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    腺病毒介導(dǎo)的Dectin-1基因小鼠呼吸道表達(dá)模型的構(gòu)建和評價

    2017-03-02 07:18:24劉志成孫文逵
    關(guān)鍵詞:小鼠研究

    錢 倩,劉志成,孫文逵,施 毅

    (1東南大學(xué)附屬南京市胸科醫(yī)院,江蘇南京210029;2廣東省惠州市中心人民醫(yī)院,廣東惠州516001;3南京總醫(yī)院呼吸內(nèi)科,南京大學(xué)呼吸病研究所,江蘇南京210002;4南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,江蘇南京210029)

    ·基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·

    腺病毒介導(dǎo)的Dectin-1基因小鼠呼吸道表達(dá)模型的構(gòu)建和評價

    錢 倩1,劉志成2,3,孫文逵3,4,施 毅3

    (1東南大學(xué)附屬南京市胸科醫(yī)院,江蘇南京210029;2廣東省惠州市中心人民醫(yī)院,廣東惠州516001;3南京總醫(yī)院呼吸內(nèi)科,南京大學(xué)呼吸病研究所,江蘇南京210002;4南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,江蘇南京210029)

    目的:研究采用氣管內(nèi)注射給予Dectin-1重組腺病毒的方法建立氣道Dectin-1上調(diào)表達(dá)小鼠模型,并進(jìn)行模型驗證和安全性評價.方法:BALB/c小鼠分為PBS組、Ad-EGFP(recombinant adenovirus encoding EGFR)組、Ad-mDectin-1(recombinant adenovirus encoding murine Dectin-1)組,經(jīng)氣管給予PBS、Ad-EGFP、Ad-mDectin-1.通過real-time PCR、免疫組化等方法動態(tài)評估肺組織Dectin-1表達(dá)變化.通過ELISA檢測肺組織勻漿及血液中IL-6水平,激光共聚焦檢測腺病毒載體在肺組織及肝臟的分布.結(jié)果:氣管內(nèi)給藥后,在第3天可以觀察到Ad-mDectin-1組小鼠肺組織Dectin-1 mRNA水平約為PBS組、Ad-EGFP組的18倍.Ad-mDectin-1組與對照組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).給藥后第3、5、7、14天,Ad-mDectin-1組免疫組化見Dectin-1主要定位于細(xì)支氣管.隨時間推移,Dectin-1水平逐漸增高,第5天達(dá)高峰,第14天氣道上皮細(xì)胞仍有Dectin-1表達(dá).給藥后第3天,激光共聚焦顯微鏡觀察Ad-mDectin-1顯示在肺組織中Ad-mDectin-1組及Ad-EGFP組可見綠色熒光,而PBS組未見綠色熒光.在肝臟組織中,各組均無綠色熒光蛋白表達(dá).肺組織及血清中IL-6水平檢測示各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).結(jié)論:通過氣管內(nèi)給予Ad-mDectin-1成功上調(diào)小鼠肺組織Dectin-1水平,Dectin-1主要表達(dá)于細(xì)支氣管上皮細(xì)胞,表達(dá)高峰在第5天,可持續(xù)2周以上.另外,經(jīng)氣管給予Ad-mDectin-1對小鼠生存和活動無明顯影響,無明顯炎癥反應(yīng)及遠(yuǎn)隔器官肝臟的播散.

    Dectin-1;腺病毒載體;基因治療;侵襲性肺曲霉?。惶烊幻庖?/p>

    0 引言

    近年來,隨著免疫抑制人群的增加,侵襲性曲霉?。╥nvasive aspergillosis,IA)的發(fā)病率呈上升趨勢[1].即使通過不斷改進(jìn)的檢測手段早期診斷,采取預(yù)防性治療和經(jīng)驗性治療等措施,其死亡率仍高達(dá)50%~90%[1].宿主天然免疫在抗真菌感染中的作用和機制受到了廣泛重視[2].模式識別作用是抗真菌天然免疫的始動環(huán)節(jié),而模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)是天然免疫應(yīng)答的始動點.通過調(diào)節(jié)PRRs的表達(dá),干預(yù)宿主天然免疫狀態(tài),成為曲霉防治的突破點.樹突狀細(xì)胞相關(guān)C型凝集素-1(dendritic cell-associated C-type lectin-1,Dectin-1)是重要的PRRs,通過識別真菌細(xì)胞壁的β-1,3葡聚糖,在抗真菌免疫過程中發(fā)揮重要作用,參與介導(dǎo)免疫細(xì)胞對曲霉的識別和吞噬[3].既往研究表明,巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中添加Dectin-1胞外區(qū)蛋白能顯著增強其殺滅曲霉的能力[4].小鼠體內(nèi)試驗也提示,經(jīng)尾靜脈注射表達(dá)Dectin-1胞外區(qū)蛋白的重組腺病毒能提高小鼠煙曲霉感染生存率[4-5].隨著關(guān)于基因治療的動物及臨床試驗深入研究,基因治療在疾病治療方面的應(yīng)用得到廣泛關(guān)注[6].目前基因治療的載體分為病毒載體和非病毒載體,腺病毒載體可以轉(zhuǎn)染非分裂期細(xì)胞,遺傳毒性低,對肺組織具有親嗜性,因此廣泛應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)疾病基因治療的研究[7].課題組前期研究,構(gòu)建了包含小鼠6號染色體上CLEC7A基因的6個外顯子中的編碼區(qū)(coding sequence,CDS)735 bp堿基的重組腺病毒載體(adenovirus,ad),并進(jìn)行鑒定及純化[8].并在體外實驗,通過Dectin-1高表達(dá)的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞模型,驗證了該腺病毒載體在煙曲霉感染中的保護(hù)性作用[9].研究擬進(jìn)一步在小鼠體內(nèi)實驗通過氣道內(nèi)滴入給藥的方式,探索短期提高和強化宿主的氣道上皮細(xì)胞和專職免疫細(xì)胞天然免疫功能的方法,初步探究有效的基因治療途徑,為未來的應(yīng)用研究奠定理論基礎(chǔ).

    1 材料和方法

    1.1 實驗分組及給藥方式腺病毒的制備及純化同前.實驗分組:BALB/c小鼠分為PBS組,腺病毒空載體對照組(Ad-EGFP),腺病毒實驗組(Ad-mDectin-1).PBS組給予30 μL PBS溶液;Ad-EGFP對照組給予30 μL Ad-EGFP;Ad-mDectin-1組給予30 μL AdmDectin-1,病毒液滴度為3×108PFU.實驗中各組小鼠麻醉后,經(jīng)頸部暴露氣管,使用微量注射器經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙穿刺并注入藥物,注射后立即將小鼠直立旋轉(zhuǎn),盡量使藥物均勻分布于兩肺,并將小鼠直立固定30 min后在原飼養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)飼養(yǎng).

    1.2 標(biāo)本收集實驗各組小鼠氣道內(nèi)注射給藥后第3天,摘除眼球收集血液置于EP管中常溫靜置1 h,然后4℃1500 g×10 min離心,收集血清,分裝保存于-80℃;右下肺4%多聚甲醛固定,進(jìn)行HE染色及免疫組化;左肺置于無酶的凍存管中,-80℃保存,用于提取RNA;右肺上葉及肝臟OCT包埋,用于制作冰凍切片;右肺中葉置于EP管內(nèi)-80℃保存,用于ELISA檢測.

    1.3 HE染色方法肺組織固定,組織蠟塊包埋后切片,厚度為5 μm.將組織切片進(jìn)行HE染色,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片.

    1.4 免疫組化石蠟切片經(jīng)烤片、脫蠟脫水、抗原修復(fù)、沖洗、封閉.加入兔抗小鼠Dectin-1抗體(1∶200)37℃孵育1 h,二抗孵育后,進(jìn)行DAB顯色,終止反應(yīng).經(jīng)脫水、透明、封片鏡檢.每張切片拍攝3張含支氣管的圖片,用Image ProPlus 6.0軟件分析,計算每個的支氣管壁積分光密度(integrity optical density,IOD),同時計算其面積,從而獲得其平均光密度.每個將3個視野平均光密度值的平均值作為本張切片的最終值.

    1.5 Real-Time PCR檢測肺組織Dectin-1水平肺組織經(jīng)液氮研磨、裂解、萃取等步驟提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并進(jìn)行RealTime PCR反應(yīng),操作按試劑盒說明書進(jìn)行.

    所用到的引物序列如下:Dectin-1上游引物5'-TTCAGCACTCAAGACATCCATAA-3',下游引物5'-CAGCAACCACTACTACCACAAAG-3';β-actin上游引物5'-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3',下游引物5'-TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG-3'.反應(yīng)條件如下,95℃預(yù)變性30 s,95℃5 s,60℃30 s,40個循環(huán).反應(yīng)體系在Real-Time PCR儀上進(jìn)行擴增.采用2-△△CT法計算出每個樣本目的基因的相對表達(dá)量.

    1.6 ELISA檢測肺組織及血清中IL-6水平肺組織及血清中細(xì)胞因子IL-6的含量根據(jù)試劑盒的說明書逐步進(jìn)行.

    1.8 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析,實驗結(jié)果以±s表示,組間比較采用LSD-t檢驗法,各組方差不齊則采用Tamhane's T2檢驗.以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

    2 結(jié)果

    2.1 Ad-mDectin-1氣管滴入后小鼠肺組織Dectin-1表達(dá)變化

    2.1.1 肺組織Dectin-1 RNA表達(dá)變化 經(jīng)氣管內(nèi)給予Ad-mDectin-1第3天.Real-Time PCR結(jié)果示Ad-mDectin-1組小鼠肺組織Dectin-1 mRNA水平(88.092±14.047)顯著高于PBS對照組(4.798±1.720)及Ad-EGFP對照組(5.259±0.844),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖1).

    圖1 肺組織Dectin-1 mRNA Real-Time PCR檢測結(jié)果

    2.1.2 肺組織Dectin-1蛋白表達(dá)變化 經(jīng)氣管給藥后第3、5、7、14天進(jìn)行肺組織免疫組化染色.Ad-mDectin-1組可見Dectin-1主要定位于細(xì)支氣管,棕黃色陽性顆粒位于胞漿及胞膜.而肺泡上皮未發(fā)現(xiàn)明顯陽性顆粒沉著.PBS對照組及Ad-EGFP對照組均未見肺氣道上皮細(xì)胞有棕黃色陽性顆粒沉著.另外,Ad-mDectin-1組Dectin-1水平逐漸增高,在第5天達(dá)高峰,第14天氣道上皮細(xì)胞仍有Dectin-1表達(dá)(圖2A).Image Pro Plus 6.0軟件分析Ad-mDectin-1組肺組織Dectin-1平均光密度發(fā)現(xiàn),平均光密度值從第3天開始上升,并在第5天達(dá)高峰,第14天明顯下降(圖2B).

    圖2 肺組織Dectin-1蛋白表達(dá)觀察

    2.2 經(jīng)氣管給予Ad-mDectin-1安全性評價

    2.2.1 小鼠一般情況和肺組織組織學(xué)觀察 實驗組和對照組給藥后出現(xiàn)不同程度的活動減少,對刺激反應(yīng)下降.給藥1天后恢復(fù)正常,各組均未出現(xiàn)體質(zhì)量、進(jìn)食、活動等異常,也未出現(xiàn)死亡.

    給藥后肺組織HE染色顯示,第3天以氣道旁多核粒細(xì)胞及單核細(xì)胞輕微浸潤為主,第7天開始出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤,并形成濾泡樣集聚,未見明顯肺上皮細(xì)胞壞死及肺組織結(jié)構(gòu)改變(圖3).

    圖3 肺組織病理HE染色結(jié)果(×100)

    2.2.2 Ad-mDectin-1肝臟分布情況評價 轉(zhuǎn)染Ad-mDectin-1和Ad-EGFP后,細(xì)胞均表達(dá)綠色熒光蛋白,可通過激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)評價Ad-mDectin-1在肝臟的分布情況,間接評價腺病毒載體在全身的播散情況.結(jié)果顯示,在肝臟組織中兩組均未發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白表達(dá),說明該病毒載體經(jīng)氣管給藥后,局限分布在肺組織內(nèi),尚未發(fā)現(xiàn)播散證據(jù)(圖4).

    我們此次需要完成的是2048游戲的AI,即只通過算法進(jìn)行方向移動,在不經(jīng)過任何人為干預(yù)的情況下獲取游戲勝利。算法優(yōu)劣的評判標(biāo)準(zhǔn)有三個:一是游戲勝率評估,即超過2048的概率要盡可能大;二是最高分評估,即游戲中所獲取的最大值要盡可能大;三是等待時間,即每步之間等待時間不能過長。

    圖4 肝臟組織熒光蛋白表達(dá)觀察(×200)

    2.2.3 肺組織及血清中IL-6表達(dá)評價 通過ELISA方法檢測肺組織及血清中IL-6水平,評價腺病毒載體對于小鼠全身及肺組織局部炎癥影響.檢測氣管給藥后第3天肺組織及血清中IL-6水平,Ad-mDectin-1組IL-6(1607.362±255.924 pg/mL)與PBS組(1428.544±308.359 pg/mL)及Ad-EGFP組(1523.526±286.101pg/mL)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Ad-mDectin-1組vs PBS組,P=0.875;Ad-mDectin-1組vs Ad-EGFP組,P=0.598)(圖5).

    圖5 ELISA檢測肺組織及血清中IL-6表達(dá)水平

    3 討論

    基因治療是目前藥物研發(fā)的熱點之一,通過針對目標(biāo)細(xì)胞導(dǎo)入外源基因,達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的.由于免疫抑制劑及免疫調(diào)節(jié)劑的使用,侵襲性曲霉病的發(fā)病率逐年增加,在免疫缺陷及造血干細(xì)胞移植的患者中,病死率更是居高不下[10].抗真菌藥物的預(yù)防性治療和經(jīng)驗性治療效果不佳.先天和后天免疫異常導(dǎo)致宿主免疫系統(tǒng)不能有效識別和控制曲霉感染[11].因此,從調(diào)控機體免疫功能入手,可能為IA治療提供新策略.

    基因載體的選擇是重要環(huán)節(jié),腺病毒是當(dāng)前較常選用的載體系統(tǒng)[12-13].腺病毒載體已發(fā)展至第三代輔助病毒依賴型腺病毒載(helper-dependent adenovirus),此類腺病毒載體只保留了最小數(shù)量的順式作用元件,能夠留出更多空間裝載外源基因及其表達(dá)所需的調(diào)控序列,因其缺失了全部或大部分腺病毒基因,極大地降低了前兩代腺病毒所具有的細(xì)胞毒性,延長了外源基因的表達(dá)時間[14].以往研究證實腺病毒載體十分適合肺部基因治療,已廣泛應(yīng)用于癌癥及感染模型的實驗研究中[15-17].有報道通過支氣管鏡給予Ad-P53治療支氣管肺泡癌的臨床研究,并取得較好效果[18].本部分研究正是利用第三代輔助病毒依賴型腺病毒載體構(gòu)建的重組腺病毒Ad-Dectin-1構(gòu)建局部給藥的小鼠模型.

    Dectin-1作為一種機體免疫細(xì)胞識別真菌的主要模式識別受體,在機體對曲霉等真菌的吞噬及殺滅過程中發(fā)揮重要作用[19-20].既往已有研究構(gòu)建表達(dá)Dectin-1的載體,用于真菌感染的早期診斷和防治.有研究使用非穩(wěn)定性二氫葉酸還原酶表達(dá)載體,構(gòu)建表達(dá)Dectin-1胞外區(qū)可溶性蛋白的重組載體,用于檢測真菌細(xì)胞壁的β-葡聚糖[21].Mattila等[4]首次嘗試?yán)孟俨《据d體構(gòu)建表達(dá)帶有小鼠IgG1Fc段和Dectin-1胞外區(qū)的重組腺病毒,通過體內(nèi)外實驗證實Dectin-1表達(dá)增加在抗真菌感染過程中具有積極作用.既往研究通過尾靜脈注射Ad-Dectin-1-Fc(recombinant adenovirus encoding Dectin-1-Fc)能夠提高小鼠煙曲霉感染生存率,降低肺組織真菌負(fù)荷[4].本研究通過局部使用Dectin-1重組腺病毒載體,上調(diào)氣道上皮細(xì)胞Dectin-1表達(dá),從而達(dá)到調(diào)控機體抗曲霉免疫的目標(biāo).

    載體的投送途徑是基因治療的重要環(huán)節(jié).在小鼠模型中,腺病毒載體投送至肺部主要有4種途徑:①經(jīng)鼻滴入:優(yōu)點是創(chuàng)傷小,操作簡單.但存在病毒丟失,投送效率較低,無法判斷進(jìn)入肺部病毒量等缺點.②經(jīng)口氣管途徑:相對于滴鼻,可減少病毒丟失,肉眼行小鼠氣管插管難度較大.③經(jīng)氣管途徑:為本實驗采用的方法,該法損傷較大,且模型一次耐受病毒量有限,但投送效率最高.④霧化吸入:需使用霧化器,霧化病毒顆粒大小、速率等其肺部沉積部位.該法損傷小,但病毒載體消耗大,亦無法準(zhǔn)確計算肺部沉積病毒量[22-23].既往研究表明經(jīng)過氣道途徑給予腺病毒載體,目標(biāo)產(chǎn)物主要集中在肺部表達(dá),在遠(yuǎn)隔器官無明顯表達(dá),有效減少其全身副反應(yīng).Alema-ny等[24]發(fā)現(xiàn)腺病毒入血后會很快在肝臟被清除,病毒的半衰期小于2 min.這與我們的研究結(jié)果類似,通過激光共聚焦顯微鏡、病理染色、ELISA等方法,證實經(jīng)氣道給予Ad-mDectin-1并沒有對小鼠造成嚴(yán)重的病理損傷,同時也沒有發(fā)現(xiàn)腺病毒載體在肝臟等遠(yuǎn)隔器官的證據(jù).目前尚缺乏不同給藥方式直接比較的動物模型研究,未來可以專門進(jìn)行給藥方式的研究.本研究經(jīng)氣道給予腺病毒載體能夠避免腺病毒在血液中播散.

    本研究采用微量注射器在氣管軟骨間隙注射Ad-mDectin-1的方式成功上調(diào)肺組織Dectin-1水平.Dectin-1mRNA水平較對照組明顯增加,免疫組化可以觀察到Dectin-1表達(dá)在細(xì)支氣管及終末細(xì)支氣管等上皮細(xì)胞明顯增加.Dectin-1水平在第5天達(dá)高峰,在第14天仍可檢測到支氣管上皮細(xì)胞表達(dá).Shao等[25]構(gòu)建了Ad-mIFN-γ,通過滴鼻的方式給予該載體后明顯增強免疫缺陷小鼠抗曲霉能力,小鼠生存率較對照組升高3倍多.上述研究都是利用腺病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染提高免疫缺陷小鼠對于曲霉的免疫力,都取得較好結(jié)果.相比之下,本研究將研究靶點選擇在免疫反應(yīng)的初始環(huán)節(jié),與曲霉相關(guān)的重要模式識別受體Dectin-1,通過上調(diào)肺組織Dectin-1水平以期能夠增強小鼠抗曲霉免疫功能.

    綜上所述,本研究通過Dectin-1重組腺病毒載體,采用氣管內(nèi)注射給藥方式,成功上調(diào)了小鼠肺組織支氣管上皮細(xì)胞Dectin-1表達(dá),給予重組腺病毒載體并未對小鼠肺組織造成明顯的病理損傷,為進(jìn)一步利用該模型評價其在曲霉感染中的預(yù)防和治療功能提供研究基礎(chǔ).

    [1]Segal BH.Aspergillosis[J].N Engl Med,2009,360(18):1870-1884.

    [2]Parker D,Prince A.Innate immunity in the respiratory epithelium[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2011,45(2):189-201.

    [3]Jaumouillé V,Grinstein S.Receptor mobility,the cytoskeleton,and particle binding during phagocytosis[J].Curr Opin Cell Biol,2011,23(1):22-29.

    [4]Mattila PE,Metz AE,Rapaka RR,et al.Dectin-1 fc targeting of aspergillus fumigatus beta-glucans augments innate defense against invasive pulmonary aspergillosis[J].Antimicrob Agents Chemotherapy,2008,52(3):1171-1172.

    [5]Taylor PR,Tsoni SV,Willment JA,et al.Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection[J].Nat Immunol,2007,8(1):31-38.

    [6]Macpherson JL,Rasko JE.Clinical potential of gene therapy:towards meeting the demand[J].Intern Med J,2014,44(3):224-233.

    [7]Geiger J,Aneja MK,Rudolph C.Vectors for pulmonary gene therapy[J].Inter J Pharm,2010,390(1):84-88.

    [8]夏 迪,錢 倩,劉志成,等.小鼠樹突狀細(xì)胞相關(guān)C型凝集素-1基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報,2015,28(4):341-345.

    [9]Xia D,Sun WK,Tan MM,et al.An adenoviral vector encoding fulllength dectin-1 promotes aspergillus-induced Innate immune response in macrophages[J].Lung,2015,193(4):549-557.

    [10]Marr KA,Carter RA,Boeckh M,et al.Invasive aspergillosis in allogeneic stem cell transplant recipients:changes in epidemiology and risk factors[J].Blood,2002,100(13):4358-4366.

    [11]Carpenter KJ,Buckland KF,Xing Z,et al.Intrapulmonary,adenovirus-mediated overexpression of KARAP/DAP12 enhances fungal clearance during invasive aspergillosis[J].Infect Immun,2005,73(12):8402-8406.

    [12]Katayama K,F(xiàn)uruki R,Yokoyama H,et al.Enhanced in vivo gene transfer into the placenta using RGD fiber-mutant adenovirus vector[J].Biomaterials,2011,32(17):4185-4193.

    [13]Vetrini F,Ng P.Gene therapy with helper-dependent adenoviral vectors:current advances and future perspectives[J].Viruses,2010,2(9):1886-1917.

    [14]Dormond E,Kamen AA.Manufacturing of adenovirus vectors: production and purification of helper dependent adenovirus[J].Methods Mol Biol,2011,737:139-156.

    [15]Shien K,Tanaka N,Watanabe M,et al.Anti-cancer effects of REIC/Dkk-3-encoding adenoviral vector for the treatment of nonsmall cell lung cancer[J].PLoS One,2014,9(2):e87900.

    [16]Rao B,Gao Y,Zhou Q,et al.A recombinant adenovirus vector encoding the light chain of human coagulation factor VII and IgG1 Fc fragment to targeting tissue factor for colorectal cancer immunotherapy in the mouse model[J].J Cancer Res Clin Oncol,2013,139(6): 1015-1023.

    [17]Francisco-Cruz A,Mata-Espinosa D,Estrada-Parra S,et al.Immunotherapeutic effects of recombinant adenovirus encoding granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in experimental pulmonary tuberculosis[J].Clin Exp Immunol,2013,171(3):283-297.

    [18]Keedy V,Wang W,Schiller J,et al.Phase I study of adenovirus p53 administered by bronchoalveolar lavage in patients with bronchioloalveolar cell lung carcinoma:ECOG 6597[J].J Clin Oncol,2008,26(25):4166-4171.

    [19]Drummond RA,Brown GD.The role of Dectin-1 in the host defence against fungal infections[J].Curr Opin Microbiol,2011,14(4): 392-399.

    [20]Sun WK,Lu X,Li X,et al.Dectin-1 is inducible and plays a crucial role in Aspergillus-induced innate immune responses in human bronchial epithelial cells[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2012,31(10):2755-2764.

    [21]Graham LM,Tsoni SV,Willment JA,et al.Soluble Dectin-1 as a tool to detect β-glucans[J].J immunol Methods,2006,314(1-2): 164-169.

    [22]Podolska K,Stachurska A,Hajdukiewicz K,et al.Gene therapy prospects--intranasal delivery of therapeutic genes[J].Adv Clin Exp Med,2012,21(4):525-534.

    [23]Lam JK,Liang W,Chan HK.Pulmonary delivery of therapeutic siRNA[J].Adv Drug Deliv Rev,2012,64(1):1-15.

    [24]Alemany R,Suzuki K,Curiel DT.Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice[J].J Gen Virol,2000,81(Pt 11):2605-2609.

    [25]Shao C,Qu J,He L,et al.Transient overexpression of gamma interferon promotes Aspergillus clearance in invasive pulmonary aspergillosis[J].Clin Exp Immunol,2005,142(2):233-241.

    Study on identification and security of the murine model administrated with recombinant adenovirus encoding murine Dectin-1

    QIAN Qian1,LIU Zhi-Cheng2,3,SUN Wen-Kui3,4,SHI Yi3
    1Nanjing Chest Hospital Affiliated to Southeast University,Nanjing 210029,China;2Central People's Hospital of Huizhou,Huizhou 516001,China;3Department of Respiratory Medicine of Nanjing General Hospital,Institute of Respiratory Disease of Nanjing University,Nanjing 210002,China;4Department of Respiratory Medicine,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China

    AIM:To constructe a murine model of upregulation of Dectin-1 in the airway by intratracheal administration of Ad-m Dectin-1 and study on identification and security of the murine model.METHODS:BALB/c mice were divided into PBS group,Ad-EGFP group and Ad-mDectin-1 group,intratracheal administrated with PBS,Ad-EGFP and Ad-mDectin-1 respectively.After administration,the levels of Dectin-1 mRNA in lung tissue were tested by real-time PCR and immunohistochemitry,the levels of IL-6 in lung homogenate and serum were detected by ELISA,distribution of adenovirus vector in lung and liver was detected by confocal.RESULTS:At day 3 after administration of Ad-mDectin-1,the Dectin-1 mRNA expression was obviously increase in mice treated with Ad-mDectin-1,and was resulted in nearly eighteen fold increase compared with mice treated by Ad-EGFP or PBS.For mice treated with Ad-mDectin-1,immunohistochemistry results showed strong immunostaining in the airways epithelium in bronchioles and nearly negative immunostaining in alveolar walls,the immunostaining of Dectin-1 can last for two weeks.The positive particles were mainly located in cytoplasm and membrane of epithelial cells.In contrast,mice treated with PBS or Ad-EGFP did not detected immunostaining in the lungs.Immunostaining results showed time-dependent change of average optical density with peak reach at day 5 after administration.We used confocal microscopy to detect the green fluorescent protein which can emit green fluorescence under excitation of 488nm laser.We found green fluorescence in lung but not in liver.Results of ELISA showed no significantly differences of levels of IL-6 were founded compared with mice treated with Ad-EGFP or PBS.Pathology of lung tissue of mice treated with Ad-mDectin-1 showed mild inflammation reaction,characterized by polymorphonuclear cells infiltration at 3 day post-infection and peribronchial lymphocytes hyperplasia after 3 days.Necrosis and structure changes were not found.CONCLUSION:After intratracheal administration of Ad-mDectin-1,the expression of Dectin-1 in the lungs of mice is successful upregulated.Location of Dectin-1 is mainly on airways epithelium in bronchioles.The peak of expression of Dectin-1 is at day 5 after administration of Ad-mDectin-1,expression of Dectin-1 can last for more than two weeks.After intratracheal of administration of Ad-mDectin-1,no significant adverse effect and obvious inflammatory reaction are observed.Adenovirus vector is mainly located in lung and does not spread to liver of distant organ.

    Dectin-1;adenovirus vector;gene therapy;IPA;natural immunity

    R511.8

    A

    2095-6894(2017)01-30-05

    2016-11-16;接受日期:2016-12-02

    國家自然科學(xué)基金資助項目(81270064,81500073),南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展一般項目(YKK13089)

    錢 倩.博士,主治醫(yī)師.研究方向:肺部感染、肺部腫瘤、胸膜疾病.Tel:025-83728558 E-mail:honeyhoney2007@163.com

    孫文逵.E-mail:sunwenkui2000@126.com.施 毅.E-mail:shiyi56@126.com

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