中藥活性成分對oxLDL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞泡沫化的影響

趙苗苗，王海芳，曹情雯，趙向絨，霍雪萍，孫晶瑩，王光華，胡 軍，劉勤社，3

中藥活性成分對oxLDL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞泡沫化的影響

趙苗苗1，王海芳1，曹情雯2，趙向絨1，霍雪萍1，孫晶瑩1，王光華1，胡 軍1，劉勤社1，3

目的 探討中藥活性成分黃芪甲苷(Astragaloside IV，ASIV)、羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)和芍藥苷(paeoniflorin，PAE)對小鼠主動脈平滑肌細(xì)胞(ASMCs)泡沫化過程的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)小鼠ASMCs，并利用免疫熒光染色對其進(jìn)行鑒定。利用氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)和腫瘤壞死因α (TNFα) 誘導(dǎo)ASMCs泡沫化，并應(yīng)用ASIV、HSYA和PAE進(jìn)行干預(yù)，觀察其對泡沫細(xì)胞形成的影響，應(yīng)用油紅O染色檢測細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、酶促比色法測定細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量變化；應(yīng)用RT-PCR和Western blot方法檢測凝集素樣氧化型低密度脂蛋白1 (LOX-1 )表達(dá)的變化。結(jié)果 oxLDL (80 μg/mL) 和TNFα (30 ng/mL)聯(lián)用72 h可誘導(dǎo)ASMCs泡沫化，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)顆粒明顯增多，細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量增加，LOX-1表達(dá)上調(diào)；ASIV、HSYA和PAE顯著抑制上述各過程。結(jié)論 ASIV、HSYA和PAE能夠抑制ASMCs泡沫化，抑制oxLDL誘導(dǎo)的LOX-1表達(dá)可能是其作用機(jī)制之一。

主動脈平滑肌細(xì)胞；氧化型低密度脂蛋白；凝集素樣氧化型低密度脂蛋白1 ；黃芪甲苷；羥基紅花黃色素A；芍藥苷；泡沫化過程；小鼠

動脈粥樣硬化(AS)是冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，而心腦血管疾病已成為威脅人類健康的主要殺手[1]。AS發(fā)生、發(fā)展的核心環(huán)節(jié)和主要的細(xì)胞學(xué)改變是氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)等脂類物質(zhì)在內(nèi)膜下不斷蓄積所導(dǎo)致的泡沫細(xì)胞形成。有證據(jù)表明，45%的泡沫細(xì)胞是平滑肌細(xì)胞表型，只有30%是巨噬細(xì)胞表型[2]?；钛z囊主要由黃芪、紅花和赤芍等12味中藥組成，臨床治療冠心病療效確切，能有效改善氣虛血瘀證，改善血脂和血液流變學(xué)變化。動物實驗表明其可減少AS 斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤，降低斑塊內(nèi) TNFα 表達(dá)及血清 IL-6 的水平[3]。黃芪甲苷(ASIV)、羥基紅花黃色素(HSYA)和芍藥苷(PAE)分別是黃芪、紅花、赤芍中含量最高的有效活性成分，前期研究表明，這些物質(zhì)能夠抑制體外細(xì)胞中腫瘤壞因子α(TNFα)激活的信號通路，發(fā)揮抗炎作用[4]。本研究通過體外培養(yǎng)主動脈平滑肌細(xì)胞(ASMCs)并誘導(dǎo)其泡沫化，觀察ASIV，HSYA和PAE對平滑肌泡沫細(xì)胞形成的直接影響，初步探討其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 小鼠ASMCs購自上海諾晨生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑與藥物 TNFα購自美國Calbiochem公司；氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)和油紅O購自上海魯汶公司；膽固醇測定試劑盒購自北京普利萊基因公司；RNA提取試劑盒購自TIANGEN BIOTECH；反轉(zhuǎn)錄及RT-PCR試劑盒購自TaKaRa；實驗所用一抗LOX-1、β-actin、-smooth muscle Actin(-SMA)購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) ASMCs采用含有10% 胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 免疫熒光染色鑒定 細(xì)胞接種在蓋片上，4%多聚甲醛固定；0.2% Triton X-100透化，5% BSA室溫封閉30 min，用1%BSA1∶50稀釋-抗孵育過夜，熒光二抗(1∶100)避光孵育30 min，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.3 油紅O染色 細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板內(nèi)，經(jīng)處理后用PBS潤洗，4 %多聚甲醛固定15 min，油紅O染色液染色30 min，蘇木素復(fù)染。倒置顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個區(qū)域進(jìn)行拍照。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量測定 培養(yǎng)細(xì)胞用PBS洗滌去除殘存培養(yǎng)液，按比例每1×106個細(xì)胞加入100 μL 裂解液，混勻，靜置10 min；取180 μL測定工作溶液加入微板，加入30 μL空白對照溶液、標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品；37℃ 反應(yīng)30 min；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算總膽固醇濃度。

1.2.5 Western blot法檢測凝集素樣氧化型低密度脂蛋白(LOX-1)蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞裂解樣品，氨基黑法定量，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)NC膜，5% 脫脂牛奶室溫封閉30 min，4℃一抗孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL法發(fā)光。

1.2.6 實時定量熒光RT-PCR 收集細(xì)胞，按說明書提取總RNA。以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄出cDNA鏈；采用TaKaRa熒光定量PCR試劑盒以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物：β-actin：正向引物 5′-TAGGCGGACTGTTACTGAGC-3′，反向引物5′-TGCTCCAACCAACTGCTGTC-3′； LOX-1正向引物5′- CCCTCCAAAGTCTCCCAACC-3′；反向引物5′-GCCTGCACTTGAGGAGGATT-3′。反應(yīng)條件：95℃ 變性20 s，58℃ 退火30 s，72℃ 延伸45 s，設(shè)40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，評價目的基因表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 ASMCs鑒定(見圖1) 以抗-SMA抗體進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果如圖1a 所示，激光共聚焦顯微鏡下ASMCs呈現(xiàn)綠色熒光，陰性對照組(圖b，未加抗-SMA一抗)則未見熒光信號。

注：a為ASMCs b為陰性對照組

2.2 油紅O染色(見圖2) 對照組細(xì)胞內(nèi)基本無紅色脂質(zhì)顆粒，oxLDL誘導(dǎo)組及oxLDL+TNFα誘導(dǎo)組細(xì)胞內(nèi)紅色脂質(zhì)顆粒明顯增多，且oxLDL+TNFα誘導(dǎo)組更為顯著。與oxLDL+TNFα誘導(dǎo)組相比，TNFα+oxLDL+ASIV組，TNFα+oxLDL+HSYA組及TNFα+oxLDL+PAE組細(xì)胞內(nèi)紅色脂質(zhì)顆粒都有不同程度的減少。

注：a為CN；b為oxLDL；c為oxLDL+TNFα；d為TNFα+oxLDL+ASIV；e為TNFα+oxLDL+HSYA；f為TNFα+oxLDL+PAE

2.3 細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量(見圖3) oxLDL誘導(dǎo)組及TNFα+oxLDL誘導(dǎo)組細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量較對照組顯著升高，且TNFα+oxLDL誘導(dǎo)組升高更為顯著。與TNFα+oxLDL誘導(dǎo)組相比，ASIV，HSYA和PAE均可以降低細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量(P<0.05)。

2.4 藥物對oxLDL誘導(dǎo)LOX-1基因表達(dá)的影響(見圖4) 如圖4a所示，oxLDL可誘導(dǎo)LOX-1 mRNA表達(dá)上調(diào)，其作用在6 h時最為明顯，因此我們選取6 h 為oxLDL作用時間。如圖4b所示，ASIV、HSYA和PAE(濃度100 μM)均能夠顯著抑制LOX-1 mRNA的表達(dá)。

圖3 藥物對細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量的影響

注：圖α為oxLDL誘導(dǎo)LOL-1mRNA表達(dá)的時效關(guān)系(*P<0.05 vs CN；**P<0.05 vs CN)。

2.5 藥物對oxLDL誘導(dǎo)LOX-1蛋白表達(dá)的影響 圖5a所示，oxLDL可誘導(dǎo)LOX-1 蛋白表達(dá)上調(diào)，其作用在6 h～8 h時較明顯，選取6 h 為oxLDL作用時間。如圖5b所示，ASIV、HSYA和PAE(濃度100 μM)均能夠顯著抑制LOX-1 mRNA的表達(dá)。詳見圖5。

注：圖a為oxLDL誘導(dǎo)LOX-1蛋白表達(dá)的時效關(guān)系；圖b為藥物對oxLDL誘導(dǎo)的LOX-1蛋白表達(dá)影響

3 討 論

AS是脂類物質(zhì)在血管內(nèi)膜下不斷蓄積所致的血管炎癥性反應(yīng)[5]，而泡沫細(xì)胞形成在AS的發(fā)生發(fā)展中扮演十分重要的作用，泡沫細(xì)胞形成有兩個主要生物學(xué)特征，包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞圓形，體積較大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂類物質(zhì)增多，或可形成脂滴；細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量增多[6-7]。這與油紅O染色及細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量測定的結(jié)果相一致。

黃芪是中藥臨床常用中藥之一，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有“補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌”等功效，古之醫(yī)家認(rèn)為“補脾胃之氣及胸中宗氣乃黃芪所長”[8]，ASIV是黃芪中的主要活性成分，目前主要以其評判黃芪藥材的優(yōu)劣[9]，現(xiàn)代藥理研究證實ASIV對心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腎臟、肺、腦、肝臟都具有一定的保護(hù)作用；紅花是傳統(tǒng)的活血化瘀類中藥，具有活血通經(jīng)，化瘀止痛的功效。《本草綱目》記載其具有：“活血、潤燥、止痛、散腫、通經(jīng)”的功效， HSYA作為中國藥典2010版規(guī)定的紅花最具代表性活性成分，是目前臨床用藥中為數(shù)不多的中藥注射劑之一[10]，發(fā)展前景可觀?，F(xiàn)代藥理研究證實其具有降膽固醇、降血壓、保護(hù)心肌細(xì)胞、抗腦血栓形成等作用；赤芍為毛茛科植物赤芍或川赤芍的干燥根，具有清熱涼血、散瘀鎮(zhèn)痛之功效。唐宋之后漸有白芍、赤芍之分，《本草綱目》曰：“白補而收，赤散而瀉”。許文平等[11]研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷可顯著抑制ApoE基因敲除小鼠血清TC、TG、LDL-C水平，降低主動脈各段斑塊面積/主動脈血管管腔面積比值，表明芍藥苷具有明顯的降脂及抑制動脈斑塊形成的作用。Li等[12]發(fā)現(xiàn)芍藥苷可以通過上調(diào)ABCA1及下調(diào)CD36的表達(dá)抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成。本研究證明：ASIV、HSYA和PAE 能夠在體外實驗中通過降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量而抑制ASMCs泡沫化進(jìn)而發(fā)揮抗AS作用。

LOX-1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類清道夫受體，在血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞等均有表達(dá)，介導(dǎo)并參與oxLDL內(nèi)吞和細(xì)胞內(nèi)信號激活，促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展[13]。血管平滑肌細(xì)胞泡沫化與LOX-1的表達(dá)密切相關(guān)，ox-LDL可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的LOX-1表達(dá)上調(diào)，且高濃度oxLDL的誘導(dǎo)作用更強，提示LOX-1是結(jié)合或內(nèi)吞oxLDL的重要受體[14]。本研究也證實：泡沫細(xì)胞形成后LOX-1基因及蛋白的表達(dá)均上調(diào)，且ASIV、HSYA和PAE可顯著抑制LOX-1基因及蛋白的表達(dá)。說明活血膠囊有效活性成分ASIV、HSYA和PAE抑制ASMCs泡沫化可能與LOX-1表達(dá)下調(diào)，脂類物質(zhì)攝取減少相關(guān)。

但影響LOX-1表達(dá)的具體途徑尚不確定，oxLDL誘導(dǎo)的ASMCs泡沫化可能還與負(fù)責(zé)膽固醇運輸(ABCA1)及酯化(ACAT1)的基因相關(guān)，泡沫細(xì)胞形成時， ABCA1表達(dá)升高，而ACAT1表達(dá)下降，后期實驗中，將繼續(xù)深入研究活血膠囊活性成分ASIV， HSYA和PAE抗血管平滑肌細(xì)胞泡沫化的機(jī)制，為中藥抗AS提供理論基礎(chǔ)。

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(本文編輯王雅潔)

國家自然科學(xué)基金常規(guī)面上項目(No.81573823)；陜西省自然科學(xué)基金資助項目(No.2015 JM 8460)

1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院陜西省人民醫(yī)院(西安 710061)；2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)

劉勤社，E-mail：lqsspph@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.03.014

1672-1349(2017)03-0310-04

2016-08-08)

引用信息：趙苗苗，王海芳，曹情雯，等.中藥活性成分對oxLDL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞泡沫化的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(3)：310-313.