金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷干預去卵巢大鼠CIA的機制研究

李 丹，艾 浩，李曉明

（1錦州市婦嬰醫(yī)院產(chǎn)科，2錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，3遼寧省卵泡發(fā)育與生殖健康重點實驗室，4錦州醫(yī)科大學組織胚胎學教研室，遼寧錦州121001）

金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷干預去卵巢大鼠CIA的機制研究

李 丹1，艾 浩2，3，李曉明3，4

（1錦州市婦嬰醫(yī)院產(chǎn)科，2錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，3遼寧省卵泡發(fā)育與生殖健康重點實驗室，4錦州醫(yī)科大學組織胚胎學教研室，遼寧錦州121001）

目的：以去卵巢大鼠疊加Ⅱ型膠原誘導的類風濕關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）為實驗材料，觀察金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷的療效及初步藥理機制，為針對絕經(jīng)后女性類風濕關(guān)節(jié)炎的治療提供理論支持及實驗證據(jù).方法：采用通用的手術(shù)法摘除大鼠卵巢，采用牛Ⅱ型膠原二次免疫的方法制備類風濕關(guān)節(jié)炎動物模型（CIA），觀察金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷治療雌激素低下型CIA的影響，同時與陽性藥甲氨喋呤比較，評價該組合藥物的藥效.結(jié)果：與模型組比較，金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷組能較好地改善去卵巢CIA大鼠的關(guān)節(jié)腫脹及活動能力，大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)及關(guān)節(jié)腫脹度均顯著下降，關(guān)節(jié)組織病理程度得到明顯改善.金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷組大鼠血清中TNF-α及IL-6水平顯著降低（P＜0.05），而IL-10水平呈顯著升高趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷組大鼠外周血CD4+T細胞數(shù)量／比例顯著減少（P＜0.01）.結(jié)論：雌激素低下狀態(tài)可誘導CIA的發(fā)生并加劇CIA的病理程度.補充植物雌激素可顯著提高現(xiàn)有抗RA的藥效.

金雀異黃素；雷公藤多苷；去卵巢大鼠；類風濕關(guān)節(jié)炎

0 引言

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性侵蝕性關(guān)節(jié)炎為特征的全身性自身免疫性疾病［1］，絕經(jīng)期后女性RA發(fā)病率明顯增高［2］，但臨床缺乏有效控制絕經(jīng)期后女性RA病情發(fā)展的治療方案［3］.金雀異黃素通過免疫調(diào)節(jié)作用可顯著改善膠原誘導的類風濕關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠的關(guān)節(jié)病理狀態(tài)，有望成為改善自身免疫性疾病的補充用藥［4］.本研究以去卵巢大鼠疊加Ⅱ型膠原誘導的類風濕關(guān)節(jié)炎為實驗材料，旨在探討金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷的療效及初步藥理機制，為絕經(jīng)后女性類風濕關(guān)節(jié)炎的治療提供可借鑒思路.

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器金雀異黃素購自西安冠宇生物技術(shù)有限公司（含量≥98%），雷公藤多苷購自江蘇美通制藥有限公司（Z32021007），甲氨喋呤購自上海醫(yī)藥（集團）有限公司信宜制藥總廠，牛Ⅱ型膠原、不完全弗氏佐劑、anti-collagenⅡ一抗均購自Chondrex公司（美國），大鼠TNF-α及大鼠IL-6、IL-10酶聯(lián)免疫試劑盒購自Bender公司（美國）；大鼠皮質(zhì)酮酶聯(lián)免疫試劑盒（EIA-4164）購自德國DRG公司（批號: 61k059），PE-anti-Rat CD3（Clone G4.18）、FITC-anti-Rat CD4（Clone OX35）及FITC-anti-Rat CD8（Clone OX8）流式細胞術(shù)用熒光抗體為eBioscience公司產(chǎn)品.T10 BASIC手持式分散機（德國IKA），Leica-Qwin圖像分析系統(tǒng)（德國Leica公司），K15離心機（德國Sigma），OLYMPUS AU640型全自動生化分析儀（日本OLYMPUS公司），Beckman Gallios型流式細胞儀（美國Beckman公司）.

1.2 實驗動物健康雌性SD大鼠，體質(zhì)量（150± 10）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物飼養(yǎng)證號:SCKK-2005-0004.清潔級動物室適應性喂養(yǎng)1周后進行分組和處理.普通飼料正常飼喂、自由飲水.

1.3 實驗方法

1.3.1 去卵巢疊加CIA大鼠模型制備及評價 參照文獻方法［5］手術(shù)摘除雙側(cè)卵巢，切除手術(shù)第28天，制備大鼠CIA模型［6］:牛Ⅱ型膠原（2 g／L）與等容積不完全弗氏佐劑混合、乳化處理（終濃度1 g／L），以0.2 mL／只（200 μg）于大鼠尾根部皮下注射，初次免疫大鼠.7 d后以0.1 mL／只（100 μg）于大鼠尾根行加強免疫.每隔一天測量關(guān)節(jié)炎指數(shù)和足趾腫脹度，評估CIA形成情況.參照5級評分法計算關(guān)節(jié)炎指數(shù)［7］.關(guān)節(jié)腫脹度測量法［8］，采用足趾容積測量儀測量踝關(guān)節(jié)的容積，計算關(guān)節(jié)腫脹度.

1.3.2 實驗動物分組及給藥方法 實驗動物隨機分為四組，即假手術(shù)組（n=10）、去卵巢CIA組（簡稱模型組，n=10）、甲氨喋呤治療組（陽性藥物對照，n=10）及金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷治療組（n=10）.治療組動物于加強免疫之日起開始灌胃，給予甲氨喋呤（2.7 mg／kg體質(zhì)量）、雷公藤多苷（70 mg／kg體質(zhì)量）和金雀異黃素（30 mg／kg體質(zhì)量）進行干預（1次／d），連續(xù)干預3周.假手術(shù)組及模型組大鼠灌胃給予等量的蒸餾水.

1.3.3 大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-10水平檢測依照ELISA試劑盒說明書的步驟操作，對大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-10的水平進行測定，在酶標儀上用450 nm波長測OD值、計算anti-collagenⅡ、TNF-α、IL-6及IL-10水平.

1.3.4 大鼠外周血CD4+及CD8+細胞亞型分析 大鼠外周血CD4+及CD8+亞型分析采用流式細胞術(shù)，樣品制備方法如下.大鼠麻醉后經(jīng)腹主動脈采血（抗凝處理），收集1×106／mL細胞至3個1.5 mL EP管中，每管1 mL；用PBS洗液洗3次，重懸細胞至100 μL PBS洗液中；管中分別加入FITC-CD3和PE-CD4，F(xiàn)ITC-CD3和PEcy5-CD8，以及同型對照抗體，4℃避光孵育30 min；用PBS洗液洗3次，棄上清，細胞用500 uL含1%多聚甲醛的PBS重懸，置4℃避光保存待測.

1.3.5 關(guān)節(jié)組織病理學檢測 大鼠踝關(guān)節(jié)經(jīng)10%福爾馬林固定7 d后，采用福爾馬林／硝酸脫鈣液（Clayden氏液）脫鈣、常規(guī)石蠟包埋，HE染色.依據(jù)通用病理評分標準對關(guān)節(jié)病理損傷做半定量分析.

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-Way ANOVA）和LSD檢驗作組間比較，計量資料用s表示，組間比較用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 行為學觀察結(jié)果行為學觀察結(jié)果提示，去卵巢大鼠可被誘發(fā)較嚴重的關(guān)節(jié)炎病理改變.甲氨喋呤治療組和金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷治療組大鼠關(guān)節(jié)紅腫狀態(tài)明顯減輕，活動相對增多.與甲氨喋呤治療組比較，金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷治療組大鼠體毛光澤度好，肛周污穢物顯著減少，表明補充植物雌激素能較好地改善雌激素低下型CIA的病理過程.

2.2 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度和關(guān)節(jié)炎評分結(jié)果比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度及關(guān)節(jié)炎評分均顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）.與模型組比較，甲氨喋呤及金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷治療組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度及關(guān)節(jié)炎評分均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1）.

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度和關(guān)節(jié)炎評分結(jié)果比較（n=10，±s）

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度和關(guān)節(jié)炎評分結(jié)果比較（n=10，±s）

bP＜0.01 vs假手術(shù)組；aP＜0.05 vs模型組；dP＜0.01 vs模型組.

組別關(guān)節(jié)腫脹度（%）關(guān)節(jié)炎評分假手術(shù)組15.20±5.800.10±0.05模型組60.50±17.40b2.38±0.48b甲氨喋呤治療組49.60±23.20d2.00±0.33a金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷組47.80±20.80d1.95±0.37d

2.3 關(guān)節(jié)組織病理學檢測結(jié)果正常大鼠踝關(guān)節(jié)腔、關(guān)節(jié)軟骨及滑膜組織結(jié)構(gòu)完整、清晰.去卵巢CIA大鼠膝、踝關(guān)節(jié)可見明顯的滑膜細胞增生，排列紊亂，滑膜組織充血水腫，毛細血管增生，并可見炎細胞浸潤，增生的滑膜組織形成絨毛狀，可伸向關(guān)節(jié)腔深處，或向軟骨面爬行形成血管翳.

2.4 各組大鼠血清中TNF-α水平檢測結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中TNF-α水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，甲氨喋呤和金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷治療組大鼠血清中TNF-α水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01，表2）.

表2 各組大鼠血清中TNF-α水平檢測結(jié)果比較（n=10，±s）

表2 各組大鼠血清中TNF-α水平檢測結(jié)果比較（n=10，±s）

bP＜0.01 vs假手術(shù)組；aP＜0.05 vs模型組；dP＜0.01 vs模型組.

組別T N F -α（n g／m L）假手術(shù)組1 9.5 0 ± 2.8 4模型組4 7.9 0 ± 9.8 1b甲氨喋呤治療組4 1.1 0 ± 9.3 2a金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷組3 6.7 0 ± 7.7 6d

2.5 各組大鼠血清中IL-6和IL-10水平檢測結(jié)果比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠模型血清中IL-6和IL-10的水平均顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與模型組比較，甲氨喋呤治療組IL-6和IL-10水平顯著下降，金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷治療組大鼠血清中IL-6水平顯著下降，而IL-10水平顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表3）.

表3 各組大鼠血清IL-6及IL-10水平檢測結(jié)果比較（n=10，±s）

表3 各組大鼠血清IL-6及IL-10水平檢測結(jié)果比較（n=10，±s）

bP＜0.05 vs假手術(shù)組；aP＜0.05 vs模型組；dP＜0.01 vs模型組.

組別IL-6IL-10假手術(shù)組40.21±5.7421.04±3.27模型組68.37±5.99b54.38±10.15b甲氨喋呤治療組52.16±7.99a46.76±5.39a金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷組47.77±6.18a71.36±7.99d

2.6 各組大鼠外周血CD4+、CD8+亞型檢測結(jié)果比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中CD4+T細胞數(shù)量顯著增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而CD8+T細胞數(shù)量沒有明顯改變.與模型組比較，甲氨喋呤及金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷治療組大鼠外周血CD4+和CD8+T細胞數(shù)量均顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表4、圖1）.

表4 各組大鼠外周血中T細胞亞群檢測結(jié)果比較（n=10，±s）

表4 各組大鼠外周血中T細胞亞群檢測結(jié)果比較（n=10，±s）

aP＜0.05 vs假手術(shù)組；cP＜0.05 vs模型組.

組別CD4+CD8+假手術(shù)組21.91±3.243.05±1.27模型組36.10±5.12a4.76±2.15甲氨喋呤治療組26.10±3.73c1.65±0.39c金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷組24.10±2.57c1.06±0.99c

圖2 大鼠外周血CD4+、CD8+細胞亞型檢測結(jié)果

3 討論

RA發(fā)病多見于女性［9］，女性在絕經(jīng)前發(fā)病率平穩(wěn)，口服避孕藥或給予雌激素替代治療對RA病情的穩(wěn)定有明顯促進作用［10］.絕經(jīng)后發(fā)病率明顯升高，提示雌激素與RA發(fā)病之間可能存在關(guān)聯(lián)［11-13］.本研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢大鼠由于缺少雌激素的生理調(diào)節(jié)作用，對Ⅱ型膠原誘發(fā)的CIA非常敏感.補充植物雌激素（金雀異黃素）能顯著提高臨床常規(guī)抗類風濕藥物的療效.雷公藤多苷與甲氨喋呤的藥理機制類似［14］，主要通過免疫調(diào)節(jié)、抗炎等發(fā)揮抗RA的作用.然而，因其副反應及成分復雜、藥理作用未徹底明了等因素，臨床上并未得到廣泛應用.本研究將有植物雌激素作用的天然異黃酮化合物金雀異黃素與雷公藤多苷配伍使用，以期為臨床雌激素低下型RA的治療提供新的組合藥物.結(jié)果顯示，去卵巢CIA大鼠血清中TNF-α水平顯著升高，而金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷治療組大鼠血清中TNF-α水平顯著降低，提示雌激素低下狀態(tài)可激活TNF-α相關(guān)信號通路，誘導其高表達.補充植物雌激素可通過調(diào)節(jié)TNF-α表達及相關(guān)分子事件提高現(xiàn)有抗RA藥物的療效.模型大鼠血清中IL-6和IL-10水平均顯著增高，提示機體內(nèi)存在炎性反應，IL-10水平升高則可能與機體的骨髓吸收的自我保護機能有關(guān)［15］.本研究觀察到金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷治療組大鼠血清中IL-6水平顯著下降，而IL-10水平顯著增高，提示其可能的藥理機制包含通過調(diào)節(jié)IL-6／IL-10的平衡而減輕關(guān)節(jié)炎癥反應，從而改善關(guān)節(jié)癥狀.

綜上所述，金雀異黃素協(xié)同雷公藤多苷對去卵巢CIA具有較為肯定的療效，在改善部分指標上優(yōu)于甲氨喋呤，表明補充植物雌激素可顯著提高現(xiàn)有抗RA的藥效.其藥理機制可能為:下調(diào)促炎性因子（TNF-α、IL-6）并上調(diào)抑制炎癥細胞因子（IL-10）的水平，從而發(fā)揮抗炎作用.此外，通過抑制CD4+T細胞的分化，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用.

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Research on mechanisms of genistein combined with triptergium glycosides intervention on collagen induced arthritis（CIA）of ovariectomized rats

LI Dan1，AI Hao2，3，LI Xiao-Ming3，4
1Department of Obstetrics，Women and Infants's Hospital of Jinzhou，2The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University，3Liaoning Key Laboratory of Follicular Development and Reproductive Health，4Department of Histology and Embryology，Jinzhou Medical University，Jinzhou 121001，China

AIM:Rheumatoid arthritis to superposition of ovariectomized rats with collagen induced II（collagen induced arthritis，CIA）were selected as experimental materials，and the synergistic effectandpreliminarypharmacologicalmechanismof tripterygium glycosides and genistein were observed，to provide theoretical support and experimental evidence for treatment of postmenopausal women with rheumatoid arthritis.METHODS:The rats were ovariectomized using general surgery method.The animal model of rheumatoid arthritis（CIA）was prepared using the method of secondary immune response of bovine type II collagen.The effect of genistein combined with tripterygium glycosides for the treatment of estrogen deficiency type CIA was observed，at the same time，the effect was compared with positive drug methotrexate，the curative effect of the combination of drugs was also evaluated.RESULTS:Compared with the model group，genistein combined with tripterygium glycosides group could better improve joint swelling and activity of ovariectomized CIA rats，and rat arthritis index and swelling degree were significantly decreased，the pathological degree of joint tissue was also obviously improved.The TNF-alpha and IL-6 level in the serum of rats of genistein combined with tripterygium glycosides group were significantly decreased，with statistically significant differences（P＜0.05），and the level of IL-10 was significantly increased，with a statistically significant difference（P＜0.05）；The number or the ratio of peripheral blood CD4+T cell in genistein combined with tripterygium glycosides group rats was significantly reduced，with a statistically significant difference（P＜0.01）.CONCLUSION:Estrogen deficiency can induce the occurrence of CIA and aggravate the pathological degree of CIA.Supplement of plant estrogen can significantly improve the effectiveness of the existing anti-RA.

Genistein；tripterygium glycosides；ovariectomized rats；rheumatoid arthritis

R285.5

A

2095-6894（2017）01-35-04

2016-10-16；接受日期：2016-11-02

遼寧省高等學校優(yōu)秀人才支持項目（LJQ2013092）

李 丹.碩士，主治醫(yī)師.研究方向:婦科生殖內(nèi)分泌.E-mail:76936074＠qq.com

李曉明.E-mail:lixiaoming68327＠163.com