LC—MS/MS 法測定烏苯美司及甲氨蝶呤在臨床藥物相互作用中的應(yīng)用

劉磊　佟學(xué)豐　徐鑫　張馨月　劉志浩　孟強(qiáng)　王長遠(yuǎn)

[摘要] 目的 建立靈敏、高效、專屬性強(qiáng)的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法用于測定生物樣品中烏苯美司和甲氨蝶呤的濃度。 方法 兩種LC-MS/MS法均采用乙腈沉淀蛋白法處理生物樣品，應(yīng)用Hypersil ODS-C18色譜柱分離，通過電噴霧電離源串聯(lián)質(zhì)譜，以多反應(yīng)監(jiān)測方式進(jìn)行負(fù)離子檢測，測定生物樣品中烏苯美司和甲氨蝶呤的濃度。其中，m/z 309.10 →m/z 120.30，m/z 455.20→m/z 308.20和m/z 370.40→m/z 288.10分別作為烏苯美司、甲氨蝶呤和西洛他唑（內(nèi)標(biāo)）定量分析時(shí)監(jiān)測的離子對，色譜分離的流動相為乙腈-0.1%甲酸水（60∶40，=v/v），流速為0.4 mL/min。結(jié)果 苯美司、甲氨蝶呤在2.00～2000.00 ng/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2=0.9976）。 結(jié)論 所建的LC-MS/MS法快速、靈敏、專屬性強(qiáng)，適用于烏苯美司和甲氨蝶呤臨床藥代動力學(xué)研究。

[關(guān)鍵詞] 烏苯美司；甲氨蝶呤；藥物相互作用；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用

[中圖分類號] R927.2；R961 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2016）30-0144-05

腫瘤是一類嚴(yán)重危害人類健康的多發(fā)病、常見病?；熢诎┌Y綜合治療中處于不可缺少的重要地位，為了提高化療的療效，醫(yī)學(xué)工作者開展了多方面的研究，如開發(fā)新的高效低毒的藥物，更科學(xué)合理聯(lián)合用藥以協(xié)同增效等。其中，聯(lián)合用藥是臨床上長期使用且合理有效的治療手段，所以藥物相互作用（drug-drug-interaction，DDI）是長期困擾臨床治療的問題之一[1]。P-糖蛋白（P-gp）影響藥物代謝動力學(xué)及口服生物利用度，臨床上許多的癌癥化療藥物是P-糖蛋白的底物，都被它所外排[2，3]。有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（organic anion transporter，OATs）將血液中的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)至腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)，OATs能夠轉(zhuǎn)運(yùn)一些內(nèi)源性陰離子代謝物及某些有機(jī)陰離子藥物[4-6]。甲氨蝶呤（MTX）是治療腫瘤和一些自身免疫性疾病的有效的抗癌藥物。近些年來有報(bào)告指出，甲氨蝶呤的多藥耐藥與藥物相互作用常與P-gp和OATs有關(guān)[7-9]。烏苯美司（bestatin）是臨床上常用的一種免疫增強(qiáng)劑，用于配合其它化療藥物的治療。當(dāng)甲氨蝶呤與烏苯美司合用時(shí)，這些轉(zhuǎn)運(yùn)體是否影響二者體內(nèi)動態(tài)和臨床療效也不明確[10-12]。因此，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖墙㈧`敏、高效的LC-MS/MS檢測方法闡明甲氨蝶呤和烏苯美司相互作用分子藥代學(xué)機(jī)制。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent HP1200 液相色譜系統(tǒng)（美國Agilent公司）API 3200 型三重四級桿質(zhì)譜儀（美國Applied Biosystems公司）；FCR 2002-UF型純水機(jī)（德國FLOM公司）；HSC-24B型氮?dú)獯蹈蓛x（中國天津恒奧科技有限公司）；ST-16R型高速離心機(jī)（德國Thermo公司）；AL104萬分之一電子天平（梅特勒儀托利多公司）。

1.2 試劑

烏苯美司對照品（深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號：H2006 7632，純度>99.0%）；甲氨蝶呤對照品（美國sigma公司，批號：119H1449，純度>99.0%）；西洛他唑原料藥（IS， 浙江金立源藥業(yè)有限公司，批號：H20083045，純度>99.0%）；甲醇為色譜純（美國Tedia公司），其他試劑均為分析純。

1.3 研究對象

健康幼年雄性Wistar大鼠，體重220～250 g由大連醫(yī)科大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)動物中心提供，潔凈級，許可證號：SCXK（遼）2008-0002。OAT1和OAT3細(xì)胞由中科院上海藥物所宮麗琨教授友情提供。MDR1-MDCK細(xì)胞由浙江大學(xué)曾蘇教授友情提供。K562、K562/ADR細(xì)胞購自凱基生物。

2 方法與結(jié)果

2.1主要溶液的配制

2.1.1 對照品溶液的配制 分別精密稱取烏苯美司和甲氨蝶呤標(biāo)準(zhǔn)品10.1 mg，用甲醇∶水（50∶50，v/v）溶液精確定容于10 mL容量瓶中得到1.00 mg/mL的儲備液I及2.00、5.00、20.00、50.00、200.00、500.00和2000.00 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；配制出低、中、高三個不同濃度的質(zhì)量控制樣品（其QC濃度分別為4.00、50.00和1000.00 ng/mL）。儲備液I以及標(biāo)準(zhǔn)系列溶液均置于4℃保存，并于使用前放置至室溫。

2.1.2 西洛他唑內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取西洛他唑標(biāo)準(zhǔn)品10.1 mg，用甲醇∶水（50∶50，v/v）溶液精確定容于10 mL容量瓶中得到1.00 mg/mL的儲備液I；精密移取9 μL內(nèi)標(biāo)儲備液I，置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻。獲得濃度約為180 ng/mL的西洛他唑內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2 檢測條件

2.2.1 色譜條件的選擇 流動相條件為：0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液（60∶40，v/v）；流速為0.4 mL/min；色譜柱為Hypersil ODS-C18柱（100×2.1 mm，I.D. 5 μm，中國大連伊力特公司）；柱溫為室溫，進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件的選擇 電噴霧電離源（ESI），采用正離子模式掃描；離子噴射電壓為4700 V；溫度為570℃；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），烏苯美司 m/z 309.10→m/z 120.30、甲氨蝶呤m/z 455.20→m/z 308.20和內(nèi)標(biāo)m/z 370.40→m/z 288.10（各化合物的結(jié)構(gòu)及產(chǎn)物離子見圖1）；碰撞能量（CE）為32 eV（烏苯美司）、27 eV（甲氨蝶呤）和20 eV（內(nèi)標(biāo)IS）；掃描時(shí)間為150 ms。

2.3 血漿樣品處理

實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食過夜（不禁水）。實(shí)驗(yàn)時(shí)，先將大鼠麻醉，通過頸靜脈注射給藥后在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行頸靜脈取血。取血漿50 μL，加入50 μL甲醇和50 μL內(nèi)標(biāo)溶液（180 ng/mL），200 μL乙腈，渦旋混勻1 min；離心（16 099×g）10 min，取上清液于另一EP管中，37℃氮?dú)饬飨麓蹈?，殘留物加?00 μL流動相復(fù)溶，15 000 r/min 離心10 min，取上清于進(jìn)樣小瓶中，10 μL進(jìn)樣分析。

2.4 方法專屬性實(shí)驗(yàn)

取空白血漿50 μL加入100 μL甲醇，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，得空白血漿樣品色譜圖（圖2A）。取血漿50 μL，加入50 μL對照品溶液和50 μL內(nèi)標(biāo)溶液配制成相當(dāng)于血漿濃度200 ng/mL的血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，得對照品色譜圖（圖2C）。給藥30 min后的血漿處理進(jìn)樣得色譜圖（圖2D）。結(jié)果表明在選定色譜、質(zhì)譜條件下，血漿內(nèi)源性雜質(zhì)對待測物無干擾，烏苯美司、甲氨蝶呤及內(nèi)標(biāo)物峰形良好，分離完全，保留時(shí)間分別為1.55 min、0.96 min和1.80 min。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限的考察

取空白血漿50 μL，加入烏苯美司和甲氨蝶呤標(biāo)準(zhǔn)系列溶液50 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，配制成相當(dāng)于血漿濃度為2.00、5.00、20.00、50.00、200.00、500.00、2000.00 ng/mL的血漿樣品，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，每一濃度進(jìn)行三樣本分析，取10 μL進(jìn)樣分析。以待測物濃度為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)（w=1/x2）最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的回歸方程分別為Y1=0.00109c2+0.00173（r=0.9981）、Y2=0.00116c3+0.00378（r=0.9978）。結(jié)果表明，烏苯美司和甲氨蝶呤在2.00～2000.00 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。取空白血漿50 μL，加入4.00 ng/mL 烏苯美司標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，配制成相當(dāng)于血漿濃度為2.00 ng/mL，在方法確證首天對該樣品進(jìn)行6樣本分析，求出烏苯美司和甲氨蝶呤的日內(nèi)精密度（RSD）為3.24和1.97，準(zhǔn)確度（RE）為-2.5和-2.0。烏苯美司和甲氨蝶呤的定量下限是2.00 ng/ mL（見圖2B）。

2.6精密度與準(zhǔn)確度的考察

取大鼠空白血漿50 μL，配制低、中、高三個濃度（烏苯美司和甲氨蝶呤血漿濃度為4.00，50.00和1000.00 ng/mL）的質(zhì)量控制（QC）樣品，進(jìn)行6樣本分析，連續(xù)3 d測定，根據(jù)當(dāng)天所配置的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算質(zhì)量控制樣品濃度，并進(jìn)行方差分析，得出準(zhǔn)確度和精密度（表1）。以上結(jié)果表明，對于檢測生物樣品中烏苯美司和甲氨蝶呤的方法均精密、準(zhǔn)確，符合有關(guān)國際規(guī)范的要求。

2.7 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)的考察

烏苯美司和甲氨蝶呤質(zhì)控樣品按“2.3”項(xiàng)下方法操作。進(jìn)樣得峰面積 A1；50 μL空白血漿加入 50 μL甲醇和200 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋，14 000 r/min離心 10 min，取上清，氮?dú)獯蹈桑尤肓鲃酉嗯渲频臑醣矫浪竞图装钡蕽舛葹?.00、50.00和1000.00 ng/mL 的對照品溶液，混勻離心后取上清進(jìn)樣，得峰面積 A2；流動相配制的烏苯美司和甲氨蝶呤濃度為4.00，50.00和1000.00 ng/mL 的對照品溶液，進(jìn)樣得峰面積 A3。每個濃度平行做平行6樣本分析。以A1/A2×100%計(jì)算得烏苯美司和甲氨蝶呤的提取回收率，以A2/A3×100%計(jì)算得到基質(zhì)效應(yīng)。低、中、高濃度質(zhì)控樣品的提取回收率均>94.53%，基質(zhì)效應(yīng)在 93.45% ～ 97.27%范圍內(nèi)，符合生物樣品的分析要求（表 2）。

2.8 樣品的穩(wěn)定性考察

將烏苯美司和甲氨蝶呤的大鼠血漿樣品置于室溫2 h，處理后的烏苯美司和甲氨蝶呤的血漿樣品置于室溫24 h，經(jīng)歷3次冷凍-解凍循環(huán)以及血漿樣品-20℃冷凍15 d，考察其穩(wěn)定性。穩(wěn)定性考察時(shí)，取大鼠空白血漿50 μL，按“2.3”項(xiàng)配制出烏苯美司和甲氨蝶呤的血漿樣品，包含低、高兩個濃度（血漿濃度分別為4.00和1000.00 ng/mL），每一種濃度水平的每一種穩(wěn)定性考察進(jìn)行三樣本分析，采用LC-MS/MS法測定。結(jié)果表明烏苯美司和甲氨蝶呤的血漿樣品室溫放置2 h穩(wěn)定（RSD<4.3）；處理后樣品室溫放置24 h穩(wěn)定（RSD<6.2）；經(jīng)歷3次冷凍-解凍循環(huán)穩(wěn)定（RSD<8.4）；血液樣品-20℃冷凍15 d穩(wěn)定（RSD<6.8）。

2.9 烏苯美司和甲氨蝶呤的大鼠體內(nèi)胃腸道吸收的相互作用

實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食過夜（不禁水）。戊巴比妥麻醉后，分別用大鼠灌胃器灌胃給藥，然后在規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行頸靜脈取血。實(shí)驗(yàn)分組及給藥劑量如下：（1）烏苯美司（4 mg/kg，對照組）；（2）甲氨蝶呤（5 mg/kg，對照組）；（3）烏苯美司（4 mg/kg）+甲氨蝶呤（5 mg/kg）。在特定時(shí)間時(shí)測定烏苯美司和甲氨蝶呤的大鼠血藥濃度-時(shí)間曲線（圖3A、B）與藥代動力學(xué)參數(shù)（表 3）。

3討論

本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS/MS法測定，其靈敏度好，準(zhǔn)確度高；用MRM掃描方式，專屬性強(qiáng)；采用氮?dú)鈸]干的方法，不僅有效的將干擾組分排除，還是樣品濃縮，大大增強(qiáng)烏苯美司和甲氨蝶呤痕量分析物的檢出能力。本實(shí)驗(yàn)建立了快速、靈敏、高效的LC-MS/MS分析法，同時(shí)測定生物樣品中的烏苯美司和甲氨蝶呤。此分析方法的定量下限均可達(dá)2.00 ng/mL，并根據(jù)大鼠灌胃給藥后兩藥的的血藥濃度變化分析藥物相互作用。

臨床上當(dāng)同為P-gp和OATs底物的抗癌藥物甲氨蝶呤和烏苯美司合用時(shí)，是否會發(fā)生由藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體所介導(dǎo)的藥物相互作用有待研究[13-15]。基于這一構(gòu)想，開展了本次實(shí)驗(yàn)研究。對藥代動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，甲氨蝶呤和烏苯美司同時(shí)灌胃給藥與單獨(dú)給藥組相比，二者的血藥濃度均升高，AUC分別由（38.40±0.70） min·μg/mL增加到（213.00±28.00） min·μg/mL（甲氨蝶呤）和（820.00±60.00）min·μg/mL增加到（1170.00±110.00） min·μg/mL（烏苯美司），二者的血漿清除率均顯著下降（圖 3A、B，表 3），提示同時(shí)給藥后，二者在腸道吸收過程中存在相互影響，導(dǎo)致彼此進(jìn)入血中的藥物濃度增加，證明了二者在胃腸道存在相互作用的靶點(diǎn)，為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)藥物代謝與排泄的臨床合理用藥提供參考。

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（收稿日期：2016-08-28）