大鼠心肌損傷后S100A4的表達(dá)變化及其意義

李江濤，張國(guó)珺，嚴(yán) 鵬

大鼠心肌損傷后S100A4的表達(dá)變化及其意義

李江濤1，張國(guó)珺2，嚴(yán) 鵬3

目的 分析大鼠心肌損傷后S100A4的表達(dá)變化及其意義的研究。方法 選取清潔級(jí)雄性健康大鼠24只，體重(211.1±6.8)g。按隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)分為兩組對(duì)照組與心肌損傷組，每組12只。通過(guò)注射異丙腎上腺素進(jìn)行心肌損傷大鼠的造模，進(jìn)行取血及心肌組織，采用光鏡與電鏡對(duì)大鼠心肌進(jìn)行組織學(xué)觀察；用蛋白免疫印跡法與免疫組織化學(xué)法檢測(cè)心肌蛋白表達(dá)。結(jié)果 對(duì)照組大鼠血液中的一氧化痰(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)值均顯著高于心肌損傷組大鼠，而心肌損傷組大鼠的乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)值均顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組大鼠表達(dá)平均光密度顯著低于心肌損傷組大鼠表達(dá)平均光密度，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；S100A4蛋白在心肌損傷組大鼠中的表達(dá)強(qiáng)，而在對(duì)照組大鼠中的表達(dá)弱。結(jié)論 大鼠心肌損傷后，S100A4蛋白在其心肌細(xì)胞中的表達(dá)變強(qiáng)。

心肌損傷；S100A4；異丙腎上腺素；心肌細(xì)胞

S100A4是一種多肽蛋，主要由101個(gè)氨基酸組成，屬S100蛋白家族，S100家族中已確定的成員總共有 21個(gè)，也是鈣離子結(jié)合蛋白家族中的最大亞家族之一[1-2]。有研究表明，S100A4 蛋白能促進(jìn)腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移，并能調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種功能，當(dāng)其與鈣離子相結(jié)合，通過(guò)鈣離子信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在其細(xì)胞增殖、分化、基因表達(dá)、肌肉收縮、分泌和凋亡中發(fā)揮著重要的作用[3-4]。S100A4蛋白能促血管生成，推測(cè)S100A4蛋白對(duì)心血管系統(tǒng)損傷可能起到保護(hù)作用[5-7]。本研究對(duì)大鼠進(jìn)行心肌損傷造模，分析大鼠心肌損傷后S100A4的表達(dá)變化及其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 蛋白定量試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；S100A4抗體(美國(guó)Promega公司)；考馬斯亮藍(lán)試劑盒(上海索寶生物科技有限公司)；一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)(北京中生北控生物科技有限公司)；N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、丙烯酰胺(湖北艾丹醫(yī)藥化工有限公司)、發(fā)光顯跡液(美國(guó)santa公司) ；0.2 mm PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)；十二烷基磺酸鈉(成都銀輝國(guó)際貿(mào)易有限公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(北京中山生物公司)；乳酸脫氫酶(LDH)；UV8500紫外-可見光分光光度計(jì) (上海天美科學(xué)儀器有限公司)；聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(美國(guó)進(jìn)口)。

1.2 心肌損傷大鼠的造模 選取清潔級(jí)雄性健康大鼠24只，體重(211.1±6.8)g，購(gòu)自昆明動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，所有大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)表法，隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組12只，心肌損傷組12只。參考相關(guān)文獻(xiàn)，心肌損傷大鼠造模方法：采用皮下注射異丙腎上腺素(ISO)法，劑量為850 μg/kg。對(duì)照組不進(jìn)行注射，正常喂養(yǎng)。待造模成功后，采用乙醚麻醉大鼠，取血待測(cè)，并迅速取其心肌，浸泡于戊二醛電鏡液中測(cè)定，剩余的采用液氮進(jìn)行冷凍保存。

1.3 觀察指標(biāo) ①血液生化指標(biāo)測(cè)定及方法，LDH活性測(cè)定采用比色法；MDA采用硫代巴比妥酸法；SOD活性的測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法；NO含量測(cè)定采用硝酸還原酶法測(cè)定。②S100A4蛋白免疫組化檢測(cè)，大鼠灌注固定30 min，取其心尖部的心肌組織，并迅速浸泡在含4%多聚甲醛的組織固定液中，1周后再進(jìn)行常規(guī)組織脫水、透明、包埋以及石蠟切片等，其片厚5 μm。取適量心肌組織進(jìn)行勻漿，提取總蛋白，并用考馬斯藍(lán)法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。取100 μg 的蛋白進(jìn)行上樣，經(jīng)十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜上，采用5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h，與一抗作用1 h后再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗在室溫下作用 45 min，進(jìn)行常規(guī)程序的顯影。最后采用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1 心肌損傷后大鼠血液中NO、LDH、SOD、MDA的變化 對(duì)照組大鼠血液中NO、SOD值均顯著高于心肌損傷組大鼠，而心肌損傷組大鼠的LDH、MDA值均顯著高于對(duì)照組大鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 大鼠血液中的NO、LDH、SOD、MDA的變化(±s)

2.2 大鼠心臟病理的電鏡觀察 對(duì)照大鼠心肌結(jié)構(gòu)均基本正常，心肌纖維排列整齊，毛細(xì)血管通暢，結(jié)構(gòu)清晰，且線粒體的結(jié)構(gòu)致密，在心肌間質(zhì)均未見明顯的滲出。而心肌損傷組大鼠心肌組織間質(zhì)滲出明顯，毛細(xì)血管發(fā)生擴(kuò)張，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷明顯，且有部分細(xì)胞凋亡，心肌纖維排列稀疏，線粒體發(fā)生輕度腫大，并呈單層的排列在心肌纖維兩側(cè)，有部分的線粒體嵴發(fā)生不同程度的斷裂，偶見局灶性的壞死。詳見圖1。

2.3 S100A4在心肌中的表達(dá) 采用蛋白免疫印跡觀察S100A4在心肌中的表達(dá)，其結(jié)果顯示：對(duì)照組大鼠的S100A4的達(dá)較弱，而心肌損傷組大鼠心肌血管組織中S100A4表達(dá)較高。詳見圖2。

圖2 蛋白免疫印跡觀察S100A4在心肌中的表達(dá)

2.4 S100A4的蛋白免疫組化 兩組大鼠免疫組化結(jié)果表明：對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)無(wú)棕黃色顆粒沉積，S100A4的表達(dá)較弱或不表達(dá)；心肌損傷組大鼠心肌細(xì)胞及毛細(xì)血管細(xì)胞內(nèi)均出現(xiàn)較多的棕黃色顆粒，S100A4表達(dá)較強(qiáng)。經(jīng)圖像分析顯示，對(duì)照組大鼠表達(dá)平均光密度顯著低于心肌損傷組大鼠表達(dá)平均光密度，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 S100A4的蛋白免疫組化(±s)

3 討 論

S100A4 蛋白結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)與其生物功能多樣性的相關(guān)十分密切。但對(duì)不同的S100 家族蛋白，通過(guò)對(duì)環(huán)繞的基本序列脯氨酸43進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域?qū)Y(jié)構(gòu)可塑性起著至關(guān)重要的作用[8-9]。異構(gòu)化的脯氨酸是內(nèi)在構(gòu)象轉(zhuǎn)換的過(guò)程，此過(guò)程對(duì)指導(dǎo)其配體的識(shí)別與調(diào)控蛋白的活性有潛在作用[10]。S100A4中至少有1個(gè)蛋白可能會(huì)在鉸鏈區(qū)誘導(dǎo)特異的構(gòu)象改變，且決定與靶分子之間的這種特殊蛋白-蛋白之間相互作用[11-12]。S100A4 蛋白與血管損傷、心肌損傷均具有一定的關(guān)系。其與血管再生及其胞外的基質(zhì)重塑具有關(guān)聯(lián)性，甚至可作為獨(dú)立血管刺激因子發(fā)揮作用[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)S100A4蛋白能刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP13)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑，而基質(zhì)降解與重塑是血管生成的一項(xiàng)必要步驟[14-15]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，植入到大鼠角膜中的移植物釋放出的S100A4蛋白能夠在一定程度上誘導(dǎo)新血管生成[16-17]。有學(xué)者揭示，S100A4蛋白和膜聯(lián)蛋白Ⅱ(annexin Ⅱ)進(jìn)行相互的作用，能促進(jìn)組織的纖溶酶原激活物介導(dǎo)纖溶酶原激活，活化纖溶酶誘導(dǎo)血管生成[18-19]。

近年有學(xué)者新發(fā)現(xiàn)，S100A4蛋白有促血管生成的作用，其在心肌肥大的大鼠心臟中表達(dá)會(huì)表現(xiàn)為升高，并對(duì)胚胎干細(xì)胞具有一定促心肌生成作用，其提示著S100A4蛋白對(duì)心臟損傷可能具有保護(hù)作用[10-21]。通過(guò)免疫組化的定量分析顯示，心肌肥大人的心臟中炎性細(xì)胞S100A4蛋白表達(dá)升高[22-23]。但損傷前的心肌細(xì)胞中S100A4蛋白完全不存在，而在急性缺血后的梗死區(qū)心肌細(xì)胞中顯示存在S100A4蛋白被染色標(biāo)定，但卻無(wú)S100A4mRNA的表達(dá)[24-25]。有研究證實(shí)，S100A4蛋白參與心肌的纖維化過(guò)程，且在異丙腎上腺素誘導(dǎo)損傷心肌中出現(xiàn)表達(dá)升高的情況，這可能是由于S100A4 蛋白與心肌的肥大以及心肌損傷有關(guān)的初步證據(jù)[26-27]。對(duì)于S100A4的調(diào)控機(jī)制目前尚未解釋清楚，這可能與干擾素、鈣離子、S100A4基因的低甲基化及結(jié)締組織的生長(zhǎng)因子( connective tissue growth factor，CTGF) 等因素調(diào)控有關(guān)。但S100A4不僅受到鈣離子的調(diào)控，且干擾素γ(IFN- γ) 能夠在一定程度上抑制住S100A4的表達(dá)[28]。S100A4 蛋白與多種間質(zhì)的細(xì)胞標(biāo)志物共同存在于人與大鼠心臟中，使該項(xiàng)研究具有更為重要的臨床意義。通過(guò)研究 S100A4蛋白的重組對(duì)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞發(fā)生直接作用，觀察S100A4 蛋白的重組體是通過(guò)依賴ERK1/2激活的狀態(tài)信號(hào)途徑，抑制住細(xì)胞的凋亡，對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞具有一定的促進(jìn)生長(zhǎng)與存活作用[29]。這提示著心肌損傷后 S100A4 蛋白可能是一個(gè)新表達(dá)上調(diào)的保護(hù)因子。Chen等[30]發(fā)現(xiàn)采用基因與藥物的干預(yù)，結(jié)果表現(xiàn)出 CTGF 介導(dǎo) S100A4 的上調(diào)大部分取決于ERK1/2激活狀態(tài)，并且CTGF 與 S100A4表達(dá)的水平都與人的乳腺腫瘤相關(guān)密切。故推測(cè) CTGF 可能在人乳腺腫瘤遷移與侵襲的過(guò)程中所發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，主要是由于通過(guò)integrin-al-phavbeta3 -ERK1/2- S100A4 的通路激活實(shí)現(xiàn)。

本研究采用異丙腎上腺素對(duì)大鼠進(jìn)行心肌損傷造模，對(duì)大鼠心肌損傷后S100A4的表達(dá)變化及其意義進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S100A4在心肌損傷組中的表達(dá)高于對(duì)照組，且對(duì)照組大鼠血液中的NO、SOD值均顯著高于心肌損傷組大鼠，而心肌損傷組大鼠的LDH、MDA值均顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其原因是否也是S100A4通過(guò)該信號(hào)的途徑抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷大鼠起一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

S100A4與多種疾病的產(chǎn)生有著密切的聯(lián)系，不僅在胞內(nèi)還能胞外發(fā)揮其生物學(xué)作用，這不但和組織的纖維化及腫瘤遷移等密切相關(guān)，還具有一定的促進(jìn)某些組織和器官的再生能力。至今，對(duì)于S100A4 蛋白功能進(jìn)行了一個(gè)比較全面的研究，但對(duì)于 S100A4 蛋白作用機(jī)制的研究還比較少，具體S100A4 蛋白在細(xì)胞的內(nèi)外發(fā)揮著怎么作用以及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是什么? 其是否還存在著特異性的受體? 仍待進(jìn)一步研究確定。相信隨著分子生物學(xué)的技術(shù)不斷發(fā)展，以及科研人員與學(xué)者對(duì)與S100A4 蛋白作用及其機(jī)制認(rèn)識(shí)將會(huì)更加系統(tǒng)全面與深入，并為今后的心血管損傷防護(hù)新藥的研發(fā)與上市奠定基礎(chǔ)，并且能為心血管疾病診斷與治療開辟新的思路。

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(本文編輯王雅潔)

1.中國(guó)政法大學(xué)研究生院證據(jù)科學(xué)研究院(北京 100082)，

E-mail：liuzhiweits@163.com；2.太原市公安局晉源分局；3.西安交通大學(xué) 法醫(yī)學(xué)院

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.03.015

1672-1349(2017)03-0313-04

2016-12-19)

引用信息：李江濤，張國(guó)珺，嚴(yán)鵬，等.大鼠心肌損傷后S100A4的表達(dá)變化及其意義[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(3)：313-316.