應(yīng)重視血栓與出血的實(shí)驗(yàn)檢測

王學(xué)鋒

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025)

·述評(píng)·

應(yīng)重視血栓與出血的實(shí)驗(yàn)檢測

王學(xué)鋒

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025)

國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室目前常規(guī)開展的血栓與出血檢測項(xiàng)目，多數(shù)是基于纖維蛋白形成為終點(diǎn)的檢測，對(duì)于不同出血病和血栓病診斷的敏感性和特異性有較大差異。血管性血友病因子(vWF)抗原、凝血因子Ⅷ活性、瑞斯托霉輔因子活性的檢測可以診斷多數(shù)的vWD，但精確分型還需結(jié)合其他試驗(yàn)加以診斷和鑒別診斷。在凝血因子制劑替代治療、華法林等藥物抗凝治療、溶栓治療等方面，實(shí)驗(yàn)室檢測可以判斷藥物治療無效和藥物拮抗過度。通過對(duì)遺傳性出血病或血栓病先證者實(shí)施基因檢測可以對(duì)家族中的疾病發(fā)生情況進(jìn)行篩查。血栓與出血的實(shí)驗(yàn)檢測可以為血栓病和出血病的診斷、療效監(jiān)測、個(gè)體化治療及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究提供重要依據(jù)。

血栓??；出血??；血管性血友??；凝血因子缺乏；抗凝蛋白缺陷；纖溶系統(tǒng)亢進(jìn)

血栓病和出血病是臨床常見病和多發(fā)病，嚴(yán)重影響人類健康。血栓與出血的實(shí)驗(yàn)室檢測可以為疾病的診斷、療效監(jiān)測、個(gè)體化治療及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究提供重要依據(jù)。

1 篩選試驗(yàn)

目前，國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展的血栓與出血檢測項(xiàng)目，多數(shù)是基于纖維蛋白形成為終點(diǎn)的檢測。這些試驗(yàn)對(duì)于不同出血病和血栓病診斷的敏感性和特異性有較大差異。

1.1出血病 臨床出血病最常用的篩選試驗(yàn)為凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)g)和血小板計(jì)數(shù)(platelet，PLT)。上述篩選試驗(yàn)對(duì)出血病診斷的敏感性和特異性較高，絕大多數(shù)出血病可以發(fā)現(xiàn)異常。出血時(shí)間在初期止血診斷中有一定價(jià)值，但其敏感性及特異性不甚理想，臨床使用較為局限。PFA-100血小板功能分析儀是模仿機(jī)體一期止血而設(shè)計(jì)的檢測裝置，對(duì)初期止血功能缺陷的血小板數(shù)量和功能異常、血管性血友病(von Willebrand disease，vWD)等有較高的檢測價(jià)值[1]。在此基礎(chǔ)上升級(jí)改造的PFA-200血小板功能分析儀可以進(jìn)一步監(jiān)測抗血小板藥物的有效性。血栓彈力圖(thromboelastogram，TEG)可以用于評(píng)價(jià)整體凝血狀況，但無法鑒別內(nèi)源或外源凝血系統(tǒng)的異常，一般以即時(shí)檢驗(yàn)(point-of-care testing，POCT)的形式服務(wù)于臨床。

1.2血栓病 除部分血栓病患者可以有Fg升高，一般PT、APTT不甚敏感，僅少部分患者表現(xiàn)出該2項(xiàng)檢測的異常。TEG在血栓病可以表現(xiàn)為凝血因子激活時(shí)間(R)縮短，最大振幅(MA)增大，血塊形成時(shí)間(K)縮短和最大切角(α)增大，表現(xiàn)出較好的篩選價(jià)值。急性心肌梗死患者PFA-200血小板功能分析儀可以表現(xiàn)出閉孔時(shí)間(closure time，CT)縮短，并與心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTNT)和心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTNI)呈負(fù)相關(guān)。凝血酶生成試驗(yàn)(thrombin generation test，TGT)可以準(zhǔn)確檢測凝血酶的生成，在高凝狀態(tài)和血栓病時(shí)具有較高的敏感性。

1.3抗凝血系統(tǒng)的異常 APTT可以檢測出異?？鼓镔|(zhì)如狼瘡抗凝物質(zhì)、凝血因子Ⅷ(FⅧ)抗體等，但對(duì)于生理性抗凝蛋白如抗凝血酶(antithrombin，AT)、蛋白C(protein C，PC)、蛋白S(protein S，PS)異?；颊?，無法檢測到相應(yīng)改變。凝血酶時(shí)間(thrombin time，TT)可以檢測出體內(nèi)類肝素物質(zhì)增多。

1.4纖溶系統(tǒng)的異常 免疫比濁法檢測纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(fibrin/fibrinogen degradation products，F(xiàn)DP)和D-二聚體(D-dimmer，DD)可以給臨床提供信息。TEG在檢測纖溶亢進(jìn)時(shí)也有特殊的圖形顯示，在原發(fā)性纖溶和繼發(fā)性纖溶的診斷與鑒別診斷時(shí)有一定價(jià)值。

2 確診試驗(yàn)

2.1先天性凝血因子缺乏癥 根據(jù)篩選試驗(yàn)提供的線索直接檢測凝血因子可以明確疾病的診斷和鑒別診斷。vWD的發(fā)病率在所有遺傳性出血病中最高，直接檢測血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)抗原、FⅧ活性、瑞斯托霉輔因子活性可以診斷多數(shù)的vWD。精確的分型往往需要進(jìn)行vWF多聚體分析、膠原結(jié)合試驗(yàn)、FⅧ和vWF結(jié)合試驗(yàn)等加以診斷和鑒別診斷。對(duì)APTT延長、所有凝血因子檢測均正常、APTT糾正試驗(yàn)陽性的情況，可以直接擴(kuò)增激肽釋放酶原(prekallikrein，PK)和高分子量激肽原(high molecular weight kininogen，HMWK)的DNA。需要注意的是，我國目前廣泛使用的是凝血因子活性檢測的一期法。在FⅧ活性檢測時(shí)，多數(shù)情況下，一期法的結(jié)果和二期法吻合。但一些特殊情況下，如FⅧ基因突變，可以使二者結(jié)果出現(xiàn)差異[2]。

2.2抗凝蛋白缺陷 目前常用AT、PC、PS和組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor, TFPI)檢測抗凝蛋白缺陷，一般先檢測這些抗凝蛋白的活性，若有異常降低，再檢測其抗原性。根據(jù)活性與抗原性的改變，可以將抗凝蛋白缺陷分為交叉反應(yīng)物質(zhì)(cross reacting material，CRM)陽性(CRM+)和陰性(CRM-)2種，前者代表分子結(jié)構(gòu)改變所導(dǎo)致的功能異常，后者說明其合成減少。PS由于和補(bǔ)體C4結(jié)合蛋白結(jié)合后喪失活性，臨床上多通過檢測游離的PS來反映其抗凝活性。需要注意的是，并非所有的抗凝蛋白缺陷均可以通過目前的表型檢測方法發(fā)現(xiàn)；同樣，表型檢測所發(fā)現(xiàn)的異常，并非一定有病理診斷價(jià)值。Ding等[3]發(fā)現(xiàn)的PC的Thr315Ala是一個(gè)功能獲得性突變，導(dǎo)致PC在內(nèi)皮細(xì)胞膜上被激活加速，而其滅活FⅧa和FⅤa的能力下降，但綜合的抗凝功能仍較野生型增加。故雖然市售PC試劑檢測具有該突變的受試者是一個(gè)Ⅱ型PC缺陷患者，但其功能獲得性突變使其沒有血栓的癥狀，表現(xiàn)為一個(gè)表觀健康人。

2.3纖溶系統(tǒng)亢進(jìn) 纖溶系統(tǒng)各成分的檢測有助于了解纖溶系統(tǒng)功能亢進(jìn)的原因。由于先前的檢測方法復(fù)雜，很少應(yīng)用于臨床。日前，化學(xué)發(fā)光法將纖溶系統(tǒng)多個(gè)標(biāo)志物如組織型纖溶酶原激活物-纖溶酶原激活物抑制劑1復(fù)合物(tissue plasminogen activator-plasminogen activator inhibitor-1 complex，t-PAIC)等應(yīng)用于自動(dòng)化檢測中，大大提高了臨床檢測的效率。

3 療效監(jiān)測

療效監(jiān)測的主要體現(xiàn)：(1)在凝血因子制劑替代治療后觀察療效，同時(shí)可以為圍手術(shù)期個(gè)體化的精準(zhǔn)止血方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。(2)華法林抗凝治療時(shí)用國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(international normalized ratio，INR)監(jiān)測已經(jīng)為眾多醫(yī)師所認(rèn)可。肝素和低分子肝素抗凝治療時(shí)，需要了解AT水平以避免肝素抵抗，監(jiān)測抗FⅩa水平以達(dá)到最佳抗凝效果并避免出血風(fēng)險(xiǎn)，檢測肝素-血小板第4因子(platelet factor 4，PF4)復(fù)合物抗體和PLT以避免肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥/血栓形成。但這些檢測卻為廣大的醫(yī)務(wù)工作者所忽視。(3)監(jiān)測FDP和DD水平可以觀察溶栓治療藥物的效果,監(jiān)測PLT和Fg水平有助于減少出血風(fēng)險(xiǎn)。(4)抗血小板治療監(jiān)測有傳統(tǒng)的光學(xué)法血小板聚集試驗(yàn)、verifynow 的POCT檢測、VASP流式細(xì)胞術(shù)檢測及TEG的血小板圖檢測等多種方法學(xué)，各有其特點(diǎn)及優(yōu)勢。

通過檢測可以發(fā)現(xiàn)藥物治療無效和藥物拮抗過度的患者，有利于及時(shí)調(diào)整用藥以達(dá)到最佳的抗栓效益和最低的出血風(fēng)險(xiǎn)。

4 藥物基因組學(xué)檢測

由于個(gè)體參與藥物代謝的基因多態(tài)性的差異，患者對(duì)不同藥物的敏感性不同。通過藥物基因組學(xué)的檢測，有助于了解藥物在患者體內(nèi)的代謝情況，真正做到精準(zhǔn)用藥。目前常用的主要有華法林和氯吡格雷的藥物基因組學(xué)檢測,可以根據(jù)藥物基因組學(xué)檢測結(jié)果及時(shí)調(diào)整臨床用藥，以獲得最大的治療效果而最大程度避免藥物不良反應(yīng)的發(fā)生。

5 項(xiàng)目的優(yōu)化組合檢測

血栓與出血項(xiàng)目的檢測對(duì)于發(fā)現(xiàn)凝血紊亂，其敏感性和特異性不同。例如，對(duì)彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation, DIC)的診斷來說，敏感性高的如APTT、PT，特異性不強(qiáng)；反之，對(duì)DIC診斷特異性高的，如Fg和破碎紅細(xì)胞等，則敏感性堪憂。因此，DIC診斷時(shí)的項(xiàng)目優(yōu)化組合，在各個(gè)項(xiàng)目優(yōu)勢互補(bǔ)的前提下，可以使疾病的診斷效率大大提高。

6 基因檢測

遺傳性出血病與血栓病多為單基因疾病，通過對(duì)先證者實(shí)施基因檢測可以對(duì)家族中的疾病發(fā)生情況進(jìn)行篩查。血友病為最常見的遺傳性出血性疾病，為FⅧ/FⅨ的數(shù)量或功能異常所導(dǎo)致。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院通過直接檢測FⅧ/FⅨ基因缺陷，聯(lián)合FⅧ/FⅨ基因內(nèi)外多個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行遺傳連鎖分析，已成功實(shí)施1 700余例，鑒別出正常胎兒、女性攜帶者及血友病患者[4]。

遺傳性血栓病的基因診斷同樣可以為部分血栓病患者找到病因，以指導(dǎo)診斷及優(yōu)生優(yōu)育。瑞金醫(yī)院將凝血因子、抗凝蛋白及有關(guān)纖溶因子及無表型檢測(PROCR、THBD、ADAMTS13、HRG、SERPIND1、TFPI)的相關(guān)基因計(jì)15個(gè)組成檢測panel，通過二代測序、基因拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNV)檢測及cDNA檢測，發(fā)現(xiàn)入組的血栓病患者除42.4%由單基因突變導(dǎo)致外，27.25%由雙基因突變、11.1%由三基因突變導(dǎo)致，多數(shù)由數(shù)個(gè)不同的基因缺陷導(dǎo)致，26.25%尚未發(fā)現(xiàn)基因突變。

7 表型結(jié)合基因型的診斷

表型結(jié)合基因型的診斷策略可以使血栓病和出血病的診斷更加精準(zhǔn)。Liang等[5]將此策略用于vWD的診斷，可以使疾病的亞型分類更加精細(xì)，除發(fā)現(xiàn)部分患者同時(shí)有幾種亞型的表現(xiàn)，還發(fā)現(xiàn)少數(shù)患者同時(shí)合并有血友病A。另外，女性血友病A患者非常罕見。陸曄玲等[6]結(jié)合表型與基因型的診斷策略，診斷出3個(gè)血友病A女性患者。

8 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究

血栓病和出血病是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的極好對(duì)象。通常情況下，當(dāng)凝血因子基因發(fā)生功能缺失性突變時(shí)，往往會(huì)造成出血??；反之，當(dāng)抗凝蛋白基因發(fā)生功能缺失性突變時(shí)，往往可以造成血栓形成。然而，凝血因子的功能獲得性突變可以導(dǎo)致患者血液凝固性異常增高，導(dǎo)致血栓形成。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院在日常工作中發(fā)現(xiàn)一位靜脈血栓患者的FⅨ的基因1151G/A突變導(dǎo)致FⅨ氨基酸替換，即FⅨ Arg384Gln FⅨ R384Q(含信號(hào)肽編碼)或FⅨ R338Q(經(jīng)典編碼)。突變后的FⅨ的凝血活性較野生型高出5倍。這是繼FⅨ Arg384Leu FⅨ Padua后人類發(fā)現(xiàn)的又一個(gè)凝血因子的功能獲得性突變。前者已經(jīng)成功地應(yīng)用于血友病B的基因治療并獲成功。后者被本課題組命名為FⅨ Shanghai，通過AAV8載體已經(jīng)在血友病B小鼠中獲得了長期的高表達(dá)。期待FⅨ Shanghai作為具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的突變?cè)谘巡的基因治療上有所突破。除此之外，F(xiàn)Ⅸ Shanghai所表達(dá)的FⅨ有望與清蛋白或免疫球蛋白的Fc端結(jié)合，形成高效的半衰期長的凝血因子制劑。

血栓與出血的深入研究，不僅給疾病的診斷與治療帶來了巨大的改進(jìn)，也為疾病發(fā)病機(jī)制的研究及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究提供了更加廣闊的平臺(tái)。

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10.13602/j.cnki.jcls.2017.12.02

王學(xué)鋒，1963年生，男，教授，主任醫(yī)師，博士，主要從事出血病、血栓病的診治工作和研究，E-mail：13641653074@139.com。

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