胞內(nèi)Ca2+、K+、Na+、Mg2+、核酸、蛋白質(zhì)等。已證實(shí)EOW將造成細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)改變，細(xì)胞壁皺縮、酶失活、胞質(zhì)內(nèi)DNA及K+滲漏[9]。Ca2+作為重要的第二信使，調(diào)節(jié)著細(xì)胞功能，其濃度變化可預(yù)示細(xì)菌的存亡。Fluo-3 AM是一種新型高度特異性Ca2+熒光指示劑，只有進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)非特異性酯酶脫去AM酯成為脂溶性Fluo-3后留在細(xì)胞內(nèi)與游離Ca2+結(jié)合在激發(fā)光激發(fā)后被檢測(cè)到，其熒光強(qiáng)度與Ca2+濃度成正比。激光共聚焦結(jié)果顯示，EOW和2%戊二醛使得銅綠假單胞菌胞內(nèi)Ca2+含量低于NS，推測(cè)EOW作用后銅綠假單胞菌細(xì)胞膜Ca2+通道發(fā)生改變，引起Ca2+外漏，最終導(dǎo)致或促進(jìn)細(xì)菌死亡。

綜上所述，細(xì)菌細(xì)胞壁及核酸并非EOW的主要作用靶點(diǎn)，細(xì)胞膜通透性改變導(dǎo)致重要離子外漏是導(dǎo)致細(xì)菌死亡的原因之一。此外，可能的殺菌機(jī)制包括干擾細(xì)菌代謝，使酶失活等還有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：文細(xì)毛)

Bactericidal mechanism of electrolyzed oxidizing water againstPseudomonasaeruginosa

ZHAOKai-li1,LIWu-ping1,ZHANGXiao-na1,WANGGang2，ZHUANGYu-chen2

(1XijingHospital，F(xiàn)ourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032，China； 2XijingSkinHospital，F(xiàn)ourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China)

Objective To investigate the bactericidal mechanism of electrolyzed oxidizing water (EOW) againstPseudomonaaeruginosa(P.aeruginosa).Methods Bactericidal mechanism of EOW againstP.aeruginosawas studied through intracellular protein leakage, nucleic acid,and cell membrane calcium ion permeability, 2% glutaraldehyde was used as positive control group, and normal saline (NS) was used as negative control group.Results The killing rates of EOW and 2% glutaraldehyde toP.aeruginosawere both>99.99% with 30-second contact time, and 100.00% with 60-second contact time. After 60-second contact with EOW, NS, and 2% glutaraldehyde，the protein leakage ofP.aeruginosadetected by bicinchoninic acid (BCA) were (96.00±7.42),(94.15±7.49), and (216.97±10.35)μg/mL, respectively, difference was significant(F=613.20，P<0.01)，2% glutaraldehyde group was higher than EOW group and NS group; protein leakage did not change with the increase of contact time(allP>0.05). Electrophoretogram of random amplified polymorphic DNA showed high intensity dense band between 500-1000 Kb in EOW group and NS group, while 2% glutaraldehyde group was without amplified bands. The fluorescence intensity of calcium ion of EOW group and 2% glutaraldehyde group were both lower than that of NS group.Conclusion Bactericidal mechanism of EOW may be due to the damage of membrane permeability ofP.aeruginosa, which causes Ca2+leakage, but fails to cause protein leakage, the damage to nucleic acid is not obvious, DNA may not be a bactericidal target of EOW.

electrolyzed oxidizing water; glutaraldehyde;Pseudomonasaeruginosa; bactericidal mechanism; protein leakage; nucleic acid; cell membrane permeability

2016-06-01

趙凱麗(1991-)，女(回族)，甘肅省天水市人，碩士研究生，主要從事重癥監(jiān)護(hù)與醫(yī)院感染研究。

李武平 E-mail:liwuping@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.01.009

R187

A

1671-9638(2017)01-0041-05