不同產(chǎn)地香附炮制品的快速鑒別

喬 璐， 張 瑞， 趙博宇， 劉瑞娜， 韓盼盼,2， 周春亞,3， 張雨晴,4， 董誠(chéng)明*

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006；3. 江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；4. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193)

香附為莎草科植物莎草CyperusrotundusL.的干燥根莖，其性辛，味微苦、微甘，歸肝、脾、三焦經(jīng)，為婦科要藥之一[1-2]，其中生香附上行胸膈，外達(dá)肌膚，多為解表劑；醋香附長(zhǎng)于調(diào)經(jīng)止痛、去積、疏肝理氣；酒香附可行氣通絡(luò)；四制香附擅長(zhǎng)舒肝止痛、調(diào)氣血[3]。目前，關(guān)于香附的研究大多針對(duì)其藥理作用和化學(xué)成分[3-10]，但未涉及不同炮制品的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

紅外光譜以其快捷、安全性高、化學(xué)試劑消耗量少的特點(diǎn)，在中藥質(zhì)量鑒定與評(píng)價(jià)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[11-13]，同時(shí)結(jié)合主成分分析對(duì)原始變量進(jìn)行降維，可在最大程度保留原始數(shù)據(jù)信息基礎(chǔ)上提取少數(shù)幾個(gè)變量線性組合成新的變量，即一個(gè)主成分來(lái)反映整體變量信息從而達(dá)到樣品分類的化學(xué)計(jì)量法[14-15]，如云南重樓不同炮制品鑒定[16]、三七產(chǎn)地快速鑒別[17]、不同產(chǎn)地鎖陽(yáng)分類鑒別[18]、滇龍膽不同炮制品鑒別[19]、牛肝菌親緣研究等[20]。本實(shí)驗(yàn)采集15個(gè)產(chǎn)地香附，制成醋香附、酒香附、四制香附，通過紅外光譜比較其差異光譜特征，主成分分析判別模型進(jìn)行快速鑒別，旨在為該藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 藥材 香附共15批，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院董誠(chéng)明教授鑒定確為莎草科植物莎草CyperusrotundusL.的干燥根莖，產(chǎn)地見表1，參照2020年版《中國(guó)藥典》方法[21]炮制，具體見表2。

表1 香附產(chǎn)地

表2 香附炮制方法

1.2 儀器 INVENIOS型傅里葉變換紅外光譜儀(德國(guó)Bruker公司)；BX-2.5-10型數(shù)顯箱式電爐(上海柏欣儀器設(shè)備廠)；FA2004N型電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 紅外光譜儀參數(shù) 掃描范圍4 000～400 cm-1；掃描時(shí)間16 s；分辨率8 cm-1。每次掃描前先扣除CO2、H2O背景，再測(cè)量樣品峰值和吸光度，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.2 背景窗片制備 取KBr 0.50 g，于紅外燈下研磨均勻，精密稱取0.10 g，填充于窗片模具中，壓片機(jī)在10 MPa壓力下壓制5 s，小心取出，即得，要求呈均勻透明片狀，完整無(wú)破損裂紋。

1.3.3 供試窗片制備 將各批樣品烘干至恒重，研磨成粉末，粒度控制在200目以下，分別取0.01 g，加入KBr粉末1.00 g，于紅外燈下在研缽中研磨均勻，精密稱取0.10 g填充到窗片模具中，壓片機(jī)在10 MPa的壓力下壓制5 s，輕輕取出，即得，要求呈均勻透明片狀，無(wú)破碎裂紋，共壓制5片。

1.4 數(shù)據(jù)處理 OMNIC 9.0軟件對(duì)原始光譜進(jìn)行自動(dòng)基線校正、縱坐標(biāo)歸一化、21點(diǎn)平滑處理，得到香附樣品紅外譜圖，并進(jìn)行Norris二階求導(dǎo)。ORIGIN 2019軟件繪制紅外譜圖和主成分分析三維圖。SPSS 26.0軟件進(jìn)行主成分分析，設(shè)置特征值大于1為標(biāo)準(zhǔn)，建立主成分分析(PCA)模型。

2 結(jié)果

2.1 各批樣品紅外光譜 由圖1可知，各批樣品紅外光譜峰形基本相似，僅在3 500～2 500、1 700～500 cm-1區(qū)域內(nèi)少數(shù)吸收峰在位置和強(qiáng)度上存在差異；在3 270、2 925、2 360、2 320、1 732、1 630、1 520、1 455、1 419、1 368、1 336、1 245、1 148、1 075、1 000、930、860、760、704 cm-1處有吸收，3 000、1 495、1 185、810 cm-1處有波谷；3 265 cm-1處為羥基(O-H)、氨基(N-H)的伸縮振動(dòng)吸收峰，2 925 cm-1處為亞甲基(C-H)的伸縮振動(dòng)吸收峰，2 360、2 320 cm-1處為碳碳三鍵(C≡C)和碳氮三鍵(C≡N)伸縮振動(dòng)吸收峰，1 732 cm-1處為酯類羰基(C=O)的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 630 cm-1處為碳碳雙鍵(C=C)伸縮振動(dòng)吸收峰，1 520 cm-1處為氨基(N-H)的彎曲振動(dòng)吸收峰，1 455 cm-1處為甲基(C-H)的彎曲振動(dòng)吸收峰，1 419 cm-1處為羧基(COO-)的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 368、1 336 cm-1處為甲基(C-H)的彎曲振動(dòng)吸收峰；1 245、1 148、1 075、1 000、930、860、760、704 cm-1是指紋區(qū)。

圖1 各批樣品紅外譜圖Fig.1 Infrared spectra of different batches of samples

2.2 不同產(chǎn)地樣品紅外光譜 不同產(chǎn)地生品在3 275、2 925、1 639、1 419、1 365、1 245、1 148、1 000、857 cm-1處均有吸收，僅在峰位和峰強(qiáng)上稍有偏差，而在2 400～1 200 cm-1處存在較大差異，見圖2。再對(duì)差異較大的范圍進(jìn)行分別一階、二階求導(dǎo)[16]，發(fā)現(xiàn)二階求導(dǎo)后各樣品之間的差異性更明顯，見圖3，其中在2 187、2 114、2 058、1 995、1 730、1 454、1 370、1 245、1 153、1 084 cm-1均有吸收，僅在強(qiáng)度上存在細(xì)微差異；在2 390、2 301 cm-1處除河北、安國(guó)、大別山、安徽產(chǎn)樣品外均有吸收；所有樣品在2 258、2 213 cm-1處均有類雙駝峰的波谷存在，但河北、安國(guó)產(chǎn)樣品僅在2 213 cm-1處有一微波谷，安徽在此處較平緩；僅河北、安國(guó)、大別山產(chǎn)樣品在2 360 cm-1處有吸收；亳州、海南、吉林、廣東2、安徽產(chǎn)樣品在1 640 cm-1處有吸收，其余產(chǎn)地(除山東外)樣品均在1 610 cm-1處有吸收，河南2、云南產(chǎn)樣品在此處吸收較弱，山東產(chǎn)樣品在此處較平緩；僅吉林在1 420 cm-1處有COO-伸縮吸收，其余產(chǎn)地樣品均在1 454 cm-1處有(甲基C-H)單峰吸收，在1 370、1 325 cm-1處有(甲基C-H)雙峰吸收。綜上所述，在2 400～2 240 cm-1處，河北、安國(guó)、安徽、大別山產(chǎn)樣品與其他產(chǎn)地樣品差異較大；在1 640～1 608 cm-1處，僅亳州、海南、廣東、安徽產(chǎn)樣品較相似，而山東產(chǎn)樣品與其他產(chǎn)地樣品差異較大；在1 420～1 320 cm-1處，吉林產(chǎn)樣品與其他產(chǎn)地樣品差異較大。

圖2 不同產(chǎn)地樣品紅外譜圖Fig.2 Infrared spectra of samples from different producing areas

圖3 不同產(chǎn)地樣品二階譜圖Fig.3 Second order spectra of samples from different producing areas

2.3 炮制品(4號(hào)樣品制備)差異性分析

2.3.1 紅外譜圖 各炮制品在3 275、2 920、1 633 cm-1處均有吸收，峰位、峰強(qiáng)稍有偏移；在2 400～1 000 cm-1處峰形有較大變化，為放大差異，對(duì)其進(jìn)行Norris二階求導(dǎo)，見圖4～5；在2 400～2 040 cm-1范圍內(nèi)，酒制品在2 123、2 087、2 049 cm-1處有三峰吸收，醋制品、四制品僅在2 123、2 049 cm-1處有雙峰吸收，生品則偏移至2 118、2 061 cm-1處有雙吸收；在1 940～1 746 cm-1范圍內(nèi)，所有樣品均在1 869、1 835、1 795 cm-1處有微弱吸收，生品僅在1 605 cm-1處有一單峰吸收；炮制品在1 553 cm-1處為單尖峰吸收，生品在此處為波谷；炮制品在1 129、1 096、1 060 cm-1處均為三波谷，生品僅在1 084 cm-1有吸收，在1 120、1 060 cm-1處有兩個(gè)波谷；醋制品、酒制品在1 024 cm-1處吸收，炮制品在1 018 cm-1處均有波谷存在，生品在此處則比較平緩。綜上所述，各炮制品之間的差異性主要在2 400～2 040、1 940～1 745、1 695～1 553、1 200～1 000 cm-1等處。

圖4 各炮制品紅外譜圖Fig.4 Infrared spectra of various processed products

圖5 各炮制品二階紅外譜圖Fig.5 Second-order spectra of various processed products

2.3.2 平均紅外譜圖 對(duì)各炮制品紅外譜圖進(jìn)行平均處理，以更清楚地觀察其差異,見圖6，再對(duì)差異較大的2 400～ 1 000 cm-1進(jìn)行二階求導(dǎo)，見圖7。在2 400～2 040 cm-1處，炮制品在2 371、2 317、2 228、2 045 cm-1處均尖峰吸收，生品僅在2 388、2 069 cm-1處有一鈍峰吸收；炮制品在2 097、2 069 cm-1處為雙波谷、生品僅在2 087 cm-1為單波谷；在1 941～1 763 cm-1處，生品幾乎無(wú)吸收，炮制品在此處有弱峰存在，此處為羰基吸收，推測(cè)為醛酮類成分；在1 695 cm-1處除四制品外，其余樣品波谷均較尖銳；炮制品在1 645、1 608 cm-1處有(C=C、C=N)雙峰吸收，可能是皂苷類成分；炮制品在1 206、1 417 cm-1處均有(COO-)單峰吸收，生品在此處較平緩；炮制品在1 125、1 098 cm-1處均為尖銳雙峰吸收；在1 111 cm-1為尖銳單峰吸收，生品僅在1 111 cm-1有一波谷。綜上所述，各炮制品差異主要在2 400～2 040、1 941～1 763、1 645、1 608、1 330 cm-1處，并且生品與炮制品之間的差異較大，而酒制品與四制品之間的差異較小。

圖6 各炮制品平均紅外譜圖Fig.6 Average infrared spectra of various processed products

圖7 香附各炮制品平均二階紅外譜圖Fig.7 Average second-order infrared spectra of various processed products

課題組前期研究表明，香附經(jīng)醋制后揮發(fā)油含量降低，其中α-香附酮含量依次為酒制品>四制品>生品>醋制品[22]；但也有研究指出，醋制后α-香附酮溶出度、含量提高，具有抑制離體子宮肌收縮、解熱鎮(zhèn)痛作用，并且抗炎鎮(zhèn)痛活性強(qiáng)于生品、酒制品、四制品，生品也可能因此大多作為解表劑使用[3,23-26]。另外，醋香附中四甲氧基安息香醛、反茴香腦、十六烷酸完全消失，酸類含量降低，揮發(fā)油中烯類、酮類成分升高；醋香附、酒香附中皂苷含量升高[22]，使其疏肝行氣作用更強(qiáng)；7-甲氧基異黃酮、木犀草素具有一定的細(xì)胞毒性，可能是香附小毒的原因，而經(jīng)炮制后可與某種成分相互作用來(lái)抵消其毒性，并且醇提的抑菌、行氣作用優(yōu)于生品[25-26]。

2.4 主成分分析 本實(shí)驗(yàn)分別采用二階求導(dǎo)后光譜峰位信息、原始光譜峰位置、峰強(qiáng)信息建模，發(fā)現(xiàn)二階求導(dǎo)后光譜峰位信息所建模型明顯更優(yōu)，樣品之間的差異性增大，所提取主成分對(duì)原始變量信息的解釋度更高，故以其建立主成分分析模型[27]，結(jié)果見表3，再以前3個(gè)主成分PC1、PC2、PC3為坐標(biāo)建立主成分分析三維圖，見圖8。由此可知，生品(黑色)與醋制品(紅色)、酒制品(藍(lán)色)、四制品(綠色)可完全區(qū)分；醋香附與酒香附可完全區(qū)分，因?yàn)閮烧咴谂谥七^程中所用輔料不同；四制香附在醋香附、酒香附中間位置，因?yàn)槿咴谂谥七^程中所用輔料有重合，所含化學(xué)成分也相似，導(dǎo)致區(qū)別不顯著。

表3 各主成分特征值和累積貢獻(xiàn)率

圖8 主成分分析圖Fig.8 Diagram for principal component analysis

3 結(jié)論

采用紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量法建立來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)不同產(chǎn)地香附炮制品的快速鑒別，發(fā)現(xiàn)其差異成分可能為黃酮類、皂苷類、醇浸出物等，可為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供新思路。