結(jié)直腸癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞監(jiān)測的研究進(jìn)展

陳池生 褚忠華

·綜述·

結(jié)直腸癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞監(jiān)測的研究進(jìn)展

陳池生 褚忠華*

盡管近年來結(jié)直腸癌手術(shù)、化療、放療的療效較前已有明顯改善，但仍有15%～20%的結(jié)直腸癌患者在診斷時就已發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，而其余60%亦在后續(xù)的治療過程中發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。而外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）的檢測作為近年來臨床研究的熱點，在評估治療癌癥的療效及判斷預(yù)后等方面有著巨大的潛力。本文就CTCs的分離富集、檢測技術(shù)及結(jié)直腸癌患者中CTCs檢測的臨床意義進(jìn)行綜述。

結(jié)直腸癌；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；分離富集；臨床意義

0 前言

2015年中國結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)376 300，死亡例數(shù)達(dá)到191 000［1］。手術(shù)及放化療等綜合治療手段發(fā)展到今天，結(jié)直腸癌療效已較前有明顯改善，然而有文獻(xiàn)統(tǒng)計，仍有15%～20%的結(jié)直腸癌患者在診斷時就已發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，其余60%亦在后續(xù)的治療過程中發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移［2］。目前腫瘤標(biāo)志物如癌胚抗原（CEA）等在預(yù)測復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移方面的靈敏度和特異度都較低，且其和電子計算機斷層掃描檢查等均存在滯后性的特點。因此找到可以簡便而又精準(zhǔn)預(yù)測復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物尤為重要。外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells， CTCs）作為近年來臨床研究的熱點，在評估腫瘤療效及判斷預(yù)后等方面有著巨大的潛力。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞是指來源于原發(fā)腫瘤灶，在各種細(xì)胞細(xì)胞因子作用下進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，并逃離了宿主免疫殺傷后能在患者外周血檢測到異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞［3］。目前已在結(jié)直腸癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了CTCs的存在［4］。CTCs的發(fā)生被認(rèn)為和腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial?mesenchymal transition，EMT）機理相關(guān)，部分侵襲能力較強的CTCs通過EMT在受到EMT靶基因調(diào)控后，其上皮標(biāo)志物如鈣粘蛋白、細(xì)胞角蛋白等的表達(dá)下調(diào)而間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物如彈性蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶等表達(dá)上調(diào)［5］。因此，外周血中的CTCs可能是脫離癌灶進(jìn)入外周血中的上皮型CTCs，亦或是經(jīng)過EMT轉(zhuǎn)化從原發(fā)灶脫離從而循環(huán)在外周血的間質(zhì)型CTCs。總之，腫瘤轉(zhuǎn)移涉及到復(fù)雜的機制，而循環(huán)腫瘤細(xì)胞從癌灶脫離、侵犯并進(jìn)入機體循環(huán)是腫瘤轉(zhuǎn)移的開始階段，且為最終轉(zhuǎn)移灶的形成提供了可能。

當(dāng)前，CTCs檢測費比較昂貴，并且不同實驗室之間的檢測標(biāo)準(zhǔn)并未完全統(tǒng)一，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用推廣受到一定的限制。但隨著該技術(shù)不斷改進(jìn)、檢測標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范化及臨床數(shù)據(jù)的不斷完善，CTCs在為結(jié)直腸癌患者的預(yù)后、病情評估以及對治療的反應(yīng)等方面提供的參考價值越來越大。本文就CTCs的分離富集、檢測技術(shù)及結(jié)直腸癌患者中CTCs檢測的臨床意義進(jìn)行綜述。

1 CTCs的富集方法

CTCs的血液中的密度較低，要求在1億個白細(xì)胞與500億個紅細(xì)胞中尋找少數(shù)的幾個腫瘤細(xì)胞［6］，因此，首先需要通過富集技術(shù)將CTCs和血細(xì)胞二者分離開來。目前主要是通過物理或化學(xué)的原理特異性地收集CTCs，富集方法主要有免疫磁珠分離技術(shù)、CTCs芯片技術(shù)及膜濾過分離腫瘤細(xì)胞計數(shù)等。

1.1 免疫磁珠分離技術(shù)

免疫磁珠分離技術(shù)（IMS）是富集CTCs最常用的方法，其主要作用是讓靶細(xì)胞表面的抗原與表面包被抗體的磁珠相聯(lián)結(jié)，形成抗原－抗體－磁珠免疫復(fù)合物，形成抗原－抗體－磁珠免疫復(fù)合物。該復(fù)合物若被放于強大的磁場中，即能和其他沒被結(jié)合的細(xì)胞分離，從而達(dá)到與血細(xì)胞分離的目的［7］。按照其分離的方法分為陽性富集法和陰性富集法。前者使用表面偶聯(lián)抗CTCs細(xì)胞抗體的磁珠，細(xì)胞通過與磁珠結(jié)合，直接從磁場中被分離出來。其結(jié)合的細(xì)胞就是循環(huán)腫瘤細(xì)胞。后者則通過去除無關(guān)細(xì)胞使目的細(xì)胞得以純化，如廣譜標(biāo)記物CD45的磁珠，其針對白細(xì)胞表面抗原，可以有效地將有核細(xì)胞中的白細(xì)胞找出并排除，從而剩下沒被結(jié)合的CTCs，因此大大增加了CTCs的檢出數(shù)量［8］。Linuma等指出通過CD45磁珠的陰性富集，CTCs的富集效率為原來9倍［9］。而今多將這兩種富集策略聯(lián)合起來以進(jìn)一步減少血細(xì)胞的含量，提高CTCs富集效率，有報道稱這種方法的富集效率與一般的分離方法相比可提高1000倍以上［10］。

1.2 CTCs芯片技術(shù)

CTCs芯片技術(shù)是微流體原理學(xué)的實際應(yīng)用，該芯片將有關(guān)CTCs的表面標(biāo)記物（EpCAM）抗體包埋在芯片上，當(dāng)樣本緩慢經(jīng)過芯片平板時，EpCAM+細(xì)胞會因抗原抗體聯(lián)結(jié)而被捕獲，具有較高的靈敏度及特異性。據(jù)報道，該方法的敏感性達(dá)到了99.1%，而特異性為100%［11］。CTCs芯片技術(shù)的應(yīng)用前景廣泛。如Lu等甚至可通過CTCs芯片明確腫瘤來源，通過特制芯片可將結(jié)直腸癌和肺癌、前列腺癌等分辨開來［12］。

1.3 膜濾過分離腫瘤細(xì)胞技術(shù)

膜濾過分離腫瘤細(xì)胞技術(shù)（ISET）基于CTCs細(xì)胞與血細(xì)胞的大小不同來分離腫瘤細(xì)胞，通過特定孔徑大小的濾過膜將CTCs從外周血中分開來，每mL血液中可以提取到至少1個腫瘤細(xì)胞，敏感度高，且分離的CTCs保持完整［13］。但該富集方法不具有特異性，其主要適用于肺癌及胃癌等異質(zhì)性更為明顯的惡性腫瘤，當(dāng)出現(xiàn)抗原的交叉表達(dá)或差異表達(dá)，其假陽性率升高，這使得其應(yīng)用受到一定限制［14］。

2 CTCs的檢測方法

外周血中的CTCs經(jīng)過富集后，需采用特異性的檢測方法對CTCs及其分子進(jìn)行進(jìn)一步的檢測以完成最終鑒定。常用的檢測技術(shù)有免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（ICC）、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT?PCR）和流式細(xì)胞術(shù)（FCM）等。根據(jù)其檢測原理可分為兩大類：基于細(xì)胞免疫的標(biāo)記技術(shù)和基于核酸檢測的技術(shù)。

2.1 基于細(xì)胞免疫的標(biāo)記技術(shù)

這是最早也是最常用的技術(shù)，其采用抗原抗體結(jié)合的原理鑒定CTCs。常用的檢測手段有：①免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC），通過將單克隆抗體與腫瘤的特異性表達(dá)抗原相結(jié)合，并通過酶與底物反應(yīng)顯色對CTCs進(jìn)行測定。②流式細(xì)胞術(shù)（FCM），其可對樣本自動快速掃描且對細(xì)胞的形態(tài)學(xué)指標(biāo)、細(xì)胞活力、其他表面抗原等進(jìn)行檢測，對CTCs達(dá)到高特異性的鑒別，并且對其進(jìn)行分選［15］。

2.2 基于核酸的檢測技術(shù)

基于核酸水平的檢測主要是采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的方法檢測CTCs中的特異性核算片段，包括DNA和mRNA。DNA腫瘤標(biāo)記物檢測方法主要是通過檢測腫瘤患者外周血中的CTCs癌基因、抑癌基因的突變或染色體易位等產(chǎn)生的異常DNA。然而非常多實體腫瘤的DNA變化并無顯著的特異性，基本不用于CTCs檢測，適用范圍有限［16］；近年來，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT?PCR）逐漸成為了CTCs研究的重要手段，其已被廣泛應(yīng)用于結(jié)直腸癌中［17］。其靈敏度很高，該方法能夠在107～108個單核細(xì)胞中檢測出單個CTC［18］。RT?PCR的高敏感性容易帶來假陽性率高的問題，如Kowalewska等的研究說明炎癥反應(yīng)也可引起腫瘤抗原mRNA的升高［19］。

3 CTCs在結(jié)直腸癌治療中的臨床意義

3.1 CTCs與手術(shù)及操作的相關(guān)關(guān)系

Park等［20］的研究通過在手術(shù)前后采集外周血中并檢測CTCs中CEA和CK20的mRNA表達(dá)量發(fā)現(xiàn)手術(shù)過程中較手術(shù)前有增加的趨勢，提示手術(shù)可能一定程度上促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的血液播散。類似的研究發(fā)現(xiàn)，手術(shù)操作后48 h內(nèi)患者的CTCs數(shù)目上升，然而結(jié)果表明此時的CTCs不具有預(yù)后意義。若是術(shù)后CTCs持續(xù)存在，則是復(fù)發(fā)的危險因素，且與患者的無復(fù)發(fā)生存率密切相關(guān)［21］。在術(shù)前檢查方面，Koch等的一項研究發(fā)現(xiàn)14%的結(jié)直腸癌患者僅在結(jié)腸鏡檢查后才在外周血中檢測到了CTCs的存在，提示機械性操作可以導(dǎo)致活的結(jié)腸直腸癌細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的風(fēng)險增加［22］。盡管上述研究的臨床意義需要更多的數(shù)據(jù)支持，但也已足夠引起我們的重視，在進(jìn)行各種診療操作時，盡量選擇可替代方案或輕柔操作從而避免腫瘤細(xì)胞的醫(yī)源性血液播散。

3.2 CTCs與抗癌藥物療效及耐藥性的評估

腫瘤治療過程一個重要的挑戰(zhàn)就是如何選擇安全、可靠、及時的療效評估手段以驗證治療方法的有效性，CTCs檢測在這方面有重要的應(yīng)用價值。Lankiewicz等［23］發(fā)現(xiàn)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)方案的化療后，結(jié)直腸癌患者CTCs陽性率由化療前59%降至化療后的31%，其下降趨勢與影像學(xué)一致。Zhang等［24］通過對晚期結(jié)直腸癌患者化療期間的CTCs及其預(yù)后進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)CTCs的持續(xù)存在是接受化療的晚期結(jié)直腸癌患者無進(jìn)展生存期和總體生存率的獨立危險因素。隨著對CTCs研究的深入，研究者們已經(jīng)開始針對CTCs進(jìn)行相應(yīng)的基因檢測。Musella等［25］的研究指出通過CTCs的檢測，可以較早期地預(yù)測出抗EGFR治療的療效。在耐藥性方面，Abdallah等研究結(jié)果表明通過CTCs的胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TYMS）檢測可以預(yù)測出對5-FU抵抗的患者［26］。Yang等［27］指出在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的CTCs中可檢測到KRAS基因的突變，而且30%無該基因突變的患者在接受靶向治療的過程中發(fā)生了繼發(fā)性的KRAS基因突變，提示通過對CTCs及其分子的動態(tài)監(jiān)測，可指導(dǎo)靶向藥物的重點應(yīng)用，減少不必要的費用和藥物副作用。

3.3 CTCs與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后

CTCs在判斷患者預(yù)后方面起著重要的作用，在許多研究中已經(jīng)有報道CTCs可作為原發(fā)性結(jié)腸直腸癌預(yù)后標(biāo)志物［28，29］。Allen?Mersh等［30］對196例行根治性結(jié)直腸癌切除術(shù)的患者，在術(shù)后24 h進(jìn)行CTCs檢測，發(fā)現(xiàn)術(shù)后CTCs陽性患者最后出現(xiàn)復(fù)發(fā)的危險比高于術(shù)后病理淋巴結(jié)陽性的患者，且兩者均陽性的患者發(fā)生復(fù)發(fā)的概率明顯增加，說明術(shù)后進(jìn)行CTCs檢測可預(yù)測復(fù)發(fā)。而在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌方面，Cohen等人發(fā)現(xiàn)，CTCs≥2個是伴有肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后因素，且同圍手術(shù)期的死亡率相關(guān)［31］。類似地，Groot等［32］的一項薈萃研究表面在可切除的結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移或其他轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的外周血中的CTCs的檢測與疾病進(jìn)展和較差的存活率相關(guān)，并在多變量分析中證實CTCs檢測是一個單獨的預(yù)后因子。而相比起傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)記物如CEA，CTCs對結(jié)直腸癌患者有可能出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)示作用要早12個月左右［33］。

4 總結(jié)與展望

目前CTCs檢測的敏感性和特異性在逐步提高，但由于不同的實驗室檢測的結(jié)果有差異，未來有必要對CTCs的檢測進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化。另外，使用單一方法對CTsC進(jìn)行分析存在較大的缺陷，聯(lián)合多種特異性標(biāo)志物及多種方法檢測是重要的趨勢。在臨床意義方面，CTCs與結(jié)直腸癌患者術(shù)后接受化療甚至靶向治療的敏感與否與較大相關(guān)性，其高表達(dá)更與患者的不利預(yù)后相關(guān)。然而當(dāng)深入到分子機制方面，CTCs從原發(fā)灶脫離進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并最終定位于轉(zhuǎn)移灶的機制尚未定論。對于其轉(zhuǎn)移機制的研究及對CTCs亞群鑒定、針對不同亞群CTCs進(jìn)行個體化治療將是今后研究的重要方向。

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The development of circulating tumor cells in colorectal cancer

CHEN Chisheng，CHU Zhonghua. Department of Gastrointestinal Surgery，Sun Yat?sen Memorial Hospital，Sun Yat?sen University，Guang?zhou 510120，China.Corresponding author：CHU Zhonghua，chu9009@163.com

Although the efficacy of surgery，chemotherapy and radiotherapy in colorectal cancer has been greatly improved in recent years，15%-20%of patients with colorectal cancer had hepatic me?tastases when they were first diagnosed，and 60%of the rest experienced metastatic or recurrent tumors. As a focus of clinical research in recent years，circulating tumor cells have the tremendous potential in evaluating curative effect and prognosis.This article reviews the separation enrichment techniques，detec?tion techniques and clinical significance of circulating tumor cells in colorectal cancer.

colorectal cancer；circulating tumor cells；separation enrichment techniques；clin?ical significance

R735.3+.5；R735.3+.7

A

10.3969/j.issn.1009?976X.2017.02.024

2017-01-13）

廣東省自然科學(xué)基金（2016A30313353）

510120廣州中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院胃腸外科

*通訊作者：褚忠華，Email：chu9009＠163.com