NLRs信號轉導通路在真菌感染中的作用機制

彭陽，史偉峰

(蘇州大學附屬第三醫(yī)院檢驗科，江蘇常州 213003)

·綜述·

NLRs信號轉導通路在真菌感染中的作用機制

彭陽，史偉峰

(蘇州大學附屬第三醫(yī)院檢驗科，江蘇常州 213003)

核苷酸結合寡聚域樣受體(NLRs)是一類存在于胞質中的模式識別受體(PRRs)。NLRs通過識別病原體相關分子模式(PAMPs)，激活下游信號轉導通路，誘導細胞因子分泌，在抵抗病原菌入侵及維持機體免疫系統(tǒng)穩(wěn)定的過程中起著重要作用。近年來，真菌感染逐年上升，而NLRs在真菌感染的相關疾病中發(fā)揮作用。研究NLRs及其下游信號轉導通路,將對真菌感染性疾病的免疫調節(jié)和臨床治療提供思路。該文就NLRs信號轉導通路在真菌感染中的作用機制作一綜述。

NLRs信號轉導通路；固有免疫；真菌感染

模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)是指單核/巨噬細胞和樹突狀細胞等固有免疫細胞表面或胞漿、胞內器室膜上和血清中一類能夠直接識別病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMPs)或宿主凋亡細胞和衰老細胞表面某些共有特定分子結構的受體。PRRs對PAMPs的識別作用是啟動固有免疫應答的關鍵。

目前發(fā)現(xiàn)的PRRs主要包括Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)、維甲酸誘導基因I樣受體(RIG-I like receptors，RLRs)、核苷酸結合寡聚域樣受體(Nod like receptors，NLRs)、C型凝集素樣受體(C-type lectin receptors，CLRs)、DNA依賴的干擾素調節(jié)基因激活因子(DNA-dependent activator of interferon regulatory factor，DAI)、黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)等[1]。其中，TLRs和CLRs在抗真菌感染免疫中的作用已得到證實[2-4]。目前發(fā)現(xiàn)NLRs信號轉導通路在真菌感染過程中發(fā)揮著重要作用，本文就其在真菌感染中的作用機制研究進展作一綜述。

1 NLRs家族

1.1 NLRs家族基因定位 NLRs家族是一類進化上比較保守的蛋白質。哺乳動物體內存在少量的NLRs蛋白質[5]。迄今為止，NLRs家族已有至少22種人類成員和34種鼠源成員[6]。22種人類成員中，NLRA編碼基因定位于16p13.13；NLRB定位于5q13.2；NOD1、NOD2、NLRC3、NLRC4、NLRC5、NLRX1分別定位于7p14.3、16q12.1、16p13.3、2p22.3、16q13、11q23.3；NLRP1定位于17p13，NLRP2、NLRP7、NLRP12定位于19q13.42，NLRP3定位于1q44， NLRP4、NLRP5、NLRP8、NLRP9、NLRP11、NLRP13定位于19q13.43，NLRP6定位于11p15.5，而NLRP10、NLRP14則定位于11p15.4[7]。

1.2 NLRs家族分類 NLRs具有3個共同的結構域: N末端效應器結構域，位于中心的核苷酸結合寡聚化結構域(NACHT結構域)，C末端的亮氨酸重復序列(leucine-rich repeats，LRRs)[8]。NACHT結構域本身包含1個ATP酶核苷酸結構域(nucleotide-binding domain，NBD)、1個螺旋結構域1(helical domain 1，HD1)和1個翼螺旋結構域(winged-helix domain，WHD)，主要調節(jié)依賴ATP的NLRs寡聚化。C末端的LRR區(qū)域主要負責識別配體和調節(jié)NLRs活性，在NACHT結構域和LRR結構域之間存在螺旋域2(helical domain 2，HD2)[9]。N末端效應器結構域通過和其他蛋白質之間的相互作用發(fā)揮效應器的功能[10]。根據N末端效應器結構域的差異可將NLRs分為4類亞家族：酸性轉錄激活結構域(the acidic transactivation domain，TA/NLRA)、桿狀病毒抑制重復結構域(the baculoviral inhibitory repeat-like domain，BIR/NLRB)、半胱天冬酶激活和招募結構域(the caspase activation and recruitment domain，CARD/NLRC)、熱蛋白結構域(the pyrin domain，PYD/NLRP)[7]。NLRA亞家族只有MHCⅡ類反式激活蛋白(the MHC-Ⅱ transactivator，CⅡTA)1個成員；NLRB亞家族在N末端存在1個BIR結構域，在人類僅發(fā)現(xiàn)神經元凋亡抑制蛋白(NAIP) 1個成員，而鼠源中存在NAIP1-6個成員[11]。NLRC亞家族由NLRC1(NOD1)、NLRC2(NOD2)、NLRC3、NLRC4、NLRC5和NLRX1 6個成員構成，而NLRC3、NLRC5和NLRX1并沒有確定的NH2端結構域，歸類于這個亞家族是由于其系統(tǒng)發(fā)育關系和同源性。NLRC亞家族的特點是含有1個或2個CARD結構域，可以通過招募半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1)傳遞下游信號[12]。NLRP亞家族由NLRP1-14構成。其中NLRP1、2、3、6、7、12和NLRC4、5可參與炎癥小體的組裝[13-15]。

研究表明，NLRs具有識別病原微生物、參與組織和器官的損傷、控制細胞死亡等多種生物學功能[16]?；罨蟮腘LRs可參與自噬、信號轉導、轉錄激活和炎性小體的形成等過程[17]，主要誘導NF-κB途徑、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途徑及炎癥小體信號通路活化，刺激各種炎癥因子或趨化因子合成、釋放，啟動固有免疫應答和適應性免疫應答。

2 NLRs信號轉導通路在真菌感染中的作用及機制

固有免疫是宿主抵御入侵病原微生物的第一道防線。目前發(fā)現(xiàn)與真菌感染密切相關的NLRs主要有NOD1、NOD2、NLRC4、NLRP3及NLRP10,其能夠識別真菌的菌絲、幾丁質、葡聚糖等成分。

2.1 NOD1和NOD2信號通路 NOD1和NOD2是哺乳動物NLRs家族中最先發(fā)現(xiàn)的細胞內微生物探測元件。NOD1廣泛表達于多種類型的細胞中，而NOD2主要存在于巨噬細胞、樹突狀細胞、成骨細胞和肺、腸等上皮細胞中[18]。研究表明，NOD1主要識別內消旋-二氨基庚二酸(iE-DAP)，NOD2主要識別細菌胞壁中的胞壁酰二肽(MDP)，其可激活相同的信號通路，目前已知的下游信號通路包括NF-κB通路和MAPK通路[19]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)NOD1和NOD2協(xié)同CLR和TLR在真菌感染的免疫應答反應中起著重要作用。Patin等[20]用近平滑念珠菌刺激小鼠骨髓源巨噬細胞(BMDMs)，發(fā)現(xiàn)TLR7和NOD2的表達增加；而用近平滑念珠菌分別刺激髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88, MyD88)和 TLR7缺失型、NOD2缺失型、IFNAR1和STAT1/2缺失型的BMDMs，發(fā)現(xiàn)IL-27的分泌減少，表明TLR7/MyD88、NOD2和IFN-β在近平滑念珠菌誘導巨噬細胞分泌IL-27的過程中發(fā)揮重要作用。此外，用近平滑念珠菌感染IL-27受體缺失型小鼠，發(fā)現(xiàn)IFN-γ和IL-17的效應作用增強，病原體的清除能力明顯強于野生型小鼠，提示在感染近平滑念珠菌后，通過阻斷IL-27的調節(jié)作用可成為治療真菌感染的策略之一。Wagener等[21]證實NOD2和TLR9可識別白念珠菌胞壁中的幾丁質，利用幾丁質刺激人外周血單核細胞(hPBMCs)后抗炎因子IL-10和炎性因子IL-6、TNF的分泌顯著增加，而幾丁質刺激小鼠巨噬細胞后只有抗炎因子IL-10分泌增多。當用幾丁質刺激NOD2缺失型和TLR9缺失型小鼠巨噬細胞后，發(fā)現(xiàn)IL-10分泌顯著減少，說明NOD2和TLR9在識別真菌幾丁質后可通過誘導IL-10的分泌，共同抵抗炎癥損害，并維持免疫平衡體系。Zhang和Wu等[22-23]利用滅活的煙曲霉孢子刺激未經處理的人角膜上皮細胞(HCECs)，發(fā)現(xiàn)NOD1及其下游信號分子RIP2和NF-κB P65的表達顯著增高。而當煙曲霉感染敲除NOD1基因的HCECs后，NOD1及其下游信號分子RIP2、NF-κB P65以及促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α的表達減少，并且誘導的免疫應答反應減弱，提示NOD1信號轉導通路在真菌性角膜炎的固有免疫應答中發(fā)揮重要作用。隨后利用煙曲霉孢子刺激HCECs，發(fā)現(xiàn)TLR2、NOD2及其下游信號分子RIP2 和IκB-α的表達上調，而阻斷TLR后NOD2、RIP2 和IκB-α表達水平降低，提示NOD2與TLR2在真菌性角膜炎引起的免疫反應中共同發(fā)揮作用，且TLR2可能對NOD2的表達存在調節(jié)作用。因此，在真菌感染過程中NLRs可能需協(xié)同TLRs激活下游信號通路及誘導炎癥細胞因子的分泌。

2.2 NLRC4炎性小體 NLRC4又稱作人IL-1轉化酶蛋白酶激活因子(ICE-protease-activating factor，IPAF)，在骨髓細胞中表達。在正常情況下，NLRC4處于自抑制靜息狀態(tài)，病原體進入細胞后可被NAIP亞家族蛋白識別，進一步激活NLRC4并發(fā)生自身多聚化，招募caspase-1，與凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)結合形成炎癥小體，剪切pro-IL-1β和pro-IL-18而成為活性分子，從而誘導一系列的免疫應答反應[24]。Tomalka等[25]用白念珠菌感染野生型小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠舌背上皮細胞中性粒細胞浸潤程度增高，同時口腔黏膜細胞中NLRC4、IL-1β、IL-6和IL-17的表達上調；而白念珠菌感染NLRC4缺失型小鼠后則相反，表明NLRC4的激活需要募集中性粒細胞浸潤感染組織部位，證實NLRC4在黏膜組織抵抗白念珠菌感染的早期發(fā)揮特定作用。然而，白念珠菌如何激活NLRP4炎性小體的確切分子機制尚未闡明，有待于進一步研究。

2.3 NLRP3炎性小體 目前NLR家族中以NLRP3炎性小體的研究最多。NLRP3炎癥小體是一種存在于巨噬細胞和樹突狀細胞等胞質中的多蛋白復合物，主要由NLRP3、ASC和caspase-1相互結合而成，其功能是調節(jié)caspase-1的活化并促進pro-IL-1β和pro-IL-18剪切為IL-1β和IL-18兩種炎性因子，IL-1β可促進炎癥反應及激活TH17細胞，IL-18可刺激NK細胞和TH1細胞分泌IFN-γ[26]，二者作用于相應的免疫細胞后便激活整個免疫系統(tǒng)以清除入侵的病原體[27]。

NLRP3炎癥小體不僅能通過依賴caspase-1的方式調節(jié)NF-κB信號途徑的激活及下游細胞因子的產生[28]，也可通過P38 MAPK信號通路和TAK1/JNK途徑的激活發(fā)揮調節(jié)作用，誘發(fā)炎癥反應及細胞壞死[29-30]。Ketelut-Carneiro等[31]研究顯示，活體巴西副球孢子菌才能誘導IL-18的分泌和caspase-1的活化，且該菌激活NLRP3炎癥小體的過程取決于K+外流和溶酶體的酸化，誘導產生的IL-18可激活TH1引起強烈的免疫應答反應，最終增強宿主對真菌的防御能力。此外，用巴西副球孢子菌分別感染NLRP3基因敲除、ASC基因敲除、caspase-1基因敲除和野生型小鼠，發(fā)現(xiàn)基因缺失型小鼠IFN-γ的分泌減少且TH1應答反應減弱，說明IFN-γ在抗巴西副球孢子菌感染的免疫機制中發(fā)揮重要作用。Joly等[32]用白念珠菌感染巨噬細胞，然后用細胞松弛素D或B抑制巨噬細胞的內吞作用，導致細胞分泌IL-1β的過程受阻，同時發(fā)現(xiàn)白念珠菌由酵母相向菌絲相轉變的能力對炎性小體的激活至關重要。Bruno等[33]在NLRP3基因敲除的小鼠陰道內接種白念珠菌，發(fā)現(xiàn)陰道灌洗液中中性粒細胞水平降低，炎性因子IL-1β、IL-12p70、IL-6、MIP-1b和危險信號分子S100的分泌顯著減少，導致機體對真菌的清除能力減弱，提示NLRP3炎癥小體在機體抗念珠菌感染的免疫反應中起保護作用。Said-Sadier等[34]證明煙曲霉感染的固有免疫反應涉及2個信號傳遞過程：一是由TLR 和dectin-1共同作用，促進pro-IL-18的表達；另一個是由Syk激酶誘導的NLRP3炎性小體和caspase-1的激活，剪切加工并分泌成熟細胞因子。實驗利用煙曲霉的菌絲和孢子刺激THP-1細胞，發(fā)現(xiàn)只有煙曲霉的菌絲可上調THP-1細胞中pro-IL-18的表達并誘導IL-1β的分泌，且菌絲誘導的caspase-1激活和IL-1β的分泌過程依賴于K+外流和活性氧物質(ROS)的產生。上述研究初步證實真菌感染后NLRP3炎癥復合體參與IL-1β等因子介導的炎癥反應，但NLRP3炎癥小體和其他固有免疫受體協(xié)調發(fā)揮作用的機制仍未闡明。

2.4 NLRP10信號通路 NLRP10主要存在于人和小鼠的腎臟、睪丸和結腸中，是唯一不具有LRR結構域的NLR蛋白，目前推測NLRP10可能只發(fā)揮調控作用，而不能直接識別PAMPs。NLRP10可與RIP2、TAK1和NEMO等多種蛋白質相互作用以增強NOD1調控的免疫反應，也可通過其PYD結構域和接頭蛋白ASC作用形成多蛋白復合物，然后作用于caspase-1而負調控NLRP3炎性小體的激活過程[35]。Joly等[36]用白念珠菌分別感染NLRP10基因敲除野生型小鼠，發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠體內IFN-γ和IL-17的分泌嚴重減少，表現(xiàn)為特異性TH1和TH17應答反應嚴重缺陷，說明NLRP10在白念珠菌誘導的適應性免疫應答反應過程中發(fā)揮作用。

3 小結及展望

NLRs通過識別真菌的多種PAMPs，誘導固有免疫應答，并激發(fā)適應性免疫反應而發(fā)揮重要作用。然而對于NLRs如何識別配體，啟動下游信號通路的具體機制，以及與其他PRRs間的相互作用機制等仍需進一步研究。目前，一些針對炎癥小體的藥物已經開始用于某些炎癥性疾病的治療。隨著研究的不斷深入，NLRs及其信號通路中相關分子有望在不久的將來成為有效的新型生物藥物靶點，為臨床抗真菌感染提供新的途徑。

[1]Sellge G，Kufer TA. PRR-signaling pathways: Learning from microbial tactics[J]. Semin Immunol，2015，27(2): 75-84.

[2]Tapia CV，F(xiàn)alconer M，Tempio F,etal. Melanocytes and melanin represent a first line of innate immunity againstCandidaalbicans[J]. Med Mycol，2014，52(5): 445-454.

[3]Wevers BA，Kaptein TM，Zijlstra-Willems EM,etal. Fungal engagement of the C-type lectin mincle suppresses dectin-1-induced antifungal immunity[J]. Cell Host Microbe，2014，15(4): 494-505.

[4]Deng Z，Ma S，Zhou H,etal. Tyrosine phosphatase SHP-2 mediates C-type lectin receptor-induced activation of the kinase Syk and anti-fungal TH17 responses[J]. Nat Immunol，2015，16(6): 642-652.

[5]Howe K，Schiffer PH，Zielinski J,etal. Structure and evolutionary history of a large family of NLR proteins in the zebrafish[J]. Open Biol，2016，6(4): 160009.

[6]Hibino T，Loza-Coll M，Messier C,etal. The immune gene repertoire encoded in the purple sea urchin genome[J]. Dev Biol，2006，300(1): 349-365.

[7]Ting JP，Lovering RC，Alnemri ES,etal. The NLR gene family: a standard nomenclature[J]. Immunity，2008，28(3): 285-287.

[8]Coutermarsh-Ott S，Eden K，Allen IC. Beyond the inflammasome: regulatory NOD-like receptor modulation of the host immune response following virus exposure[J]. J Gen Virol，2016，97(4): 825-838.

[9]Lechtenberg BC，Mace PD，Riedl SJ. Structural mechanisms in NLR inflammasome signaling[J]. Current Opinion in Structural Biology，2014，29: 17-25.

[10]Parlato M，Yeretssian G. NOD-like receptors in intestinal homeostasis and epithelial tissue repair[J]. International Journal of Molecular Sciences，2014，15(6): 9594-9627.

[11]Kofoed EM，Vance RE. Innate immune recognition of bacterial ligands by NAIPs determines inflammasome specificity[J]. Nature，2011，477(7366): 592-595.

[12]Motta V，Soares F，Sun T,etal. NOD-like receptors: versatile cytosolic sentinels[J]. Physiol Rev，2015，95(1): 149-178.

[13]Ydens E，Demon D，Lornet G,etal. Nlrp6 promotes recovery after peripheral nerve injury independently of inflammasomes[J]. J Neuroinflammation，2015，12: 143.

[14]Ataide MA，Andrade WA，Zamboni DS,etal. Malaria-induced NLRP12/NLRP3-dependent caspase-1 activation mediates inflammation and hypersensitivity to bacterial superinfection[J]. PLoS Pathog，2014，10(1): e1003885.

[15]Plato A，Hardison SE，Brown GD. Pattern recognition receptors in antifungal immunity[J]. Semin Immunopathol，2015，37(2): 97-106.

[16]Kufer TA，Sansonetti PJ. NLR functions beyond pathogen recognition[J]. Nat Immunol，2011，12(2): 121-128.

[17]Kim YK，Shin J-S，Nahm MH. NOD-like receptors in infection, immunity, and diseases[J]. Yonsei Medical Journal，2016，57(1): 5.

[18]Moreira LO，Zamboni DS. NOD1 and NOD2 signaling in infection and inflammation[J]. Front Immunol，2012，3: 328.

[19]Abbott DW，Yang Y，Hutti JE,etal. Coordinated regulation of Toll-like receptor and NOD2 signaling by K63-linked polyubiquitin chains[J]. Mol Cell Biol，2007，27(17): 6012-6025.

[20]Patin EC，Jones AV，Thompson A,etal. IL-27 induced by selectCandidaspp. via TLR7/NOD2 signaling and IFN-beta production inhibits fungal clearance[J]. J Immunol，2016，197(1): 208-221.

[21]Wagener J，Malireddi RK，Lenardon MD,etal. Fungal chitin dampens inflammation through IL-10 induction mediated by NOD2 and TLR9 activation[J]. PLoS Pathog，2014，10(4): e1004050.

[22]Zhang Y，Wu J，Xin Z,etal.Aspergillusfumigatustriggers innate immune response via NOD1 signaling in human corneal epithelial cells[J]. Exp Eye Res，2014，127: 170-178.

[23]Wu J，Zhang Y，Xin Z,etal. The crosstalk between TLR2 and NOD2 inAspergillusfumigatuskeratitis[J]. Mol Immunol，2015，64(2): 235-243.

[24]Yuan F，Kolb R，Pandey G,etal. Involvement of the NLRC4-inflammasome in diabetic nephropathy[J]. PLoS One，2016，11(10): e0164135.

[25]Tomalka J，Ganesan S，Azodi E,etal. A novel role for the NLRC4 inflammasome in mucosal defenses against the fungal pathogenCandidaalbicans[J]. PLoS Pathog，2011，7(12): e1002379.

[26]Lage SL，Longo C，Branco LM,etal. Emerging concepts about NAIP/NLRC4 inflammasomes[J]. Front Immunol，2014，5: 309.

[27]Latz E，Xiao TS，Stutz A. Activation and regulation of the inflammasomes[J]. Nat Rev Immunol，2013，13(6): 397-411.

[28]Kinoshita T，Imamura R，Kushiyama H,etal. NLRP3 mediates NF-kappaB activation and cytokine induction in microbially induced and sterile inflammation[J]. PLoS One，2015，10(3): e0119179.

[29]Rajamaki K，Mayranpaa MI，Risco A,etal. p38delta MAPK: A novel regulator of NLRP3 inflammasome activation with increased expression in coronary atherogenesis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2016，36(9): 1937-1946.

[30]Okada M，Matsuzawa A，Yoshimura A,etal. The lysosome rupture-activated TAK1-JNK pathway regulates NLRP3 inflammasome activation[J]. J Biol Chem，2014，289(47): 32926-32936.

[31]Ketelut-Carneiro N，Silva GK，Rocha FA,etal. IL-18 triggered by the Nlrp3 inflammasome induces host innate resistance in a pulmonary model of fungal infection[J]. J Immunol，2015，194(9): 4507-4517.

[32]Joly S，Ma N，Sadler JJ,etal. Cutting edge:Candidaalbicanshyphae formation triggers activation of the Nlrp3 inflammasome[J]. J Immunol，2009，183(6): 3578-3581.

[33]Bruno VM，Shetty AC，Yano J,etal. Transcriptomic analysis of vulvovaginal candidiasis identifies a role for the NLRP3 inflammasome[J]. MBio，2015，6(2): e00182-15.

[34]Said-Sadier N，Padilla E，Langsley G,etal.Aspergillusfumigatusstimulates the NLRP3 inflammasome through a pathway requiring ROS production and the Syk tyrosine kinase[J]. PLoS One，2010，5(4): e10008.

[35]Damm A，Lautz K，Kufer TA. Roles of NLRP10 in innate and adaptive immunity[J]. Microbes Infect，2013，15(6-7): 516-523.

[36]Joly S，Eisenbarth SC，Olivier AK,etal. Cutting edge: Nlrp10 is essential for protective antifungal adaptive immunity againstCandidaalbicans[J]. J Immunol，2012，189(10): 4713-4717.

(本文編輯：劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.13

國家自然科學基金(81572052);江蘇省自然科學基金(BK20151178)；常州市醫(yī)學領軍人才項目(20101368)。

彭陽，1992年生，女，碩士研究生，主要從事臨床微生物與免疫研究。

史偉峰，主任技師，副教授，碩士研究生導師，E-mail：swf67113@163.com。

R446.5；R446.6

A

2017-02-14)