膠孢炭疽菌CgRGS4調控營養(yǎng)生長、滲透壓響應、氧化應激反應和致病性

徐 爽，吳曼莉，柯智健，柳志強，李曉宇

(海南大學 環(huán)境與植物保護學院，海南 ?？?570228)

膠孢炭疽菌CgRGS4調控營養(yǎng)生長、滲透壓響應、氧化應激反應和致病性

徐 爽，吳曼莉，柯智健，柳志強*，李曉宇

(海南大學 環(huán)境與植物保護學院，海南 ?？?570228)

G蛋白信號調控因子(regulators of G-protein signaling，RGS)是G蛋白的一類負調控因子，在植物病原真菌生長發(fā)育及致病過程中起著重要的作用，然而目前還未有關于膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)RGS蛋白生物學功能的研究。試驗利用PCR技術擴增了膠孢炭疽菌的CgRGS4基因，通過同源重組的方法獲得CgRGS4基因的敲除突變體，通過表型分析初步確定了CgRGS4的生物學功能。結果表明，CgRGS4編碼一個1 224個氨基酸的蛋白，包含RGS、PXA和PX功能域，該基因敲除突變體在營養(yǎng)相對貧瘠的條件下生長較野生型緩慢，對高滲透脅迫的耐受性增強，黑色素減少，對H2O2更加敏感，胞外漆酶及過氧化氫酶活性降低以及致病性減弱。由此可見，CgRGS4參與調控膠孢炭疽菌的營養(yǎng)生長、滲透壓響應、氧化應激反應和致病性等多個過程。

膠孢炭疽菌；G蛋白信號調控因子；基因敲除；表型分析

炭疽菌 (Colletotrichumspp.)是世界上常見的一類植物病原真菌，常引起果實腐爛、植株枯萎、葉片病斑、死苗等癥狀，造成重大的經濟損失[1]。膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)是一種重要的炭疽病菌，廣泛分布于世界熱帶、亞熱帶及溫帶國家和地區(qū)，可以引起多種植物炭疽病，宿主包括橡膠、芒果、西瓜、香蕉、柱花草、桃等，嚴重危害著世界農業(yè)生產[2-3]。膠孢炭疽菌可以侵染植物的果實、葉片和枝干等，且具有潛伏性侵染的特點，對于該病菌的防治也較為困難。目前，國內外對膠孢炭疽菌的研究主要集中在生物學特性、防治藥劑篩選等方面，而關于該菌侵染過程、致病相關基因和致病機制的報道相對較少，進而也限制了對該病防治技術的更新和改進[4]。

G蛋白信號途徑是真核細胞感受及傳遞外源信號的重要途徑之一，其參與調控真菌的生長發(fā)育、生殖、交配、侵染以及致病等相關過程[5-6]。G蛋白由其偶聯(lián)的受體蛋白(GPCR)激活，當信號配體結合到GPCR時，與Gα結合的GDP轉變?yōu)镚TP，異三聚體的構象發(fā)生改變，Gα與Gβγ發(fā)生解離[7-8]。作為有活性的信號分子，Gα和Gβγ分別激活下游的靶蛋白，從而造成一系列的生理變化。激活的G蛋白隨后將GTP重新水解為GDP，使Gα和Gβγ重新聚合形成失活的異三聚體。其中，G蛋白信號調控因子在G蛋白的信號轉導過程中起負調節(jié)作用，RGS蛋白激活Gα 的GTP酶活性，促使GTP水解為GDP，使Gα 重新與Gβγ 聚合，造成G蛋白失活，從而迅速關閉G蛋白信號途徑[9]。

在植物病原真菌方面， RGS蛋白已經在稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、輪枝鐮孢菌(Fusariumverticillioides)和小麥赤霉病菌(Gibberellazeae)中得到鑒定，其功能主要集中在調控營養(yǎng)生長、有性生殖、cAMP水平、致病性等方面。然而，至今還未見關于膠孢炭疽菌RGS蛋白生物學功能的報道。在前期研究中，我們從膠孢炭疽菌中鑒定了10個潛在的RGS蛋白，命名為CgRGS1-CgRGS10，它們都包含RGS功能域。本研究對其中一個RGS蛋白CgRGS4的基因進行了克隆，利用同源重組的方法獲得了該基因的敲除突變體，通過表型分析初步確定了CgRGS4的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和菌株

pMD18-T為TaKaRa公司產品，膠孢炭疽菌野生型菌株(WT)和敲除載體pCB1532均由本實驗室保存。

1.1.2 試劑盒、工具酶及生化試劑

DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、限制性內切酶及 PCR相關試劑均購自TaKaRa公司；引物合成和測序均由華大基因科技有限公司完成；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

CM培養(yǎng)基：胰化蛋白胨 6 g·L-1，酵母提取物6 g·L-1，蔗糖10 g·L-1，瓊脂20 g·L-1；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，瓊脂20 g·L-1；PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1；Czapek培養(yǎng)基：蔗糖30 g·L-1，NaNO33 g·L-1，MgSO40.5 g·L-1，KCl 0.5 g·L-1，K2HPO41 g·L-1，F(xiàn)eSO40.01 g·L-1，瓊脂20 g·L-1；MM培養(yǎng)基：K2HPO47 g·L-1，葡萄糖5 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，(NH4)2SO41 g·L-1，檸檬酸鈉 0.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.1 g·L-1，瓊脂20 g·L-1。

1.2 方法

1.2.1CgRGS4基因的克隆及序列分析

膠孢炭疽菌總RNA提取采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa，中國)，利用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，中國)合成cDNA。參照GenBank中C.gloeosporioidesNara gc5的RGS基因(XM_007276578)設計ORF框兩端引物CgRGS4FⅠ和CgRGS4RⅠ，以膠孢炭疽菌野生菌株的cDNA為模板進行擴增，連接pMD18-T載體后進行測序。利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)工具對CgRGS4進行蛋白結構域分析，通過GenBank中BLASTp工具對CgRGS4進行蛋白同源性分析，利用MEGA 5.0軟件以鄰近相接法構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.2CgRGS4基因的敲除與轉化子篩選

按照圖1所示原理構建CgRGS4敲除載體。參照文獻[10]的方法提取膠孢炭疽菌基因組DNA，以基因組DNA為模板，分別利用CgRGS4上下游片段引物CgRGS4upF/CgRGS4upR和CgRGS4downF/CgRGS4downR(表1)擴增CgRGS4基因的上下游片段。將擴增得到的基因上下游片段依次連接到pCB1532(含氯嘧磺隆抗性基因Sur)上，酶切驗證無誤后即獲得敲除載體pCB1532-CgRGS4。將pCB1532-CgRGS4通過SmaⅠ酶切進行線性化，轉化到膠孢炭疽菌野生型菌株的原生質體中，原生質體制備及轉化的方法步驟參照文獻[11]，轉化子在含有氯嘧磺隆抗性平板中進行篩選，提取抗性轉化子的基因組進行多重PCR驗證。根據(jù)CgRGS4上游片段的上翼序列和下游片段的下翼序列分別設計引物CgRGS4UU和CgRGS4DD，并根據(jù)pCB1532上靠近上下游片段的序列設計引物PI和PI1(表1)，利用3對引物(CgRGS4FⅡ/ CgRGS4RⅡ、CgRGS4UU/PI和PI1/ CgRGS4DD)對轉化子進行PCR鑒定，引物CgRGS4FⅡ/ CgRGS4RⅡ無擴增條帶，而引物CgRGS4UU/PI和PI1/ CgRGS4DD可以擴出目的片段的轉化子為候選的基因敲除突變體(圖1)。

對上述候選敲除突變體進一步進行Southern blot分析：分別提取野生型菌株和候選敲除突變體的基因組DNA，經限制性內切酶BamHⅠ酶切后進行凝膠電泳，以引物CgRGS4FⅡ/ CgRGS4RⅡ(表1)的PCR擴增產物(CgRGS4 ORF框的部分序列)作為CgRGS4基因探針(Probe 1)，以引物Sur-F/Sur-R(表1)的PCR擴增產物(pCB1532上Sur基因的部分序列)作為Sur基因探針(Probe 2)，分別進行Southern blot分析。Southern blot操作過程參照羅氏地高辛標記及檢測試劑盒操作手冊(Roche Applied Science， Penzberg， Germany)。

1.2.3 突變株表型分析

(1)營養(yǎng)生長

膠孢炭疽菌野生型菌株和突變體于PDA培養(yǎng)基上活化7 d后，取直徑5 mm的菌餅分別接種于MM、PDA、CM和Czapek固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，測量菌落直徑并拍照，試驗設3個重復。

表1 引物序列

Table 1 Sequences of the primers

引物Primers序列Sequences(5’-3’)CgRGS4FⅠCgRGS4RⅠCgRGS4upFCgRGS4upRCgRGS4FⅡCgRGS4RⅡCgRGS4downFCgRGS4downRCgRGS4UUPIPI1CgRGS4DDSur-FSur-RATGGCCCTGCAAGGAAGAGACTCAGCCAAACAAAATCTCCACTCCCCCGGGAGTTGTTGGTTGACTGACTT-GGGCTCTAGATCGATGTTGATATTTGCGGTGCCGGCTGGAAATGGGTAAGAGGCGAGGTTGCGAACGGATGGATACCGGAATTCTGCATAGAAGCGGGTGTTA-AGGTCCCCCGGGTCAATTTCGCCCAAGCATCCAGGCCATTTCAACAAACCAAACGAGTCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGCCACTGGTTCATCGTTCCACCTCACCTCCCATGGCCGACGCTCTTGCCACTACGCTCGGCCCTCTCAT

圖1 CgRGS4基因敲除原理Fig.1 Gene knockout principle of CgRGS4

(2)滲透壓脅迫因子耐受性

野生型和突變體菌株于PDA培養(yǎng)基上活化7 d后，取直徑5 mm的菌餅分別接種在含0.5 mol·L-1NaCl，0.5 mol·L-1KCl，1 mol·L-1丙三醇的MM培養(yǎng)基上，以接種MM培養(yǎng)基的菌株為對照，28 ℃培養(yǎng)9 d，測量菌落直徑拍照并計算抑制率，試驗設3個重復。抑制率=(對照組菌落直徑-試驗組菌落直徑)×對照組菌落直徑-1×100%。

(3)黑色素分泌及胞外漆酶活性測定

將野生型和突變體菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)10 d，觀察黑色素分泌情況；將野生型和突變體菌株以相同接種量接種PDB培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)，分別于3 d和5 d取菌液，過濾去除菌絲。將400 μL菌液加入到1.6 mL含10 mmol·L-1ABTS的50 mmol·L-1醋酸緩沖液中，25 ℃反應5 min，測量D420[12]。

(4)氧化應激性試驗

將野生型和突變體菌株接種到含不同濃度H2O2(0.5和10 mmol·L-1)的MM培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)9 d，測量菌落直徑拍照并計算抑制率；按照1.2.3節(jié)(3)中測定胞外漆酶的方法制備菌液，將400 μL菌液加入到1.6 mL含有10 mmol·L-1ABTS和3 mmol·L-1H2O2的50 mmol·L-1醋酸緩沖液中，25 ℃反應5 min，測量D420[12]。

(5) 致病性測定

選取無病斑、表面均勻光滑的芒果，用已滅菌的大頭針在芒果表面形成傷口，于活化7 d的PDA平板上取5 mm菌餅，分別以無傷口及有傷口的方式接種芒果，每處理3個重復，28 ℃保濕培養(yǎng)，5 d后觀察發(fā)病情況。

2 結果與分析

2.1CgRGS4基因的克隆及分析

通過PCR擴增獲得了CgRGS4基因的cDNA序列，測序發(fā)現(xiàn)CgRGS4基因ORF框全長3 675 bp(GenBank登錄號：KX394624)，編碼1 224個氨基酸。蛋白結構域分析發(fā)現(xiàn)CgRGS4包括3個結構域(PXA、RGS和PX)以及2個跨膜區(qū)域(圖2-A)。從GenBank下載CgRGS4的同源蛋白序列，利用 MEGA5.0構建系統(tǒng)進化樹(圖2-B)，CgRGS4與C.gloeosporioidesNara gc5的intermediate filament protein(XP_007276640.1)相似度達到99%，此外CgRGS4與Colletotrichumsublineola、Verticilliumlongisporum、Trichodermaharzianum、Neonectriaditissima、Fusariumgraminearum等相關蛋白的同源性也較高，相似度在70%以上。

2.2CgRGS4基因的敲除與鑒定

利用同源重組的方法，將CgRGS4基因的上游1 000 bp和下游1 081 bp的DNA片段連接到pCB1532載體上構建敲除載體，敲除載體線性化后轉入膠孢炭疽菌野生型原生質體中，共獲得96個轉化子，提取各轉化子基因組并進行PCR驗證，其中47號轉化子使用CgRGS4FⅡ+ CgRGS4RⅡ引物不能擴增目的條帶，而使用引物CgRGS4UU+PI和PI1+CgRGS4DD能夠分別擴增出目的條帶(圖3-A、B、C)。利用Southern blot對47號轉化子做進一步驗證，以CgRGS4基因探針(Probe 1)進行雜交時，野生型菌株中能檢測到單一條帶，而轉化子中檢測不到條帶；而以Sur基因探針(Probe 2)進行雜交時，野生型菌株中檢測不到條帶，轉化子能檢測到單一條帶，表明CgRGS4基因已經在47號轉化子中成功敲除，且是單拷貝插入(圖3-D)。因此，確定47號轉化子為敲除突變體，命名為△CgRGS4。

A， CgRGS4蛋白結構域；B， CgRGS4系統(tǒng)發(fā)育樹A， Protein domain of CgRGS4; B， Phylogenetic tree of CgRGS4圖2 CgRGS4蛋白結構域及系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Protein domain and phylogenetic tree of CgRGS4

A，引物CgRGS4F Ⅱ+ CgRGS4R Ⅱ擴增結果；B，引物CgRGS4UU+PI擴增結果；C，引物PI1+CgRGS4DD擴增結果；D，Southern blot 驗證結果(M，DNA marker；1，野生型；2，△CgRGS4)A， PCR amplification results with primers CgRGS4F Ⅱ and CgRGS4R Ⅱ; B， PCR amplification results with primers CgRGS4UU and PI; C， PCR amplification results with primers PI1 and CgRGS4DD; D， The results of southern blot analysis (M， DNA marker; 1， WT; 2， △CgRGS4)圖3 CgRGS4敲除突變體的驗證Fig.3 Verification of CgRGS4 gene knockout mutant

2.3 敲除突變株表型分析

2.3.1 營養(yǎng)生長

將野生型菌株和△CgRGS4分別接種于MM、PDA、CM和Czapek培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)7 d，結果見圖4。與野生型相比，△CgRGS4在PDA、CM和Czapek培養(yǎng)基上生長沒有顯著差異。但在營養(yǎng)相對貧瘠的MM培養(yǎng)基中，△CgRGS4的生長速率顯著降低。由此可見，在營養(yǎng)較貧瘠條件下CgRGS4參與調控菌株的營養(yǎng)生長。

2.3.2 滲透壓脅迫因子耐受性

將菌株接種于含有0.5 mol·L-1NaCl，0.5 mol·L-1KCl，1 mol·L-1丙三醇的MM培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)9 d，菌落生長情況如圖5-A。與CK相比，野生型菌株和△CgRGS4在3種高滲培養(yǎng)基上的生長均受到不同程度的抑制，計算抑制率發(fā)現(xiàn)野生型菌株的生長抑制率均顯著高于△CgRGS4(圖5-B)，說明△CgRGS4與野生型相比對高滲環(huán)境具有更高的耐受性。

2.3.3 黑色素產量及胞外漆酶活性測定

將野生型菌株和△CgRGS4接種于PDA培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)10 d，結果發(fā)現(xiàn)，對比△CgRGS4，野生菌的菌落顏色明顯變黑，△CgRGS4的黑色素產量明顯低于野生型菌株(圖6-A)。鑒于漆酶在黑色素產生過程中的重要作用，進而對△CgRGS4的胞外漆酶活性進行了測定，結果顯示，△CgRGS4的胞外漆酶活性顯著低于野生型菌株(圖6-B)。由此可見，CgRGS4參與調控黑色素及胞外漆酶的產生。

A， 4種培養(yǎng)基的生長情況比較；B， 菌落直徑統(tǒng)計(a， b代表差異顯著性，P<0.05。下同)A， Comparison of the growth on four media; B， Statistical analysis of colony size (a， b represent significant difference， P<0.05. The same as below)圖4 不同培養(yǎng)基對菌株生長的影響Fig.4 Effects of different media on growth of strains

A，三種高滲培養(yǎng)基對菌株生長的影響；B，生長抑制率統(tǒng)計A， Effects of three high osmotic media on growth of strains; B， Statistical analysis of the inhibition rates圖5 滲透壓對野生型及△CgRGS4生長的影響Fig.5 Effect of osmotic pressure on the growth of wild type and △CgRGS4

A，菌株黑色素產量比較(1，正面；2，背面)；B，胞外漆酶活性測定A， Comparison of melanin production (1， Front; 2， Back); B， Determination of extracellular laccase activity圖6 菌株黑色素生產及胞外漆酶活性測定Fig.6 Melanin production and determination of extracellular laccase activity

2.3.4 氧化應激反應

將菌株接種于含不同濃度H2O2的MM培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)9 d。隨著H2O2濃度的提高，△CgRGS4和野生型菌株均受到不同程度的抑制，且相較于野生型，△CgRGS4對H2O2更加敏感(圖7-A)。抑制率統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，△CgRGS4的抑制率均顯著高于野生型(圖7-B)，說明△CgRGS4對H2O2的耐受性降低。進而測定了野生型和△CgRGS4胞外過氧化氫酶活性，結果表明，△CgRGS4的胞外過氧化氫酶活性顯著低于野生型菌株(圖7-C)。由此可見，CgRGS4參與調控該病菌的氧化應激反應。

2.3.5 致病性測定

將野生型菌株和△CgRGS4接種到離體芒果上，培養(yǎng)數(shù)天后觀察致病效果。結果發(fā)現(xiàn)，無論是傷口接種還是無傷口接種，△CgRGS4侵染造成的病斑均明顯小于野生型菌株(圖8)，△CgRGS4的致病性明顯減弱。說明CgRGS4對膠胞炭疽菌的致病力造成了一定影響。

3 討論

RGS蛋白是G蛋白信號途徑中一類重要的調控因子，生物體內常含有多個RGS蛋白，從事不同的調控功能。釀酒酵母含有4個RGS蛋白(Sst2、Rgs2、Rax1和Mdm1)，在有性生殖、維持細胞極性和在高溫下維持細胞遺傳方面起著不同的作用[13-15]；稻瘟病菌含有8個RGS蛋白(MoRGS1-MoRGS8)，參與調控該病菌營養(yǎng)生長、細胞壁完整性、有性/無性產孢、附著胞分化和侵染菌絲的生長等生理過程[16]；在輪枝鐮孢菌中，6 個RGS蛋白(RgsA、RgsB、RgsC1、RgsC2、FlbA1和FlbA2)得到鑒定，分別參與調控分生孢子形成和伏馬菌素B1的合成，對宿主乙烯的合成也產生了一定影響[17]；在小麥赤霉病菌中，7個RGS蛋白(FgFlbA、FgFlbB、FgRgsA、FgRgsB、FgRgsB2、FgRgsC和FgGprK)在營養(yǎng)生長、分生孢子形成、毒素產生、有性生殖及致病過程中發(fā)揮著不同的作用[18]；可以看出，RGS蛋白在植物病原菌生長發(fā)育及致病過程中發(fā)揮著重要的作用。

A， H2O2對菌株生長的影響； B， 抑制率統(tǒng)計； C， 胞外過氧化氫酶活性測定A， Effect of H2O2 on the growth of strains; B， Statistical analysis of the inhibition rates; C， Determination of extracellular catalase activity圖7 H2O2對野生型和△CgRGS4生長的影響及胞外過氧化氫酶活性測定Fig.7 Effect of H2O2 on the growth of wild type and △CgRGS4 and determination of extracellular catalase activity

1、3，傷口接種；2、4，無傷口接種1， 3: Wound inoculation; 2， 4: Inoculation without wound圖8 野生型菌株與△CgRGS4致病性試驗Fig.8 Pathogenicity test of wild type and △CgRGS4

本研究發(fā)現(xiàn)，CgRGS4蛋白對膠孢炭疽菌的營養(yǎng)生長、滲透壓響應、氧化應激反應、黑色素產量及致病性都具有一定的影響。在稻瘟病菌中，CgRGS4的同源基因MoRGS4在分生孢子、附著胞和侵染菌絲階段的表達量均有所變化，表型分析發(fā)現(xiàn)MoRGS4對有性生殖，分生孢子產生、胞內cAMP水平、胞外漆酶和過氧化氫酶的活性以及致病性方面都有影響。此外，CgRGS4的同源基因在釀酒酵母、小麥赤霉病菌和輪枝鐮孢菌中也得到了研究。在釀酒酵母中，同源蛋白ScMdm1是維持高溫條件下細胞核遺傳和線粒體遺傳的必要蛋白，主要存在于RNA和核糖體合成末期及DNA合成前期的細胞中；在小麥赤霉病菌中，同源蛋白FgRgsC影響子囊殼內子囊孢子的產生以及子囊殼的形狀；而在輪枝鐮孢菌中，同源蛋白FvRgsC1并未表現(xiàn)出明顯的功能。

通過芒果接種發(fā)現(xiàn)，△CgRGS4的致病性明顯降低，此外試驗發(fā)現(xiàn)△CgRGS4胞外漆酶和過氧化氫酶活性也顯著降低。在真菌中，漆酶的活性與色素的形成、子實體的形成、分生孢子的致病性和脫毒作用等有關[19]。一些植物病原真菌還能利用漆酶免受宿主植保素和鞣質等化合物的影響[20]。因此，漆酶可看成是許多真菌致病的一種毒力因子。在植物與病原菌互作過程中，植物表面會產生大量的活性氧抵抗病原菌侵入，同時病原菌為了達到侵染的目的，會分泌一定量的胞外過氧化氫酶來降解這些植物表面活性氧[21]。研究表明，在稻瘟病菌中Moswi6基因參與調控了一些胞外過氧化物酶相關基因的表達，影響到了活性氧解毒的能力，進而導致稻瘟病菌致病性的改變[22]。鑒于以上研究，我們推測△CgRGS4胞外漆酶和過氧化物酶活性降低可能是導致其致病性下降的主要原因，關于CgRGS4對致病性的具體調控機制還有待更深層次的研究。

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(責任編輯 張 韻)

CgRGS4 regulates vegetative growth， osmotic pressure response， oxidative stress response and pathogenicity inColletotrichumgloeosporioides

XU Shuang， WU Manli， KE Zhijian， LIU Zhiqiang*， LI Xiaoyu

(CollegeofEnvironmentandPlantProtection，HainanUniversity，Haikou570228，China)

Regulators of G-protein signaling (RGS) are a kind of negative regulatory factor of G protein， which play an important role in growth development and pathogenicity of plant pathogen. However， there has been no research on biological functions of RGS inColletotrichumgloeosporioidesup to now. The aim of this study was to clone the gene ofCgRGS4 and analyze its biological function inC.gloeosporioides. TheCgRGS4 was cloned by PCR， and its gene-knockout mutant was obtained by homologous recombination. The biological functions of CgRGS4 were preliminarily determined through phenotypic analysis. The results showedCgRGS4 encoded a 1 224-amino acids protein， containing RGS， PXA and PX function domains. Compared with the wild type， the knockout mutant ofCgRGS4 had slow growth on poor medium， enhanced tolerance to osmotic stress， low melanin content， sensitivity to H2O2， decrease in extracellular laccase and catalase activity， decreased pathogenicity. In conclusion， CgRGS4 is involved in regulation of vegetative growth， osmotic pressure response， oxidative stress response and pathogenicity ofC.gloeosporioides.

Colletotrichumgloeosporioides; regulators of G-protein signaling; gene konckout; phenotypic analysis

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.02.14

2016-07-12

國家自然科學基金(31560045)；海南省自然科學基金(20153132)

徐爽(1990—)，女，陜西咸陽人，碩士研究生，研究方向為植物病原真菌學。E-mail: 412728386@qq.com

*通信作者，柳志強，E-mail: liuzhiqiang80@126.com

S432.1

A

1004-1524(2017)02-0277-09