密閉艙室煙霧吸入對大鼠重要臟器損傷的病理觀察

孫磊 蔡穎 敖琳 安輝 陳晟 陶成玉 劉晉祎 曹佳

目前國內(nèi)外關(guān)于火災(zāi)煙霧損害效應(yīng)的研究，主要集中于森林火災(zāi)、建筑火災(zāi)及工作環(huán)境中單一非金屬材料（如松木［1］、棉花［2］、白楊木屑［3］、泡沫材料［4］等）燃燒煙霧的組成及其對人體的影響［1］。由于保密的原因，有關(guān)軍用密閉艙室等特殊環(huán)境中非金屬材料燃燒釋放煙霧對機(jī)體的毒性效應(yīng)，尤其是對機(jī)體主要器官和系統(tǒng)在不同暴露時(shí)相點(diǎn)的病理變化，國內(nèi)外鮮有報(bào)道［5-6］。軍用密閉艙室內(nèi)非金屬材料燃燒釋放煙霧的組成非常復(fù)雜［7-8］，其損傷效應(yīng)涉及的病理過程也具有全身性、多系統(tǒng)性等特點(diǎn)。因此，本研究在建立軍用密閉艙室大鼠煙霧吸入損傷模型的基礎(chǔ)上，觀察大鼠染毒后5個(gè)時(shí)相點(diǎn)（1、6、24、72 h和 7 d）心、肺、肝及腎組織的病理改變，為開展針對性的基礎(chǔ)研究和探究有效的救治措施提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物與材料

1.實(shí)驗(yàn)動物：健康清潔級雄性SD大鼠36只，7～9周齡，體質(zhì)量（200±20）g，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供［動物使用許可證號：SCXK（渝）2010-0005］，常規(guī)飼養(yǎng)于陸軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)研究所動物房，以普通基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，每組6只，進(jìn)行隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)陸軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，動物處置方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

2.主要試劑：二甲苯（重慶川東化工集團(tuán)有限公司化學(xué)試劑廠，批號20090911）、多聚甲醛（成都市科龍化工試劑廠，批號20100501）、無水乙醇（重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司，批號20100509）。

3.主要實(shí)驗(yàn)儀器：密閉艙室煙霧吸入染毒裝置（陸軍第三軍醫(yī)大學(xué)毒理學(xué)研究所研制，由燃燒箱、染毒箱和循環(huán)管道3部分組成［7］）：燃燒材料為坦克艙室內(nèi)使用的9種主要的非金屬材料［7，9］，主要包括地板膠（主要組分橡膠）、內(nèi)棉線膠管（主要組分橡膠）、導(dǎo)線（主要組分聚乙丙烯）、蓄電池墊板（硬聚氯乙烯墊板）、座椅表層（主要組分聚氯乙烯）、座椅里層（主要組分海綿和棕墊）、裝飾材料一（主要組分軟質(zhì)聚乙烯泡沫塑料）、裝飾材料二（主要組分軟質(zhì)聚氨酯泡沫塑料）、油漆類（磷酸鹽富鋅涂料、白醇酸磁漆、非晶態(tài)合金鍍液），有某軍工生產(chǎn)單位提供，BX60熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

二、實(shí)驗(yàn)動物建模與分組

1.染毒建模：各組大鼠于實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。將上述主要的9種非金屬材料按照該型坦克內(nèi)部實(shí)際的用量比例混合，并按照模擬裝置與坦克實(shí)際的體積比選擇定量的上述混合材料，將所有材料剪成10×10 mm的小塊均勻分布鋪放于燃燒箱內(nèi)，用液化氣爐點(diǎn)燃非金屬材料發(fā)煙穩(wěn)定3 min后，將大鼠置于染毒箱內(nèi)吸入染毒10 min后取出，使其重新呼吸新鮮空氣［7，9］，并開始計(jì)時(shí)。

2.分組：實(shí)驗(yàn)組分別于染毒后 1、6、24、72 h和7 d處死大鼠；對照組不予染毒處理，始終呼吸新鮮空氣。

三、蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色

大鼠頸動脈放血處死后，分別留取心、肺、氣管、肝、腎組織。將各組大鼠的肺組織置于4%多聚甲醛溶液中室溫固定24 h，其他臟器置于10%甲醛溶液中室溫固定24 h；經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)切片（厚度4μm）和HE染色后，封片，200倍鏡檢，觀察臟器組織間質(zhì)出血、水腫、炎癥細(xì)胞浸潤及煙霧顆粒物沉積等病理學(xué)改變。

結(jié) 果

一、煙霧吸入對大鼠心臟組織的病理形態(tài)學(xué)影響

對照組大鼠心室部位的心肌細(xì)胞形態(tài)正常，心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核大小一致，染色均一，未見心肌細(xì)胞充血、水腫及空炮形成（圖1a）。染毒后1 h：大鼠心肌細(xì)胞間可觀察到少量的煙霧顆粒物沉積；心肌細(xì)胞腫脹；部分心肌細(xì)胞排列紊亂呈波浪樣（圖1b）。染毒后6 h：大鼠心室部位的心肌細(xì)胞周圍小血管及心肌細(xì)胞間煙霧顆粒物沉積明顯，顆粒較大、數(shù)量較多；部分心肌細(xì)胞完整性破壞、空泡化；心肌細(xì)胞排列松散、混亂（圖1c）。染毒后24 h：大鼠心室部位的心肌細(xì)胞周圍小血管及心肌細(xì)胞間煙霧顆粒物沉積數(shù)量比1 h和6 h多，呈彌漫性分布；心肌細(xì)胞腫脹明顯，有局灶性溶解；；心肌細(xì)胞排列松散、混亂（圖1d）。染毒后72 h：大鼠心室部位的心肌細(xì)胞周圍小血管及心肌細(xì)胞中煙霧顆粒物沉積減少；心肌細(xì)胞有局灶性溶解和壞死；心肌細(xì)胞間有出血；部分心肌細(xì)胞呈松散排列（圖1e）。染毒后7 d：大鼠心室部位的心肌細(xì)胞周圍小血管內(nèi)有煙霧顆粒物沉積，心肌細(xì)胞間煙霧顆粒物沉積減少；心肌細(xì)胞溶解，細(xì)胞間有出血；部分心肌細(xì)胞呈松散排列（圖1f）。

圖1 光鏡下觀察密閉艙室煙霧吸入10 min后各時(shí)相點(diǎn)的大鼠心臟組織病理形態(tài)學(xué)改變。注：a為未吸入煙霧的正常對照組，b為煙霧吸入后1 h組，c為煙霧吸入后6 h組，d為煙霧吸入后24 h組，e為煙霧吸入后72 h組，f為煙霧吸入后7 d組；黑色箭頭所指為沉積的煙霧顆粒物

二、煙霧吸入對大鼠肺組織的病理形態(tài)學(xué)影響

對照組大鼠右肺上葉的肺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常（圖2a）。煙霧吸入后各時(shí)相點(diǎn)動物肺表面均可觀察到不同程度的出血。各損傷組均可觀察到黑色顆粒物的沉積，1、6和24 h組大鼠的肺部顆粒物主要沉積在小支氣管內(nèi)，72 h和7 d組大鼠肺組織切片內(nèi)顆粒物在小支氣管和肺泡腔內(nèi)呈彌漫性分布。煙霧吸入后1 h組大鼠的肺組織損傷，主要表現(xiàn)為肺泡間隔與肺泡腔內(nèi)廣泛出血和炎細(xì)胞浸潤（圖2b）。6 h組大鼠肺組織損傷加重，可觀察到肺泡間隔增寬、充血，炎性細(xì)胞浸潤，部分肺泡腔內(nèi)有粉紅色的滲出液，局部肺泡壁斷裂形成肺大泡，肺泡壁增生變厚，肺實(shí)變明顯（圖2c）。24 h組動物肺組織損傷進(jìn)一步加重，肺泡腔內(nèi)廣泛炎性細(xì)胞的滲出，肺泡腔內(nèi)有透明膜形成，部分支氣管內(nèi)柱狀上皮細(xì)胞脫落（圖2d）。72 h組可觀察到一些組織自我修復(fù)的變化，小氣管壁增生、炎性滲出相對減少（肺泡腔內(nèi)的炎性滲出液已被部分吸收），在增寬的肺泡間隔內(nèi)及小支氣管周圍可見梭形的成纖維細(xì)胞增生明顯；肺泡腔增大，形成肺大泡，有肉芽腫的形成（圖2e）。7 d組與72 h組大鼠的肺組織損傷類型差異不大，但肺泡壁的增厚程度及氣道周圍纖維組織增生比72 h組更為明顯（圖2f）。

圖2 光鏡下觀察密閉艙室煙霧吸入10 min后各時(shí)相點(diǎn)的大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變。注：a為對照組（HE×200），b為1 h組（HE×200），c為6 h組（HE×100），d為24 h組（HE×100），e為72 h組（HE×100），f為7 d組（HE×200）

三、煙霧吸入對大鼠氣管組織的病理形態(tài)學(xué)影響

對照組大鼠主支氣管部位的氣管結(jié)構(gòu)正常（圖3a）。1 h組大鼠的氣管結(jié)構(gòu)，管腔內(nèi)有顆粒的沉積（圖3b）。6 h組大鼠的支氣管腔內(nèi)有出血和顆粒物沉積，上皮細(xì)胞和軟骨分離（圖3c）。24 h組大鼠氣管的局部上皮細(xì)胞與環(huán)狀軟骨分離，疏松結(jié)締組織內(nèi)有炎細(xì)胞浸潤，血管充血明顯（圖3d）。72 h組大鼠的氣管切片可見纖毛下結(jié)締組織疏松，有炎細(xì)胞的浸潤及顆粒物的沉積，局部纖毛脫落，環(huán)狀軟骨下肌層也可見顆粒物沉積（圖3e）。7 d組大鼠氣管的主要病變?yōu)樯掀ぜ?xì)胞的脫落及顆粒物的沉積（圖3f）。

圖3 光鏡下觀察密閉艙室煙霧吸入10min后各時(shí)相點(diǎn)的大鼠氣管組織病理形態(tài)學(xué)改變。注：a為對照組（HE×200），b為1 h組（HE×200），c為6 h組（HE×100），d為24 h組（HE×100），e為72 h組（HE×400），f為7 d組（HE×400）

四、煙霧吸入對大鼠肝臟組織的病理形態(tài)學(xué)影響

對照組肝小葉部位的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常（圖4a）。各煙霧吸入損傷組大鼠的肝臟內(nèi)均可見顆粒物沉積。1 h組大鼠的部分肝細(xì)胞排列紊亂，肝索結(jié)構(gòu)不清晰，中央靜脈充血，胞漿疏松，有不同程度的水腫和空泡變性，肝臟內(nèi)血管及肝細(xì)胞都可見大量顆粒物沉積（圖4b）。6 h組大鼠肝組織切片可見肝細(xì)胞局灶性壞死和空洞形成，顆粒物呈彌漫性沉積，雙核細(xì)胞增多（圖4c）。24 h組大鼠肝細(xì)胞呈廣泛性溶解、空泡變性，血管和肝細(xì)胞內(nèi)均有顆粒物沉積，但顆粒物數(shù)量較6 h組減少（圖4d）。72 h組大鼠的肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞溶解程度減輕，同一觀察視野中可見肝細(xì)胞壞死、增生和修復(fù)（圖4e）。7 d組大鼠肝組織切片可見肝細(xì)胞溶解性壞死，局部肝細(xì)胞增生明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)較完整（圖4f）。

五、煙霧吸入對大鼠腎組織的病理形態(tài)學(xué)影響

對照組大鼠腎葉結(jié)構(gòu)正常（圖5a）。1 h組大鼠的腎小管上皮細(xì)胞腫脹；腎小球充血嚴(yán)重（圖5b）。6 h組大鼠腎臟皮質(zhì)及髓質(zhì)區(qū)出血明顯；皮質(zhì)區(qū)腎小管上皮細(xì)胞腫脹；腎小球充血嚴(yán)重；內(nèi)皮細(xì)胞高度腫脹；鮑曼氏囊腔狹窄（圖5c）。24 h組大鼠的腎組織主要病變?yōu)樗栀|(zhì)和皮質(zhì)區(qū)腎小管上皮細(xì)胞明顯腫脹，有較多的顆粒沉積在細(xì)胞內(nèi)；腎間質(zhì)出血明顯，以髓質(zhì)更為嚴(yán)重，腎小球充血嚴(yán)重；細(xì)胞腫脹；鮑曼氏囊腔幾乎消失，也可觀察到少量顆粒物沉積（圖5d）。72 h組大鼠腎組織病變表現(xiàn)為區(qū)域性改變，部分區(qū)域腎小管上皮細(xì)胞明顯腫脹，胞核溶解，胞漿疏松，腎間質(zhì)出血情況減輕。腎小球和腎小管均可觀察到顆粒物沉積，但數(shù)量明顯減少（圖5e）。7 d組大鼠腎小管上皮細(xì)胞明顯腫脹，腎間質(zhì)出血明顯較少；腎小球病變以增生為主，間隙幾乎消失；腎小球與腎小管間隙消失，難以分開，但均可觀察到顆粒物沉積，顆粒數(shù)量較少（圖5f）。

圖5 光鏡下觀察密閉艙室煙霧吸入10min后各時(shí)相點(diǎn)大鼠腎臟組織的病理形態(tài)學(xué)改變。注：a為對照組（HE×100），b為1h組 （HE×200），c為6h組 （HE×200），d為24h組 （HE×200），e為72h組 （HE×200），f為7d組 （HE×200）

討 論

組織病理學(xué)檢查在毒性試驗(yàn)中是不可缺少的，他可確定化合物對機(jī)體的毒性作用靶器官與部位、損害性質(zhì)與程度，從病理學(xué)角度尋找化合物與病理改變的劑量效應(yīng)關(guān)系，為了解化合物的中毒效應(yīng)和機(jī)制提供依據(jù)。由于目前國內(nèi)外研究主要集中于工作環(huán)境和建筑物火災(zāi)釋放煙霧的組成及對人體的影響，且以單一材料燃燒釋放煙霧相關(guān)研究為主，而對于坦克艙室這種密閉環(huán)境中，多種非金屬材料燃燒釋放的混合有毒煙霧對人體影響的報(bào)道較為少見。因此，在本試驗(yàn)通過大體肉眼觀察和常規(guī)組織病理學(xué)檢查來探討密閉艙室內(nèi)混合煙霧的生物毒性效應(yīng)。

對心臟的損害。在發(fā)生急性中毒（煙霧吸入損傷）時(shí)，多數(shù)毒物可直接作用于心肌，造成心臟損害；亦可通過毒性作用引起組織缺血缺氧、外周阻力增高、血容量減少以及電解質(zhì)紊亂等，間接損害心肌，導(dǎo)致心臟功能障礙、心律失常甚至死亡。本研究結(jié)果顯示，大鼠吸入煙霧后，光鏡下心肌的病理形態(tài)學(xué)改變表現(xiàn)主要為：顆粒物沉積、心肌細(xì)胞腫脹、局部溶解和壞死。結(jié)合血清心肌酶在煙霧吸入后短時(shí)間內(nèi)升高的前期研究結(jié)果［10］，提示煙霧中的有害成分可損傷心肌組織結(jié)構(gòu)、影響心肌正常功能。其原因可能與缺氧、一氧化碳中毒及燒傷有關(guān)［11］。

對肺的損害。煙霧吸入后不同時(shí)相點(diǎn)，大鼠肺組織病理學(xué)的改變是一個(gè)漸進(jìn)的過程。早期（煙霧吸入后的24 h以內(nèi)）的損傷為肺間質(zhì)彌漫性充血、炎細(xì)胞的浸潤和肺泡腔內(nèi)紅細(xì)胞滲出，在此階段采取有效的治療措施，可使損傷基本恢復(fù)［12-13］。當(dāng)炎癥持續(xù)存在時(shí)，損傷因素繼續(xù)進(jìn)行作用，慢性炎癥反應(yīng)可表現(xiàn)為肉芽腫形成或肺組織的纖維化，引起肺通氣不足、通氣/血流比例失調(diào)和靜動脈血分流增加，導(dǎo)致低氧血癥或伴發(fā)代謝性酸中毒。72 h和7 d時(shí)，可觀察到組織的修復(fù)和損傷過程幾乎同時(shí)進(jìn)行。損傷早期，由于肺泡孔的存在，大部分顆粒物只能沉積在終末支氣管內(nèi)，而肺泡腔內(nèi)的顆粒物少見；損傷后期，隨著肺泡腔內(nèi)的透明膜形成，肺泡壁增厚，通氣與換氣功能受阻，肺泡腔內(nèi)氣體積聚，從而使肺泡壁斷裂、形成肺大泡，大量顆粒物可通過斷裂的肺泡壁進(jìn)入肺泡腔內(nèi)，在小支氣管和肺泡腔內(nèi)彌散性沉積。因此，肺是密閉艙室煙霧吸入損傷的主要靶器官。

對氣管的損害。煙霧吸入后不同時(shí)相點(diǎn)，大鼠氣道內(nèi)均可觀察到顆粒物的沉積，隨傷后時(shí)間的延長，纖毛下結(jié)締組織及環(huán)狀軟骨下肌層也可見顆粒物沉積。主要病理改變?yōu)椋荷掀ぜ?xì)胞水腫、局部纖毛脫落、局部上皮細(xì)胞與軟骨分離。其致傷原因可能為煙霧中含有大量顆粒物，易沉積黏粘膜表面，造成呼吸道粘膜充血、水腫，分泌物增多；煙霧中大量有害物質(zhì)可造成呼吸道直接損傷及化學(xué)性損傷。此外，煙霧吸入后，在損傷部位從氣道進(jìn)展到肺實(shí)質(zhì)的過程中，支氣管循環(huán)也起著極其重要的作用，它是導(dǎo)致肺水腫形成、進(jìn)而引起急性肺損傷的重要因素［14］。

對肝臟的損害。在煙霧吸入后不同時(shí)相點(diǎn)均可觀察到顆粒物沉積、肝細(xì)胞胞漿疏松以及有不同程度的水腫和空泡變性。煙霧吸入后24 h時(shí)病變較嚴(yán)重，肝細(xì)胞呈廣泛性溶解和壞死；72 h時(shí)，可見肝組織的增生和修復(fù)。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，煙霧吸入后大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（adanine aminotransferase，ALT）顯著升高［10］。提示了密閉艙室內(nèi)煙霧吸入可損傷肝臟組織并影響肝功能。由于肝臟的自我修復(fù)能力極強(qiáng)，在受到損傷后，細(xì)胞可通過促進(jìn)有絲分裂以抵抗外界作用因素的損傷效應(yīng)［15］。本研究中可觀察到肝小葉內(nèi)的雙核細(xì)胞增多，也提示肝臟在煙霧吸入后具有較強(qiáng)的代償增殖活性和自我修復(fù)能力。

對腎臟的損害：煙霧吸入后，各組大鼠的腎小管上皮細(xì)胞及腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷較為嚴(yán)重。腎小管的重吸收和分泌是尿生成與濃縮過程中的重要環(huán)節(jié)；腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞受損可使基膜（主要的機(jī)械和電屏障結(jié)構(gòu)）異常，引起腎小球?yàn)V過功能的異常。煙霧吸入后各時(shí)相點(diǎn)均可觀察到腎小管間隙及管腔內(nèi)有煙霧顆粒物的沉積，隨著病程時(shí)間的延長，沉積的顆粒物體積越大、數(shù)量越多，這也提示腎組織的屏障結(jié)構(gòu)受到了損傷。由于腎臟血流豐富（占心臟搏出量的20%～25%）、對缺氧敏感且耐受性差，因此，在煙霧吸入造成的缺氧或循環(huán)血量不足的情況下，腎臟較其它臟器更易受到損害［16］。前期研究證實(shí)尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、在煙霧吸入后有增高［10］也提示可能是由于腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞受到損傷及顆粒物的沉積而導(dǎo)致濾過功能的異常所引起的。

綜上所述，密閉艙室主要非金屬材料燃燒釋放的有毒煙霧吸入后可通過血液循環(huán)在機(jī)體多處組織器官沉積，對雄性大鼠心、肺、肝、腎等重要臟器的病理學(xué)形態(tài)產(chǎn)生影響，繼而造成一定程度的功能損害。

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