沙利度胺對人宮頸癌裸鼠腫瘤及新生血管形成的影響

楊麗萍　侯俊德　馬建彩

[摘 要] 目的：探討沙利度胺對人宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠皮下種植瘤的生長及腫瘤組織內(nèi)新生血管形成的影響。方法： 建立宮頸癌裸鼠荷瘤模型，分為4組，每組10只。1）沙利度胺低劑量組：100mg·kg-1·d-1，0.2ml腹腔注射；2）沙利度胺中劑量組：200mg·kg-1·d-1，0.2ml腹腔注射；3）沙利度胺高劑量組：400mg·kg-1·d-1，0.2ml腹腔注射；4）對照組：0.5%羧甲基纖維鈉0.2ml腹腔注射。給藥2周后，觀察各組裸鼠體重、計算腫瘤抑制率，采用免疫組化法檢測移植瘤組織中血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）以及微血管密度（Microvessel Density，MVD）的變化。結(jié)果：用藥2周后，各組裸鼠體內(nèi)腫瘤抑制率呈現(xiàn)劑量依賴性，各組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗組中VEGF及MVD的表達(dá)均低于對照組，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：沙利度胺對宮頸癌Hela皮下移植瘤的生長具有抑制作用，其作用可能與抗新生血管形成有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 沙利度胺；人宮頸癌細(xì)胞；微血管密度；血管內(nèi)皮生長因子

中圖分類號：R737.33 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-5200（2016）05-015-03

DOI：10.11876/mimt201605006

宮頸癌是嚴(yán)重危害婦女健康和生命的最常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率在我國呈上升趨勢，且日趨年輕化[1]。傳統(tǒng)手術(shù)與放化療是治療宮頸癌的主要手段，但治療效果有限，因此尋找新的、有效治療手段至關(guān)重要。近年來，靶向治療在臨床實(shí)踐中日益取得顯著效果。它以腫瘤細(xì)胞分子的特征性改變?yōu)樽饔冒悬c(diǎn)，在發(fā)揮抗腫瘤作用同時、減少對正常細(xì)胞損傷。最近研究顯示，沙利度胺具有廣泛免疫調(diào)節(jié)作用和抗血管形成作用[2-3]，這一曾使上萬名嬰兒肢體畸形的藥物再次引起人們重視。本研究旨在觀察沙利度胺對Balb/c裸鼠宮頸癌Hela細(xì)胞皮下種植瘤抑制作用，為其在應(yīng)用于宮頸癌治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

沙利度胺購自江蘇常州制藥廠，生產(chǎn)批號：20030302，以0.5%羧甲基纖維鈉（CMC-Na）配成適當(dāng)濃度，用于動物實(shí)驗。小鼠抗人VEGF、CDl05單克隆抗體和即用型SABC法免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術(shù)工程公司。

1.2 動物及細(xì)胞株

Balb/c裸鼠，體重20g左右，無特殊病原菌（SPF）條件下飼養(yǎng)。人宮頸癌細(xì)胞株Hela，復(fù)蘇后接種于Balb/c裸鼠傳代。

1.3 裸鼠荷瘤模型的建立及實(shí)驗分組

無菌條件下，在每只裸鼠左側(cè)腋部皮下注射0.2 mL人宮頸癌Hala細(xì)胞懸液（1×107個/mL）。當(dāng)移植瘤直徑達(dá)到8mm開始給藥。隨機(jī)將荷瘤鼠分為4 組，每組10只。正常對照組：每只腹腔注射0.5%羧甲基纖維鈉0. 2mL。其余3組腹腔內(nèi)注射不同劑量沙利度胺：低劑量組：100mg·kg-1·d-1，0.2mL；中劑量組：200mg·kg-1·d-1，0.2mL ；高劑量組：400mg·kg-1·d-1，0.2mL；4組均給藥2周，每周2次，共注射4次。

1.4 抑瘤率測定

給藥2周后頸椎脫臼處死動物，稱取腫瘤重量（m），計算抑瘤率。抑瘤率=（對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/對照組平均瘤重× 100%。取出皮下種植瘤，用10%甲醛固定后制作石蠟切片。

1.5 移植瘤組織中VEGF和MVD的免疫組化檢測

移植瘤標(biāo)本經(jīng)固定、包埋、切片后，按免疫組化SABC法進(jìn)行染色，檢測移植瘤組織中VEGF和CD105的表達(dá)。操作步驟嚴(yán)格按試劑說明書，PBS代替一抗作陰性對照。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：①VEGF以胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色均勻顆粒的為陽性細(xì)胞。在400倍視野下隨機(jī)選取 10個視野，分別計數(shù)每個視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)，計算陽性細(xì)胞的百分比：<10%為陰性（一）；10%～33%為弱陽性（+）；34%～66%為陽性（++）；>66%為強(qiáng)陽性（卅）。②MVD計數(shù)方法：40倍視野下選取5個微血管密集區(qū)，200倍視野下計數(shù)CDl05標(biāo)記的毛細(xì)血管和微小血管，取其平均值代表MVD。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

利用軟件SPSS 14行單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組裸鼠荷瘤抑瘤率比較

給藥2周后，各組裸鼠體內(nèi)腫瘤的重量呈現(xiàn)劑量依賴性降低；并計算其抑制率，結(jié)果顯示，沙利度胺低劑量組、沙利度胺中劑量組、沙利度胺高劑量組抑瘤率分別為24.13%、43.52%、52.67%，與對照組相比裸鼠荷瘤明顯縮小。且沙利度胺高劑量組抑瘤作用最顯著為52.67%，各組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 4組裸鼠荷瘤組織中VEGF及MVD的表達(dá)

與對照組相比，實(shí)驗組中各組織中VEGF的表達(dá)（圖1）和MVD（圖2）的表達(dá)，隨沙利度胺劑量的增加，依次遞減，3個實(shí)驗組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

沙利度胺（反應(yīng)停，酞咪哌叮酮，thalidomide），曾因嚴(yán)重的致畸作用而被禁用[4]。但對其研究并未停止。近年來研究表明沙利度胺具有抗腫瘤作用，并可通過直接抑制VEGF表達(dá)、調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和黏附，抑制血管形成[5-7]，給抗血管生成治療腫瘤帶來了希望。有研究表明VEGF在宮頸癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移、預(yù)后有關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示沙利度胺能抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞的生長，并呈現(xiàn)劑量依賴性，隨著沙利度胺濃度的增加，VEGF的表達(dá)呈不同程度的下降，呈濃度依賴性模式。表明沙利度胺可通過抑制腫瘤組織中VEGF的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長。

微血管密度是判斷腫瘤預(yù)后的獨(dú)立危險因素，并可作為直接衡量血管生成的標(biāo)準(zhǔn)[9-10]，與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)[11]。研究顯示CD105標(biāo)記的MVD與宮頸癌、直腸癌、乳腺癌等多種腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[12-13]。故本實(shí)驗用CD105單克隆抗體對沙利度胺作用的裸鼠移植瘤的血管進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果顯示瘤體內(nèi)微血管密度變化與腫瘤生長活躍的浸潤性生長過程新生血管化是同步進(jìn)行的。提示沙利度胺能夠通過減少裸鼠移植瘤組織內(nèi)新生血管的密度，在一定程度上控制移植瘤的生長。

綜上所述，沙利度胺可抑制Hela細(xì)胞移植瘤的生長，并可減少移植瘤組織中VEGF和 MVD的表達(dá)，且兩者變化一致并呈現(xiàn)劑量依賴性。證明沙利度胺的抗腫瘤機(jī)制與抗新生血管形成有關(guān)。

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