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    白細(xì)胞介素-1β促進(jìn)人真皮成纖維細(xì)胞分泌促血管生成及炎癥因子

    2017-03-06 16:37:39潘毛毛呂婷張潔塵聶舒繆飛王宏偉
    老年醫(yī)學(xué)與保健 2017年4期
    關(guān)鍵詞:纖維細(xì)胞抑制率生長因子

    潘毛毛,呂婷,張潔塵,聶舒,繆飛,王宏偉

    復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院皮膚科,上海200040

    白細(xì)胞介素-1β促進(jìn)人真皮成纖維細(xì)胞分泌促血管生成及炎癥因子

    潘毛毛,呂婷,張潔塵,聶舒,繆飛,王宏偉

    復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院皮膚科,上海200040

    目的探討IL-1對人真皮成纖維細(xì)胞(human dermal fibroblast,HDF)的細(xì)胞抑制率、促血管生成因子和炎癥因子分泌的影響。方法CCK8法檢測不同濃度IL-1對HDF的細(xì)胞抑制率,ELISA法檢測3,10ng/m L IL-1處理HDF 24h后上清中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、IL-6的表達(dá)。結(jié)果0.3、1、3、10ng/m L IL-1對HDF的抑制率分別為(1.22±0.78)%,(3.72±1.21)%,(9.10±2.60)%,(14.42±3.36)%。3、10ng/m L IL-1作用于HDF 24h后,兩組上清的VEGF、FGF水平較空白對照組均升高(FGF<0.05,VEGF<0.01),3,10ng/m l IL-1兩個濃度組間無統(tǒng)計學(xué)差異。3、10ng/m L IL-1兩組HDF上清中IL-6濃度較空白對照組均增加(<0.05,<0.001),且10ng/ m L IL-1組較3ng/m L組IL-6濃度更高,有統(tǒng)計學(xué)差異(<0.001)。結(jié)論IL-1可促進(jìn)HDF分泌VEGF、FGF和IL-6,提示IL-1可能通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌促血管生成和炎癥因子,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生成、浸潤和轉(zhuǎn)移。

    人真皮成纖維細(xì)胞;白介素-1;成纖維細(xì)胞生長因子;血管內(nèi)皮生長因子;白介素-6

    成纖維細(xì)胞,作為合成、重塑細(xì)胞外基質(zhì)的主要效應(yīng)細(xì)胞,還通過分泌生長因子和機(jī)械收縮,支持血管生成和腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[1]。白細(xì)胞介素-1 (interleukin1,IL-1)參與活化正常成纖維細(xì)胞,使其表達(dá)腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白,促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[2]。IL-1能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和主動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)皮血管生長因子(vascularendothelialgrow th factor,VEGF)及其受體的表達(dá),在腫瘤介導(dǎo)的血管生成中發(fā)揮重要作用[3,4]。目前IL-1是否通過成纖維細(xì)胞分泌可溶性細(xì)胞因子,參與腫瘤血管生成和慢性炎癥反應(yīng)尚不清楚,故本研究擬通過觀察IL-1對體外培養(yǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞(human dermal fibroblast cell,HDF)分泌VEGF、FGF、IL-6的影響,初步探討IL-1對成纖維細(xì)胞分泌促血管生成因子及炎癥因子的影響,為進(jìn)一步完善IL-1通過成纖維細(xì)胞促進(jìn)腫瘤血管生成和進(jìn)展提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要實驗材料及來源HDF、成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基FM購自ScienCell公司;DMEM高糖培養(yǎng)基購自HyClone公司;胎牛血清FBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA購自Gibco公司;青霉素-鏈霉素購自Invitrogen-Gibco公司;人重組IL-1 10g購自PeproTech公司;human VEGF、IL-6ValukineELISA試劑盒購自R&D公司;human FGFELISA試劑盒、CCK8試劑盒購自上海威奧生物科技有限公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 HDF細(xì)胞培養(yǎng)HDF置于含2%FBS、1%FGS、1%青霉素-鏈霉素的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中,37℃,5% CO2常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞長滿至80%左右胰酶消化2m in,800r/min,5min離心收集下層細(xì)胞,1∶2傳代培養(yǎng)。

    1.2.2 CCK-8檢測IL-1對HDF細(xì)胞抑制率:HDF以6×104個/m L,100L/孔的密度鋪96孔板,37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h,加入10L不同濃度(0.3,1,3,10ng/m L)的IL-1與細(xì)胞共孵育24h,加入CCK8試劑10L/孔,孵育90m in酶標(biāo)儀檢測450 nm處的OD值。細(xì)胞抑制率=([對照組-實驗組)/(對照組-空白組)]×100%

    1.2.3 HDF上清液的制備 無血清DMEM重懸混勻HDF細(xì)胞,細(xì)胞計數(shù)后按3×105個/m L,1m L/孔的密度鋪12孔板,37℃,5%CO2常規(guī)培養(yǎng)24h。第2天12孔板HDF細(xì)胞棄上清,PBS沖洗2次,添加(空白對照組不添加,低濃度LC組3ng/m L,高濃度HC組10ng/m L)人重組IL-1的無血清DMEM培養(yǎng)液各1m L,37℃,5%CO2作用24h。第3天收集上清,4℃,3 000g,15m in離心,小心吸取上層液體,行雙抗體夾心ELISA法檢測細(xì)胞因子。

    1.2.4 細(xì)胞因子的測定采用ELISA試劑盒測定細(xì)胞上清中FGF、VEGF、IL-6水平,嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作:準(zhǔn)備洗滌劑、稀釋劑、標(biāo)準(zhǔn)品母液,加入標(biāo)準(zhǔn)品

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,各組數(shù)據(jù)用單因素方差分析,<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。

    2 結(jié)果

    2.1 IL-1對HDF的形態(tài)改變和細(xì)胞抑制率200倍顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),在0.3,1ng/m L IL-1刺激下,細(xì)胞形態(tài)與對照組無差異;在3,10ng/m L IL-1刺激下,HDF折光性增強(qiáng),邊界銳化,細(xì)胞間連接增多,更向長梭形發(fā)展,未見凋亡細(xì)胞。0.3,1,3,10ng/ m L IL-1對HDF的抑制率分別為(1.22±0.78)%,(3.72±1.21)%,(9.10±2.60)%,(14.42±3.36)%,均不超過15%,見圖1。

    圖1 不同濃度IL-1處理HDF24 h后的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞抑制率

    2.2 IL-1對HDF分泌促血管因子的影響低濃度LC組和高濃度HC組3,10ng/m l的IL-1作用于HDF24h后,兩組上清的FGF水平均升高,與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=5.159,<0.05),低濃度LC組和高濃度HC組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。LC組和HC組3,10ng/m l的IL-1作用于HDF24h后,兩組上清的VEGF水平均升高,與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=16.23,<0.01),低濃度LC組和高濃度HC組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義,見圖2。

    2.3 IL-1對HDF分泌IL-6的影響LC組和HC組3,10ng/m L的IL-1作用于HDF 24h后,上清中IL-6濃度與對照組相比均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=50.59,LC組<0.05,HC組<0.001),高濃度的HC組與低濃度LC組相比HDF上清中IL-6升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.001),見圖3。

    圖2 不同濃度IL-1作用HDF 24 h后上清HGF、VEGF濃度

    3 討論

    腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞,通過直接接觸腫瘤細(xì)胞或者分泌可溶性成分,促進(jìn)血管形成、腫瘤細(xì)胞存活和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelia-mechenchymal transition, EMT),從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移,是一個極具吸引力的降低腫瘤耐藥和復(fù)發(fā)的治療靶點[5]。皮膚腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)存在標(biāo)本難獲得、培養(yǎng)過程復(fù)雜、細(xì)胞不能穩(wěn)定傳代等缺點,而腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞是由正常成纖維細(xì)胞活化而來,因此我們選用HDF替代腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞,初步探討IL-1對體外培養(yǎng)的HDF的作用。

    圖3 不同濃度IL-1作用HDF 24 h后上清IL-6濃度

    Seok Lee等[6]研究發(fā)現(xiàn)IL-1能促進(jìn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖,且具有濃度依賴性。我們?yōu)榱撕Y選適宜的IL-1作用濃度,檢測常用實驗濃度IL-1對HDF的細(xì)胞抑制率,發(fā)現(xiàn)3,10ng/m L的IL-1對HDF的細(xì)胞抑制率均不足15%,且形態(tài)學(xué)上激活成纖維細(xì)胞,所以后續(xù)實驗我們采用以上兩個濃度。與既往研究不同,本實驗未發(fā)現(xiàn)IL-1對HDF有促增殖作用,可能與選擇的成纖維細(xì)胞類型、具體濃度不同有關(guān)。

    VEGF和FGF在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和雞胚胎絨毛膜實驗的初試活化階段有協(xié)同作用,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、分化和基質(zhì)降解,是腫瘤血管生成關(guān)鍵的促血管生長因子[7]。KIM等[8]研究顯示1ng/m L的IL-1刺激內(nèi)皮細(xì)胞和滑膜細(xì)胞24h后,上清中VEGF增加。我們研究發(fā)現(xiàn)3,10ng/m L的IL-1刺激HDF增強(qiáng)分泌VEGF、FGF,提示IL-1可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞參與血管生成和發(fā)展,與其他學(xué)者研究結(jié)果類似,推測在皮膚腫瘤中,IL-1誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中各種成纖維細(xì)胞(包括肌成纖維細(xì)胞、腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞等活化的成纖維細(xì)胞)分泌多種促血管生成因子,直接促進(jìn)腫瘤血管生成,并參與構(gòu)建促瘤的腫瘤微環(huán)境。

    最新研究證實IL-6升高與口咽部鱗癌、食管鱗癌預(yù)后不良和早期復(fù)發(fā)高度相關(guān),IL-6主要通過JAK/ STAT3通路介導(dǎo)EMT,也通過VEGF增強(qiáng)了血管和淋巴管生成,從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[9]。Paik等[10]研究顯示眼眶成纖維細(xì)胞在10ng/m L IL-1刺激24h后分泌的IL-6濃度增強(qiáng)13倍。諸多研究表明,IL-1誘導(dǎo)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞合成IL-6[11],本實驗我們也觀察到IL-1具有刺激HDF分泌IL-6的作用,而且高濃度組分泌水平高于低濃度組,可見IL-1促進(jìn)HDF分泌IL-6可能存在濃度依賴性。本研究提示IL-1促進(jìn)正常成纖維細(xì)胞成分泌大量IL-6,除了協(xié)同VEGF、FGF等參與腫瘤血管和淋巴管生成外,還可能通過IL-6誘導(dǎo)的EMT促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲。

    [1]Coleman DT,Gray AL,StephensCA,.Repurposed drug screen identifiescardiac glycosidesas inhibitorsof TGF--induced cancer-associated fibroblast differentiation[J].Oncotarget, 2016,7(22):32200-32209.

    [2]Chen H,YangWW,WenQT,.TGF-beta induces fibroblast activation protein expression;fibroblast activation protein expression increases theproliferation,adhesion,andm igration of HO-8910PM[corrected[J].Exp Mol Pathol,2009,87(3): 189-194.

    [3]Voronov E,Carm iY,ApteRN.The role IL-1 in tumor-mediated angiogenesis[J].FrontPhysiol,2014,5:114.

    [4]Marech I,LeporiniC,AmmendolaM,.Classicaland nonclassicalproangiogenic factorsasa targetof antiangiogenic therapy in tumormicroenvironment[J].Cancer Lett,2016,380 (1):216-226.

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    IL-1 Promotes the Secretion of Angiogenic and Inflammatory Factors in Human Dermal Fibroblast

    Pan Maomao,LüTing,Zhang Jiechen,Nie Shu,M iao Fei,Wang Hongwei*
    Departmentof Dermatology,Huadong HospitalAffiliated to Fudan University,Shanghai,200040,P.R.China

    Objective Toexplore the roleof interleukin-1(IL-1)in inhibiting thegrow th ofhuman dermal fibroblast (HDF)and in promoting HDFsecretion ofangiogenic and inflammatory factors.Methods CCK8wasapplied in detecting the grow th inhibiting rateof HDF treatedw ith IL-1 of differentconcentrationswhile ELISA wasapplied in detecting theexpression levelsofvascularendothelialgrow th factor(VEGF),fibroblastgrow th factor(FGF)and IL-6 in HDF treatedw ith 3and 10ng/ m L IL-1 for 24 hours.Results The grow th inhibiting rate of HDF treated w ith 0.3ng/m L IL-1,1 ng/m L IL-1,3 ng/m L IL-1 and 10ng/m L IL-1 was(1.22±0.78)%,(3.72±1.21)%,(9.10±2.60)%and(14.42±3.36)%respectively;theexpressions ofVEGFand FGFin3and 10ng/m l IL-1 group increased significantly andwerehigher than those inblank controlgroup(VEGF<0.01,FGF<0.05)while there existed no statisticaldifference in the expressionsbetween 3 and 10ng/m l IL-1 group;the expressions of IL-6 in 3 and 10ng/m l IL-1 group were higher than that in blank controlgroup<0.05,<0.001)while the expression of IL-6 in 10ng/m l IL-1 group wasmuch higher than that in 3ng/m l IL-1 group(<0.001).Conclusions IL-1 can promote HDFsecretion of VEGF,FGFand inflammatory cytokine IL-6,which indicates that IL-1 may promote the tumorigenesis,invasion andmetastasis..

    human dermal fibroblast(HDF);interleukin-1(IL-1);fibroblastgrow th factor(FGF);vascular endothelialgrow th factor(VEGF);IL-6

    2017-06-12)

    (本文編輯:陳培蓮)

    國家自然科學(xué)基金(81572671)

    王宏偉,hongweiwang2005@aliyun.com

    *Corresponding author:Wang Hongwei,E-mail:hongweiwang2005@aliyun.com

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