艱難梭菌感染實驗室檢測方法進展

劉 昊(LIU Hao)，徐修禮(XU Xiu-li)，張瑞雪(ZHANG Rui-xue)

(第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院全軍臨床檢驗醫(yī)學研究所，陜西 西安 710032)

·綜述·

艱難梭菌感染實驗室檢測方法進展

劉 昊(LIU Hao)，徐修禮(XU Xiu-li)，張瑞雪(ZHANG Rui-xue)

(第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院全軍臨床檢驗醫(yī)學研究所，陜西 西安 710032)

艱難梭菌； 艱難梭菌感染； 培養(yǎng)； 基因檢測； 分子生物學方法

艱難梭菌(Clostridiumdifficile,CD)是一種專性厭氧的革蘭陽性芽孢桿菌，1935年首次在新生兒腸道正常菌群中被分離出來。1978年起人們發(fā)現(xiàn)該細菌是引起抗生素相關性腹瀉、醫(yī)院性腹瀉及假膜性腸炎的主要病原體。有資料顯示，25%～30%的抗生素相關性腹瀉以及90%以上的假膜性腸炎均是由CD引起的，美國由艱難梭菌感染(Clostridium-difficileinfection,CDI)所致的病死率可達7.1%[1]。但是，不是所有的CD均會產(chǎn)生典型的臨床癥狀，CD致病主要是因為產(chǎn)生A、B兩種毒素。有研究認為，毒素B對于CDI感染的發(fā)生、發(fā)展至關重要[2]。因此，對于CDI的診斷應當基于毒素的檢測，而不僅僅是細菌的鑒定。

對產(chǎn)毒素CD的快速檢測是采取及時的感染控制措施和適當治療的關鍵。2010年美國衛(wèi)生保健流行病學會(Society for Healthcare Epidemiology of America, SHEA)和美國感染病學會(Infectious Diseases Society of America,IDSA)發(fā)表了對于CDI患者的管理指南[3]，該指南對診斷方法進行了說明，認為只應對腹瀉患者的糞便樣本進行檢測，對無癥狀患者不應進行CD相關的實驗室檢查與治療。其推薦的實驗室診斷方法包括產(chǎn)毒素的CD培養(yǎng)、毒素A/B酶免疫分析法、細胞培養(yǎng)毒素中和試驗、兩步法及核酸擴增法等，其中核酸擴增法具有廣闊的應用前景。實驗室檢查是艱難梭菌相關性腹瀉診斷、治療及預防控制過程中的重要依據(jù)。最常用的酶免疫分析法簡單、快速但缺乏靈敏性，而更敏感的毒素中和實驗及產(chǎn)毒素CD培養(yǎng)費時費力無法滿足臨床要求。近年來，分子生物學方法的快速發(fā)展，以XpertC.difficile、illumigeneC.Difficile、BD MAX C.diff等為代表的CD診斷新方法縮短了檢測周期，且靈敏度非常高，為CDI的診治提供了新的手段，具有廣闊的應用前景。為更好地了解CD感染實驗室診斷，現(xiàn)就CD的檢測方法做一綜述。

1 細胞培養(yǎng)毒素中和試驗(cell culture cytotoxicity neutralization assay, CCNA)

一直以來，CCNA被認為是CDI實驗室診斷的金標準，原理為直接檢測由毒素所致單層培養(yǎng)細胞的變性、壞死、凋亡等細胞病變效應。由于其操作復雜，主觀性強，對實驗環(huán)境及條件要求苛刻，難以標準化，且比較昂貴，故難以在臨床上推廣使用。且近年來隨著產(chǎn)毒素CD培養(yǎng)及分子生物學方法的發(fā)展，其作為“金標準”的地位受到了挑戰(zhàn)。研究[4-5]表明，與核酸擴增法和產(chǎn)毒素的CD培養(yǎng)相比，CCNA的靈敏度較低，普遍低于90%。

2 產(chǎn)毒素的CD培養(yǎng)(toxigenic culture, TC)

近年來，隨著CDI發(fā)病率的不斷增高，高致病性的新菌株型別的產(chǎn)生迫使實驗室再次關注發(fā)展細菌培養(yǎng)，以尋求新的檢測方法。傳統(tǒng)的CD培養(yǎng)是將糞便標本直接接種于環(huán)絲氨酸頭孢西丁果糖瓊脂(cycloserine-cefoxitin fructose agar，CCFA)[6]培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)48 h。后來在此基礎上做了許多改進，包括加入馬血、?；悄懰猁}和溶解酵素等以促進孢子的萌發(fā)，提高靈敏度。另外，在培養(yǎng)之前將糞便用乙醇沖擊或加熱處理，殺滅其他細菌，有利于孢子富集。和直接接種相比，肉湯富集培養(yǎng)可提高敏感度約20%[7]。

另外，顯色培養(yǎng)基也被用于CD的培養(yǎng)及鑒定。BioMérieux先后開發(fā)了IDCd培養(yǎng)基，CLO培養(yǎng)基和chromIDC.diffile(CDIF)培養(yǎng)基[8]。Eckert等[9]比較了CCFA48 h、CLO48 h、CDIF 24 h與48 h 4種培養(yǎng)基的性能，以4種培養(yǎng)基混合培養(yǎng)作為金標準，得出其靈敏度分別為70.4%、85.2%、74.1%和87%。而Carson等[8]從培養(yǎng)時間，是否進行乙醇沖擊前處理等方面進一步比較了CCFA與CDIF培養(yǎng)基的性能，發(fā)現(xiàn)對谷氨酸脫氫酶陽性的糞便樣本在CDIF上直接培養(yǎng)和經(jīng)乙醇沖擊前處理后培養(yǎng)的靈敏度和復蘇率一致，而在CCFA上經(jīng)乙醇沖擊前處理后培養(yǎng)比直接培養(yǎng)靈敏度和復蘇率高10%。在CDIF上培養(yǎng)24 h與48 h的結果比較，CCFA與CDIF上均培養(yǎng)48 h后的結果比較，差異均存在統(tǒng)計學意義，由此進一步說明了CDIF用于CD培養(yǎng)、鑒定和核糖體分型方面的優(yōu)勢。

由于只有產(chǎn)毒素的CD才具有致病性，因此，對于培養(yǎng)陽性并鑒定為CD的菌落還需進行毒素檢測。產(chǎn)毒素的CD培養(yǎng)操作繁瑣且耗時較長，但其優(yōu)點為靈敏度高、可獲得菌株，分離菌可進一步用于基因分型，獲知細菌傳播機制，是流行病學研究的基礎。目前，一般作為金標準用于新檢測方法的評估、臨床耐藥監(jiān)測以及評估新的治療方法，偶爾也可用于患者的管理。

3 酶免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測毒素

目前，國內(nèi)大部分實驗室均采用ELISA法檢測CD毒素A和B，該方法耗時短，成本低，特異性高，但因其敏感性較低而逐漸被認為是次選方法。Planche等[10]對英國臨床實驗室常用的6種ELISA試劑盒性能評價的文章進行系統(tǒng)綜述，最終發(fā)現(xiàn)各種試劑盒的診斷性能指標間存在差異，認為可能與各方法選擇的cut off值不同有關。按照文章中作者提出的將靈敏度90%和假陽性率低于3%作為可接受的標準，6種檢測試劑盒均不能滿足該標準，由此作者得出結論，ELISA檢測毒素不能單獨作為CDI的常規(guī)實驗室診斷方法。

Eastwood等[11]采用6種ELISA檢測600例腹瀉患者的糞便樣本，并進行3種橫向分析，以產(chǎn)毒素的CD培養(yǎng)作為金標準，得出靈敏度在60%～81%之間，特異度在91%～99.4%之間。同樣無一種方法的結果滿足Planche等[10]提出的標準，另外，文章也提到不一致的檢測結果不能通過重復試驗糾正，由此提出，若需要重復實驗，建議選擇另外一種檢測方法。其他研究[12]同樣提出了重復檢測的限制性。

4 谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase,GDH)

GDH為CD表面大量表達的抗原性酶蛋白，產(chǎn)生數(shù)量高于毒素且具有較強穩(wěn)定性，可作為糞便中CD存在的標志物。檢測GDH抗原具有非常高的敏感性和陰性預測值，早期研究[13]報道，該方法的靈敏度高于90%，陰性預測值可達99%，可作為GDH檢測的首選篩查方法。然而，最近研究[14]發(fā)現(xiàn)，對于非流行性BI/NAP1/027菌株，GDH的檢測靈敏度可能僅69%左右。另外，由于產(chǎn)毒和非產(chǎn)毒CD以及梭菌屬其他種類細菌均可產(chǎn)生此酶，GDH檢測缺少特異性，故不能單獨作為快速診斷CD的首選方法，而通常將其作為兩步法或三步法的初篩實驗應用于臨床。

TheC.DiffQUIK Chek Complete Assay (TechLab, Blacksburg，VA, USA)[15]將GDH抗原檢測和毒素A&B檢測結合起來，能夠在30 min左右獲得結果。Kim等[16]評價該方法，陰性預測值達98.5%，GDH檢測部分的靈敏度是91%，而毒素檢測部分的靈敏度較低(61%～78%)。因此，實驗室可能需要另一種更敏感的方法檢測GDH陽性而毒素陰性的情況，分子生物學無疑是最好的選擇。

5 核酸擴增法(nucleic acid amplification test, NAAT)

CD毒素A和毒素B分別由tcdA和tcdB基因編碼，而其表達被認為是由tcdC基因下調(diào)或缺陷引起的?；驒z測可預測產(chǎn)毒性CD的存在，及其產(chǎn)毒能力的強弱。目前，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)方法主要應用于實時熒光定量PCR，RT-PCR和環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等檢測糞便標本中的產(chǎn)毒素CD，上述方法的敏感性高，特異性強，更方便、快速，但價格昂貴，并且由于其敏感性高，一些無癥狀攜帶者在檢測中也可能為陽性。Deshpande等[17]對1995—2010年發(fā)表的以CCNA或TC為金標準評價實時PCR檢測性能的文章(其中19篇符合標準)進行meta分析。PCR的合并靈敏度為90%，特異度為96%。診斷方法的準確度與CD的流行率有關，在CD流行率分別為<10%，10%～20%和>20%時，陽性預測值和陰性預測值分別為71%、79%，93%、99%，98%、96%，因此，可認為實時PCR對于CDI的診斷具有較高的靈敏度和特異度。

截至目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準了9種CD分子檢測平臺[18]，包括BD GeneOhm、BD Max、ProDesse ProGastro Cd Assay、Cepheid GeneXpertC.difficileAssay、Meridian Illumigene、Focus Technologies Simplexa、Great Basin Portrait Analyzer、Quidel AmpliVueC.difficileAssay、Nanosphere Verigene，其中Meridian Illumigene和Quidel AmpliVueC.difficileAssay檢測的是毒素A基因，其他均檢測的是毒素B基因。另外，F(xiàn)DA批準的上述檢測平臺中僅Meridian Illumigene采用的是環(huán)介導等溫擴增技術。各檢測方法的性能比較見表1。

表1 FDA批準的9種NAATs檢測試劑盒的性能比較[18]

BD-GeneOhmTM C.diff是第一個被FDA批準的分子檢測方法，是一個基于實時PCR檢測CD毒素B基因的平臺。該方法采用專用珠子溶菌手工提取DNA后，在Cepheid Smart Cycler上進行擴增，其檢測結果約在2 h后給出[19]。根據(jù)參比方法的不同其靈敏度為84%～96%，特異度為94%～99%。

Cepheid GeneXpertC.difficileAssay需要在其專門的儀器GeneXpert中完成檢測，該診斷方法采用全自動實時熒光定量PCR原理，將樣品處理、核酸擴增、目標序列的實時檢測整合于一體，能在50 min內(nèi)檢測患者糞便中CD產(chǎn)生的毒素B，甚至二元毒素，提供流行病學信息，有助于患者的早期治療及感染預防控制。Bababy等[20]對一所腫瘤醫(yī)院的560份糞便標本進行檢測，將該方法與兩步法(用酶免疫法檢測GDH作為初篩，陽性標本再用毒素中和試驗進一步證實)進行比較，該研究分兩個階段，第一階段僅對GDH陽性標本同時用Xpert PCR和CCNA實驗進行檢測，結果不一致者再行糞便培養(yǎng)和細胞毒性檢測進一步驗證，結果GDH-Xpert PCR和GDH-CCNA的一致率為72%，其敏感度和特異度分別為100%和97%，57%和97%。第二階段則分別用Xpert PCR和GDH-CCNA檢測，一致率為95%。另外，對其中45份Xpert PCR檢測陽性的標本進行基因分型，并與PCR-核糖體分型、基因測序進行比較，一致性可達90%以上。由此可見，Xpert PCR檢測CDI具有較高的敏感度和特異度，加之其基因分型能力，檢測快速、方便，極大地滿足了臨床需求。

Viala等[21]評價3種檢測糞便中CD毒素基因的分子診斷試劑盒性能，以TC作為金標準，檢測當?shù)匾凰t(yī)院的89份糞便標本，最終得出，BD GeneOhmC.diff、XpertC.Difficile和illumigeneC.diff3種方法的靈敏度分別為95.5%、97.8%和86.7%，特異度分別為97.9%、97.9%和100%，準確度分別為96.8%、97.9%和93.6%。XpertC.Difficile和illumigeneC.Difficile僅需1 h便可完成檢測，而BD GeneOhmC.diff需花費2～3 h，綜合來看，XpertC.diff性能更佳，應用于臨床優(yōu)勢更明顯。

2012年Le等[22]提出一種新的全自動實時PCR檢測CD毒素B基因的方法—BD MAXC.diff(Becton, Dickinson, Franklin Lakes, NJ)。它與XpertC.difficile操作基本相同，取約10 μL糞便至BD MAX樣品緩沖管中，震蕩混勻后放入BD MAX儀器中，DNA提取(50～90 min，取決于樣本中可提取DNA的量)和實時PCR過程(30 min)均通過儀器自動完成。Le等[22]檢測360例腹瀉患者的糞便樣本，以TC為金標準，得出BD MAX C.diff的靈敏度和特異度分別為97.73%、99.68%。以TC為金標準，比較Cepheid GeneXpert、BD MAX 2種全自動CD分子診斷方法[23]，其靈敏度和特異度比較，差異無統(tǒng)計學意義。兩者具有全封閉系統(tǒng)、全自動操作、污染可能性小、人為錯誤少、結果精確度高、檢測時間短等優(yōu)點，因此，均可作為全自動快速分子診斷方法應用于CDI診斷。但XpertC.diff一次性可同時檢測的樣本量取決于GeneXpert儀器的大小規(guī)格，與GeneXpert相比，BD MAX儀器最大的優(yōu)勢在于在相同的PCR平臺上，可同時進行24個樣本的檢測[23]。

上述幾種NAATs檢測方法雖然基本原理、操作過程及花費時間等有所區(qū)別，但檢測的靈敏度和特異度均非常高，且差異無統(tǒng)計學意義，但目前尚無文獻對新的檢測方法做系統(tǒng)綜述。值得肯定的是，分子生物學方法與產(chǎn)毒素CD培養(yǎng)的結果一致性高，且優(yōu)于CCNA，ELISA和兩步法。但需要指出的是，該種方法檢測CD毒素基因，對無癥狀攜帶者CDI的診斷可能會存在問題。文獻[24]報道，分子生物學方法的使用可能會使CDI的發(fā)病率增高50%以上，此外，上述幾種FDA批準的分子檢測方法可能對實驗室的設備條件及工作人員有較高的專業(yè)要求。盡管如此，該方法仍是目前實驗室應用最廣泛的方法。

綜上所述，產(chǎn)毒素CD培養(yǎng)作為CDI診斷的金標準，其在流行病學調(diào)查、耐藥監(jiān)測及方法評估等方面的作用是無法替代的，但因該方法自身的局限性尚不能很好的滿足臨床需要。基于GDH檢測的兩步法或三步法優(yōu)于ELISA檢測毒素，可應用于臨床。而分子生物學方法無疑是當前較好的CDI檢測方法，可與GDH檢測聯(lián)用也可單獨用于CD毒素的檢測，但其檢測性能及成本效益還需進一步研究。因此，在現(xiàn)有CD診斷方法尚存缺陷的今天，各種方法取長補短，互相補充，可以為CD相關性腹瀉的診治提供有力依據(jù)。

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(本文編輯：曾翠)

Advances in laboratory testing forClostridiumdifficileinfection

(Institute of Clinical Laboratory Medicine, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China)

2016-06-18

劉昊(1989-),男(漢族)，陜西省西安市人，檢驗技師，主要從事感染性疾病的實驗室診斷。

徐修禮 E-mail：xxlxxl@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.01.022

R378.8

A

1671-9638(2017)01-0089-05