運(yùn)動補(bǔ)劑對不同運(yùn)動方式下骨骼肌自噬的影響

張殿福

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014109）

運(yùn)動補(bǔ)劑對不同運(yùn)動方式下骨骼肌自噬的影響

張殿福

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014109）

通過建立跑臺運(yùn)動和負(fù)重游泳運(yùn)動的小鼠模型，分析研制的運(yùn)動補(bǔ)劑對小鼠骨骼肌自噬相關(guān)基因LC3、Atg7、Atg9和Beclin1的影響。運(yùn)動補(bǔ)劑采用瑪咖提取物、燕麥提取物、亨育賓提取物、L-精氨酸-α-酮戊二酸鹽和蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)制備，經(jīng)灌胃的方式使小鼠服用，之后檢測跑臺運(yùn)動和負(fù)重游泳運(yùn)動后骨骼肌自噬相關(guān)基因的表達(dá)水平.與安靜組相比，跑臺運(yùn)動組和負(fù)重游泳運(yùn)動組小鼠在不服用運(yùn)動補(bǔ)劑的時候均可以提高小鼠骨骼肌細(xì)胞的自噬水平（P＜0.05），其中負(fù)重游泳運(yùn)動提升自噬水平更明顯。而在攝入運(yùn)動補(bǔ)劑后，小鼠骨骼肌自噬水平再次提高，其中負(fù)重游泳運(yùn)動配合運(yùn)動補(bǔ)劑的方式上升最為明顯（P＜0.01）。證明我們所制備的運(yùn)動補(bǔ)劑對提高小鼠骨骼肌細(xì)胞自噬水平存在上調(diào)作用，而與無氧運(yùn)動組合后提升效果更明顯。

運(yùn)動補(bǔ)劑；小鼠；骨骼?。蛔允?/p>

肥胖嚴(yán)重影響我國人民的身體健康，除了控制飲食，減少熱量攝入，合理的運(yùn)動訓(xùn)練可以顯著提高減肥效果。在運(yùn)動訓(xùn)練中攝入運(yùn)動補(bǔ)劑的研究逐步開展，大量的研究已經(jīng)證明，運(yùn)動補(bǔ)劑可以提高運(yùn)動訓(xùn)練的效率，并提供一定的安全性[1]。細(xì)胞自噬是一種普遍存在于病理和正常狀態(tài)細(xì)胞的重要周轉(zhuǎn)過程，脂質(zhì)過氧化物、損傷的細(xì)胞器、衰老的蛋白質(zhì)和游離的不明物質(zhì)等被雙層膜包裹，再通過與細(xì)胞內(nèi)的溶酶體結(jié)合，對內(nèi)容為進(jìn)行降解處理，之后再形成生物大分子再被吸收，完成物質(zhì)的回收利用[2]。生物體內(nèi)的自噬過程對于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、發(fā)育、分化和生存有著明顯調(diào)節(jié)作用，而且當(dāng)機(jī)體發(fā)生應(yīng)激突發(fā)反應(yīng)時，細(xì)胞自噬可以作為一種保護(hù)手段，提高健康細(xì)胞的代謝活性和存活幾率[3]。研究指出多種刺激均可以引起小鼠骨骼肌自噬水平的變化，如機(jī)體氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)異常積累、能量匱乏等，這些刺激方式與不同運(yùn)動方式產(chǎn)生的刺激相接近，均可以影響人體在運(yùn)動過程中的表現(xiàn)[4]。對于阻抗運(yùn)動和有氧運(yùn)動的研究，均證實(shí)在這些運(yùn)動過程中可以明顯上調(diào)小鼠骨骼肌內(nèi)的自噬水平，提高骨骼肌細(xì)胞的代謝效率，但是這種上調(diào)狀況存在明顯差異，這一現(xiàn)象必然影響骨骼肌細(xì)胞的代謝活性，影響運(yùn)動后的恢復(fù)效果[5-6]。在運(yùn)動過程中，骨骼肌細(xì)胞對于營養(yǎng)物質(zhì)和能量需求較大，那么實(shí)時補(bǔ)充運(yùn)動補(bǔ)劑，是否可以使骨骼肌細(xì)胞處于自噬反應(yīng)增強(qiáng)的狀態(tài)，進(jìn)而維持較強(qiáng)的代謝水平。因此，本研究在不同種類的小鼠運(yùn)動訓(xùn)練模型中使用自主研發(fā)的運(yùn)動補(bǔ)劑進(jìn)行補(bǔ)充，分析這種組合模式對小鼠骨骼肌肉自噬水平的影響情況。

1 材料與方法

1.1 運(yùn)動補(bǔ)劑的制備

參考市場上主流的運(yùn)動補(bǔ)劑配方進(jìn)行設(shè)計，具體配方如下：每100 mL運(yùn)動補(bǔ)劑中蛋白質(zhì)（33 g）、糖（2 g）、膳食纖維（1 g）、瑪咖提取物（2%）、燕麥提取物（2%）、亨育賓提取物（2%）、L-精氨酸-α-酮戊二酸鹽（L-Arginine-α-Ketoglutarate）（1%）、維生素、微量元素和無機(jī)鹽共1 g。

1.2 儀器

SJ-CJ-1FDQ單面工作臺：蘇州蘇凈；AL104電子天平：梅蔣勒－托利多儀器；ZH-PT小鼠跑臺：安徽正華生物儀器；DJ-XSC小鼠恒溫泳池：上海繼德教學(xué)實(shí)驗(yàn)器械；TG-16高速低溫冷凍離心機(jī)：湖南湘儀；ABI 7500熒光定量PCR儀：Life。

手術(shù)刀，無菌操作臺。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物及分組

4周齡清潔級ICR雄性小鼠150只，體重（33.6± 3.21）g，隨機(jī)分成5組，每組30只小鼠，分為：安靜組，跑臺組，負(fù)重游泳組，跑臺+運(yùn)動補(bǔ)劑組和負(fù)重游泳+運(yùn)動補(bǔ)劑組。

1.4 運(yùn)動方案

根據(jù)分組情況，設(shè)定實(shí)驗(yàn)方案，具體情況見表1。其中安靜組小鼠作為對照組，不進(jìn)行任何運(yùn)動，按照標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)程序飼養(yǎng)。跑臺組在訓(xùn)練過程中，觀察小鼠狀態(tài)，特別是運(yùn)動心態(tài)；負(fù)重游泳組在游泳過程中，避免發(fā)生溺水事件。進(jìn)行運(yùn)動補(bǔ)劑攝入的實(shí)驗(yàn)組，每日嚴(yán)格稱量小鼠體重，按照方案要求攝入新鮮配制的運(yùn)動補(bǔ)劑。

1.5 骨骼肌自噬水平檢測

1.5.1 訓(xùn)練2周后，開始進(jìn)行測試，所有訓(xùn)練小鼠按照訓(xùn)練計劃方法進(jìn)行力竭訓(xùn)練。

表1 運(yùn)動訓(xùn)練方案情況Table1 Sport training plan

1.5.2 動物處死與取材

所有動物在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即處死，迅速取下雙側(cè)下肢腓腸肌，稱重后放入凍存管，置于液氮中保持，20min后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱備用。

1.5.3 Real-time PCR檢測

1.5.3.1 總RNA的提取與鑒定

取凍存的腓腸肌，取材后采用Trizol法提取總RNA，具體步驟按照說明書進(jìn)行。采用紫外分光光度計對提取的總RNA進(jìn)行測量，總RNA根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求采用DEPC水稀釋，選合適濃度之后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。根據(jù)待檢測基因，設(shè)計引物，引物設(shè)計結(jié)果如表2所示。

表2 引物設(shè)計Table2 Primers design

1.5.3.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

具體的逆轉(zhuǎn)錄過程如下：取5μL樣品RNA，5ⅹRT-PCR Buffer 2μL，RTEnzyme Mix 0.5μL，無RNA酶水2μL，反應(yīng)條件如下：37℃15min，98℃5min。反應(yīng)結(jié)果放于-20℃冰箱中備用。

1.5.3.3 Real-timePCR

具體的Real-timePCR體系如下：總體積20μL，cDNA產(chǎn)物2μL，SYBR green PCRMaster Mix 10μL，引物0.8μL，PCR水6.4μL。

具體的反應(yīng)步驟如下：1）95℃60 s，進(jìn)行預(yù)變性；2）95℃15 s→61℃30 s→72℃45 s，共計40個循環(huán)；3）建立溶解曲線，進(jìn)行95℃15 s變性、55℃60 s退火，之后15 s內(nèi)從55℃逐步加熱到95℃，每1個℃變化收集一次熒光信號。

根據(jù)溶解曲線主峰情況，分析擴(kuò)增的特異性。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)軟件輸出的CT值，結(jié)合β-actin數(shù)值，分析各個目的基因的表達(dá)水平。

1.6 不良反應(yīng)事件分析

觀察所有參與實(shí)驗(yàn)的小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中的狀況，如出現(xiàn)死亡等情況要做出詳細(xì)分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析均采用spss18.0，計量資料進(jìn)行采用t檢驗(yàn)，計數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 骨骼肌自噬相關(guān)基因表達(dá)情況分析

經(jīng)檢測各組小鼠自噬相關(guān)基因表達(dá)的表達(dá)水平如表3所示。

表3 LC3、Atg7、Atg9、Beclin1基因表達(dá)情況Table3 Gene expression of LC3，Atg7，Atg9，Beclin1

與安靜組相比較，跑臺組小鼠Atg7和Beclin1均發(fā)生明顯的表達(dá)水平上調(diào)，其中Atg7上調(diào)差異顯著（P＜0.05），Beclin1差異極顯著（P＜0.01），與負(fù)重游泳組相比，跑臺運(yùn)動不能顯著提高各項基因；而與攝入補(bǔ)劑后的跑臺運(yùn)動組相比，各項基因表達(dá)水平減少，證明運(yùn)動補(bǔ)劑可以提高跑臺運(yùn)動小鼠的骨骼肌細(xì)胞自噬水平。與安靜組相比較，負(fù)重游泳組小鼠Atg7、Atg9和Beclin1均發(fā)生明顯的表達(dá)水平上調(diào)，其中Atg7上調(diào)差異顯著（P＜0.05），Atg9和Beclin1差異極顯著（P＜0.01），而與攝入補(bǔ)劑后的游泳運(yùn)動組相比，各項基因表達(dá)水平減少，證明運(yùn)動補(bǔ)劑可以提高負(fù)重運(yùn)動小鼠的骨骼肌細(xì)胞自噬水平。與安靜組相比較，跑臺+運(yùn)動補(bǔ)劑組和負(fù)重游泳+運(yùn)動補(bǔ)劑組小鼠LC3、Atg7、Atg9和Beclin1均發(fā)生明顯的表達(dá)水平上調(diào)，四項指標(biāo)均存在差異極顯著（P＜0.01），同時與未攝入補(bǔ)劑的實(shí)驗(yàn)組相比，各個相關(guān)基因表達(dá)水平同樣發(fā)生顯著增加（P＜0.05）。

2.2 不良反應(yīng)事件分析

在訓(xùn)練和測試過程中，各組實(shí)驗(yàn)小鼠均未發(fā)生任何不良反應(yīng)事件，均正常完成訓(xùn)練和實(shí)驗(yàn)。

3 討論

細(xì)胞自噬過程是指在溶酶體的作用下使細(xì)胞內(nèi)自身細(xì)胞器和大分子物質(zhì)發(fā)生自身降解，這種細(xì)胞在面臨代謝壓力的情況下，發(fā)揮的一種提高環(huán)境適應(yīng)性的調(diào)節(jié)機(jī)制，對維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)有著積極意義。同時對于人或動物的運(yùn)動來說，自噬可以提高對糖類物質(zhì)的利用率，進(jìn)一步提高人或動物的運(yùn)動水平，促進(jìn)人類健康[7]。骨骼肌細(xì)胞發(fā)生自噬，可以有效提高細(xì)胞內(nèi)線粒體的產(chǎn)生和質(zhì)量，持續(xù)對機(jī)體的持續(xù)供能和健康維護(hù)[8]。目前，已經(jīng)有少量報道指出不同的運(yùn)動模式，對于骨骼肌細(xì)胞自噬水平存在一定影響[8]，但是對于運(yùn)動補(bǔ)劑是否通過調(diào)劑細(xì)胞自噬水平或激活細(xì)胞自噬信號達(dá)到提高機(jī)體運(yùn)動能力的研究鮮有報道。

我們參考市面主流運(yùn)動補(bǔ)劑配方，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室多年研究，開發(fā)的運(yùn)動補(bǔ)劑含有豐富營養(yǎng)成分和大量生物活性物質(zhì)，但功能并不明確。因?yàn)閺姆肿訖C(jī)制上講，細(xì)胞自噬可以改善谷歌肌細(xì)胞內(nèi)的抗氧化和能力代謝，因此有研究指出，采用分析小鼠骨骼肌，特別是腓腸肌和比目魚肌細(xì)胞的自噬水平方法，對運(yùn)動補(bǔ)劑緩解運(yùn)動性疲勞、提高運(yùn)動能力和改善運(yùn)動適應(yīng)性的研究有積極意義[9-10]。因此在本研究中，我們采用Realtime PCR的方法分析小鼠骨骼肌中自噬相關(guān)基因的表達(dá)水平。其中，關(guān)于LC-3、Atg7、Atg9和Beclin1的mRNA的檢測結(jié)果顯示在無氧運(yùn)動（負(fù)重游泳）較有氧運(yùn)動（跑臺訓(xùn)練）可以明顯的基因的表達(dá)水平，說明無氧運(yùn)動對LC-3、Atg7、Atg9和Beclin1的mRNA的表達(dá)可以造成顯著性影響。而在攝入運(yùn)動補(bǔ)劑后，LC-3、Atg7、Atg9和Beclin1在攝入補(bǔ)劑組較安靜對照組、跑臺組和負(fù)重游泳組發(fā)現(xiàn)顯著性提高，證明本研究所制備的運(yùn)動補(bǔ)劑對于提高骨骼肌細(xì)胞的自噬水平有顯著性影響。

通過本研究，證明我們所開發(fā)的運(yùn)動補(bǔ)劑可配合有氧運(yùn)動或無氧運(yùn)動，達(dá)到通過提高骨骼肌細(xì)胞自噬相關(guān)基因的表達(dá)水平的目的。

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Sports Supplement Cooperation on Different Sports Modes on Skeletal Muscle Autophagy

ZHANG Dian-fu
（Vocational and Technical College of Inner Mongolia Agricultural University，Baotou 014109，Inner Mongolia，China）

By establishing a mouse model of treadmill exercise and loading swimming sports，analysis the effect of sports supplement in LC3，Atg7，Atg9，Beclin 1 of mice skeletal muscle autophagy-related genes.Sports supplements prepared using Maca extract，oat extract，Corynante Yohimbe extract，L-arginine-α-ketoglutarate and protein and other nutrients.The mice eated sports supplement by lavage，and detected the autophagy-related gene expression level in skeletal muscle after the treadmill Exercise and after swimming exercise.Compared with the quiet group，treadmill exercise group and the loading swimming exercise group can improve the autophagy level of mice skeletal muscle cells（P＜0.05），in which the swimming motion to enhance the level of autophagy more obvious.And after taked sports supplements，the level of skeletal muscle autophagy was increased again，where loading swimming sports with sports supplements were increased more obviously（P＜0.01）. The result proved that sports supplements play a role in the increase the presence of skeletal muscle cell autophagy level，and supplements combination with anaerobic exercise could enhance skeletal muscle cell autophagy level more obviously.

sports supplements；mouse；skeletal muscle；autophagy

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.043

2016-09-13

張殿福（1972—），男（漢），副教授，碩士，研究方向：體育教育訓(xùn)練學(xué)。