核酸檢測應(yīng)注意的幾個問題*

余霖 陳慶愷 何子毅

·綜述·

核酸檢測應(yīng)注意的幾個問題*

余霖 陳慶愷 何子毅

核酸檢測 Cobas s201 樣本 試劑使用率 儀器維護(hù)

提高經(jīng)血傳播傳染病的檢出率，降低經(jīng)血傳播傳染病一直是保證血液安全的重要課題。酶聯(lián)免疫法（ELISA）作為傳統(tǒng)檢測手段，由于方法學(xué)上的局限性，加之“窗口期”較長等原因，存在漏檢現(xiàn)象，嚴(yán)重影響輸血安全性[1]。而核酸檢測（Nucleic acid test，NAT）對象為病毒核酸，可以明顯縮短ELISA的“窗口期”[2]；此外，NAT還可以檢測出因病毒變異、免疫靜默感染等造成的漏檢[3]。歐美國家在20世紀(jì)90年代陸續(xù)將NAT納入常規(guī)血液篩查中，我國2012年發(fā)布的《衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃》中，明確提出了“到2015年，血液篩查核酸檢測基本覆蓋全國”的目標(biāo)[4]。我站從2004年開始科研性地應(yīng)用核酸檢測無償獻(xiàn)血者血樣本，已完成了50多萬例次的核酸樣本檢測，在樣本管理、試劑管理、設(shè)備管理和防污染方面積累了一定的經(jīng)驗，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 樣本管理 在影響血液篩查結(jié)果的眾多因素中，樣本因素是首要的。在我國，涉及到NAT樣本要求的法規(guī)主要包括《血站技術(shù)操作規(guī)程（2015版）》、《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》、《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范》等?！堆炯夹g(shù)操作規(guī)程（2015版）》于2016年3月1日正式實施，各級采供血機構(gòu)必須執(zhí)行，該法規(guī)對樣本管理提出了明確要求，用于血樣采集的樣本管應(yīng)采用EDTA-K2

抗凝劑且為帶有分離膠的真空負(fù)壓試管，同時對樣本的離心條件和保存運輸溫度作了較詳細(xì)的規(guī)定。在《血站核酸檢測實驗室質(zhì)量保證指南》中還規(guī)定了核酸樣本采集后離心的時間要求、核酸樣本的質(zhì)量核查要求，即無溶血、無稀釋、無脂血、足量，并且樣本管完整、標(biāo)識符合規(guī)范，對不合格樣本管理也作了具體規(guī)定，存在質(zhì)量問題的樣本一般在樣本交接時目視判斷。羅氏核酸檢測試劑說明書建議EDTA-K2抗凝全血在2℃～25℃下可保存48 h，隨后在2℃～8℃下可保存72 h，血漿分離后在2℃～8℃下可保存7 d，在低于–18℃下可保存20 d，最多可凍融3次。

在實際工作中，絕大多數(shù)情況下按照試管生產(chǎn)廠家提供的離心參數(shù)（如BD核酸專用試管推薦的離心參數(shù)為：25℃，1 100 g離心力，離心10 min），可以實現(xiàn)離心后分離膠將血漿和紅細(xì)胞分隔，但仍有離心后分離膠未完全分隔血漿和紅細(xì)胞的情況。回顧2013年1月～2015年8月混樣失敗的數(shù)據(jù)，以夏季炎熱月份明顯多于其他月份，表現(xiàn)為離心后有分離膠液滴漂浮在血漿表面，混樣時分離膠液滴堵塞加樣針頭引起失敗。出現(xiàn)上述情況的原因可能是分離膠在高溫下變性，也可能與試管本身的質(zhì)量或試管的運輸、儲存條件有關(guān)；混樣失敗還與抗凝不充分時有纖維蛋白析出和嚴(yán)重脂肪血樣本在低溫保存后血漿上層出現(xiàn)白色脂肪滴有關(guān)。

核酸樣本采集后要求在4 h內(nèi)送抵實驗室，若不能保證就要在采血現(xiàn)場離心，因此部分采血點要配備離心機，樣本離心后放置4℃±2℃冰箱保存，核酸樣本從采血點運送到實驗室一般采用冷藏運輸箱。但在運輸過程中，箱內(nèi)實際溫度可能已高于2℃～10℃，尤其在夏季更難保證。姚鳳蘭等[5]分析不同溫度、時間和不同采血管對諾華NAT結(jié)果的影響，結(jié)果顯示聯(lián)檢陽性的樣本最好在2 d內(nèi)鑒別檢測。本實驗室也對不同溫度下不同濃度陽性樣本檢出率做了初步比較，結(jié)果顯示室外溫度（30℃左右）、室溫（25℃左右）和冷藏冰箱（4℃±2℃）條件下，高、中、低3種濃度陽性樣本檢出率沒有明顯差異。這說明當(dāng)環(huán)境溫度符合羅氏核酸試劑對標(biāo)本要求時，仍能保證檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度，尚需進(jìn)一步證實。

總之，應(yīng)使用核酸檢測專用試管，采血時按規(guī)范要求完成樣本的抗凝處理，嚴(yán)格按照核酸試管生產(chǎn)廠家的離心要求操作、4 h內(nèi)離心，2℃～10℃保存運輸，72 h內(nèi)完成檢測。

2 試劑管理 目前核酸試劑的成本較高?；仡?013年1月～2016年1月我站試劑使用數(shù)據(jù)，平均每年的試劑有效使用率{試劑有效使用率=每月實際檢測人份數(shù)/[每月試劑使用總測試孔數(shù)×480（1盒試劑可做480人份）/96（1盒試劑可做96孔測試）]×100%}在逐步提高，2015年已達(dá)86%以上，2016年達(dá)90%左右；影響試劑有效使用率的因素主要為日常室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評、單獨檢測血小板樣本和混檢陽性樣本拆分等[6]。由于加強了實驗室人員的培訓(xùn)和儀器的維護(hù)保養(yǎng)，使人為因素和儀器故障引起的試劑損耗大大減少，試劑的主要損耗為單獨檢測血小板樣本。當(dāng)我站獻(xiàn)血服務(wù)科外采組休息停止采血時，檢測總樣本數(shù)少于120人份，即未達(dá)到核酸“滿架”數(shù)量，由于單采血小板的臨床需求及有效期短，在采集和運輸血小板標(biāo)本已占去1 d的情況下，第2 d就應(yīng)檢測單采血小板樣本。因參與混檢樣本數(shù)減少，相應(yīng)的混檢測試數(shù)也減少，使得用于陰陽對照和日常室內(nèi)質(zhì)控的測試數(shù)所占比例增加，導(dǎo)致試劑有效使用率降低；混檢陽性后的拆分也使有效使用率降低，也是不滿架的原因。國內(nèi)有學(xué)著認(rèn)為室間質(zhì)評樣本與已知NAT陰性樣本進(jìn)行混檢，既符合質(zhì)評樣本按常規(guī)樣本檢測對待的原則，又能節(jié)約試劑成本，并加快血液放行速度[7]，這也是提高試劑有效使用率的方法。盡量實現(xiàn)“滿架上機”，即每天僅采用一套核酸檢測系統(tǒng)，除了做室內(nèi)質(zhì)控的那一架為114個樣本外，其他盡量為120個或120的倍數(shù)。今年，我站供血部門建立并完善了預(yù)約發(fā)放單采血小板的制度，能有效減少單獨檢測血小板樣本造成的試劑損耗，進(jìn)一步提高了試劑有效利用率。

3 設(shè)備管理 使用時嚴(yán)格依照操作規(guī)程要求做好日常維護(hù)。日常維護(hù)中，混樣儀用75%乙醇擦拭Core-Tip金屬擋板，丟棄廢物桶中垃圾，并更換新垃圾袋，用75%乙醇清潔儀器外罩；提取儀用75%乙醇擦拭定位樁、機內(nèi)平臺，并清潔試劑針頭，清潔樣本處理單元（SPU）鉗子的抓手，清潔當(dāng)天要用到的試劑架、樣本架和SPU架，擦拭K-carrier，清潔儀器外罩。開始試驗前要注意實驗室的溫濕度，尤其在夏季高溫高濕條件下，要提前打開空調(diào)降溫除濕，使溫度不高于25℃，濕度不高于70%，以免儀器在運行時出現(xiàn)意外故障。儀器的液路管道系統(tǒng)方面要注意2個洗液導(dǎo)管中是否有氣泡，注射器是否有滲漏和結(jié)晶。若洗液導(dǎo)管中氣泡量少且較小，可以用手指輕彈有氣泡的導(dǎo)管；若氣泡較多、體積較大，可以嘗試用軟件系統(tǒng)中的長沖洗功能；若長沖洗后仍有氣泡，可能是液路系統(tǒng)的氣密性有問題，建議聯(lián)系工程師檢查液路系統(tǒng)。日常維護(hù)時要注意軟件系統(tǒng)中的其他維護(hù)提示，及時對有關(guān)部件進(jìn)行周期性維護(hù)和更換。COBAS@ TaqMan（CTM）維護(hù)主要是擦拭機內(nèi)定位樁、工作平臺和K-carrier，清潔儀器外罩。以上維護(hù)過程中最好使用無紡布擦拭和清潔，以免有線頭或纖維絲落入儀器內(nèi)部，增加污染和導(dǎo)致儀器故障。準(zhǔn)備耗材時，有條形碼的卡條必須檢測其松緊度，可將卡條放置在樣本架（SK24）卡槽內(nèi)，觀察其自由下落的情況，若下落到卡槽內(nèi)的距離較深，說明卡條位置較松，卡條必須丟棄。卡條與S-tube結(jié)合過緊也需丟棄。將SPU裝載到SPU架子時，一定要按箭頭方向并靠右側(cè)孔位放置，放置時用力按壓使每個SPU都與架子緊密相貼。

試劑的平衡需在儀器內(nèi)完成，以免從冰箱取出時溫度較低遇到水汽凝集而導(dǎo)致模糊難辨，影響儀器對試劑的識別，一般做完維護(hù)后就可以放入[8]。試劑放入時要與上次所使用的提取儀型號相對應(yīng)，以免出現(xiàn)試劑數(shù)量識別錯誤的情況。需要注意的是每組試劑都有3個有效期的限制，即試劑本身的有效期，在儀器內(nèi)累計不能超過40 h，開啟后累計不能超過20 d，且同一組試劑里，后2個的時間不能相差過大，否則儀器會判定試劑失效。

4 防污染管理 核酸檢測的潛在污染可能來自以下幾個方面：擴增產(chǎn)物、室內(nèi)/室間質(zhì)控物、實驗室環(huán)境中的污染物及陽性樣本。s201針對潛在污染具備4種防污染設(shè)計：全自動封閉系統(tǒng)并內(nèi)置紫外燈；即插即用型試劑盒；閉管進(jìn)，閉管出；AmpErase酶（尿嘧啶-N-轉(zhuǎn)葡萄糖激酶）。全自動封閉系統(tǒng)、即插即用型試劑盒以及S-tube在進(jìn)入和離開儀器時都保持閉管狀態(tài)，可有效阻止實驗室環(huán)境中的污染物影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；內(nèi)置紫外燈和AmpErase酶可有效防止儀器內(nèi)可能殘留的擴增產(chǎn)物對實驗的影響。

擴增產(chǎn)物是最容易出現(xiàn)的污染，通常一次典型的PCR擴增可以產(chǎn)生109拷貝的靶序列，若氣溶膠化，最小的氣溶膠都會含有106拷貝的擴增產(chǎn)物，這些氣溶膠的累積會污染實驗室內(nèi)的試劑、儀器設(shè)備和通風(fēng)設(shè)備，使檢測結(jié)果出現(xiàn)異常[9]。實驗室污染的征兆主要表現(xiàn)為出現(xiàn)大量異常結(jié)果，尤其是陰性、陽性對照結(jié)果異常，如陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果、陽性對照出現(xiàn)非對應(yīng)項目的陽性等。

防止室內(nèi)/室間質(zhì)控物與樣本及樣本間的交叉污染，需要操作人員在開蓋、轉(zhuǎn)移樣本架等過程中防止液體飛濺，并以無菌操作完成相關(guān)操作。每次實驗室開始前和結(jié)束后應(yīng)認(rèn)真完成儀器的例行維護(hù)，用500 mg/L（2 000 mg/L）二溴海因?qū)嶒炇遗_面和地面進(jìn)行清潔，并用紫外線和臭氧對實驗室空氣進(jìn)行消毒，也能有效消除擴增產(chǎn)物遺留造成的污染。

實驗室環(huán)境中的污染包括混樣后的SK24架通過傳遞窗傳送，傳遞窗為密封嚴(yán)實的雙開門，且相互連鎖，當(dāng)一側(cè)的門未關(guān)嚴(yán)時，另一側(cè)的門無法打開；全自動開蓋機使用前做好確認(rèn)工作，保障開蓋過程不會造成樣本間的交叉污染[10]。每次開蓋后及時拿走已開蓋的樣本，防止儀器在丟棄蓋子時有液體飛濺導(dǎo)致其他意外的污染。防止氣溶膠產(chǎn)生的污染可以通過設(shè)置實驗室不同分區(qū)間空氣的流動方向來實現(xiàn)。我們根據(jù)自身條件將核酸實驗室分為2部分：標(biāo)本混樣區(qū)和提取擴增檢測區(qū)，2區(qū)分別有相互獨立且不互通的排風(fēng)系統(tǒng)，一方面能將本區(qū)內(nèi)產(chǎn)生的氣溶膠及時排除，另一方面2區(qū)之間的空氣不會相互流通，避免其間可能的氣溶膠交換。室內(nèi)/室間質(zhì)控物和樣本分別存放于標(biāo)本混樣區(qū)指定區(qū)域，避免其與提取擴增檢測區(qū)中提取和擴增檢測儀器可能的接觸，也防止?jié)撛诘年栃詷颖緦嶒炇噎h(huán)境和儀器的污染。

經(jīng)過這些年來對s201的使用，我們認(rèn)為該檢測系統(tǒng)自動化和智能化程度高，人為干擾因素少。質(zhì)量保證的關(guān)鍵還是樣本質(zhì)量和操作人員規(guī)范化操作的執(zhí)行力度。防污染的思想在實驗室設(shè)計時就應(yīng)考慮到，并貫穿于SOP和工作人員的培訓(xùn)中。沒有合格的樣本、合格的操作者，再好的儀器也不能發(fā)揮其功能。

1 趙俊鵬，田喜鳳，賈幼珍，等. 血液病毒核酸檢測與酶聯(lián)免疫檢測比較研究[J].中國病原生物學(xué)雜志，2011，10（5）：732-735.

2 Wiedmann M，Kluwick S，Walter M，et al. HIV-1，HCV and HBV seronegative window reduction by the new Roche cobas TaqScreen MPX test in seroconverting donors[J]. J Clin Virol，2007，39（4）：282-287.

3 王悅，韓玲，趙偉平.20例輸血感染案例引起的思考[J].中國輸血雜志，2002，6（15）：216-218.

4 衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃[EB/OL]. [2 0 1 5-09-16]. http：//www.gov.cn/zwgk/2012-10/19/content_2246908.htm.

5 姚鳳蘭，陳瑜，汪德海，等. 標(biāo)本保存溫度、時間和不同采血管對核酸檢測結(jié)果的影響[J].中國輸血雜志，2012，25（6）：530-533.

6 寸偉，何清，張珂，等.血液篩查實驗室核酸檢測試劑損耗控制的探討[J].中國輸血雜志，2014，27（2）：166-168.

7 王慶敏，蔣呢真，朱紹汶，等.室間質(zhì)評樣本混樣核酸檢測模式的探討[J].中國輸血雜志，2012，25（12）：1297-1298.

8 陳科，馬洪濱，李，等.羅氏COBAS AmpliPrep全自動PCR分析儀的應(yīng)用與維護(hù)[J].中國醫(yī)學(xué)裝備，2013，10（11）：125-126.

9 李金明. 實時熒光PCR技術(shù)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2014.

10 汪德海，葛紅衛(wèi).自動開蓋機在血站核酸檢測實驗室使用前確認(rèn)[J].中國輸血雜志，2012，25（6）：536-537.

R392.11

A

1671-2587（2017）05-0528-03

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.05.038

*本課題受廣東省東莞市醫(yī)療衛(wèi)生一般項目（No.2015105101245）資助

523930 廣東省東莞市中心血站

余霖（1978–），男，江西九江人，主管檢驗師，主要從事血液核酸檢測研究，（E-mail）yulin587@126.com。

2016-03-06）

（本文編輯：姚萍）