光強(qiáng)和光照時間對大腸桿菌光動力滅菌效果的影響

嚴(yán)金華,楊 晨,李澤林,施俊宇,許周速

(浙江工業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，浙江 杭州 310023)

光強(qiáng)和光照時間對大腸桿菌光動力滅菌效果的影響

嚴(yán)金華,楊 晨,李澤林,施俊宇,許周速

(浙江工業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，浙江 杭州 310023)

為獲得光動力滅菌最佳效果，改變光強(qiáng)和光照時間兩個光劑量參數(shù)，通過對比實(shí)驗(yàn)獲得最佳滅菌效果時的光劑量.以質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL甲苯胺藍(lán)為光敏劑，滅菌光源為中心波長為660 nm、功率為200 mW的激光二極管，大腸桿菌為試驗(yàn)菌種，通過細(xì)菌平板菌落計數(shù)法對比獲得滅菌效果.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對大腸桿菌具有滅菌效果，且滅菌效果受光強(qiáng)和光照時間兩個光劑量參數(shù)的影響，隨光強(qiáng)的增強(qiáng)和光照時間的延長，滅菌效果呈現(xiàn)先提高后略有下降，得到光動力滅菌效果存在最佳照射時間和光強(qiáng)的結(jié)論.

光動力滅菌；甲苯胺藍(lán)；大腸桿菌

光學(xué)技術(shù)應(yīng)用于生物、醫(yī)藥等學(xué)科是一個新興的交叉研究領(lǐng)域，比如改善光催化特性[1]與用于環(huán)境測量的光纖折射率傳感[2].光動力滅菌(Photodynamic disinfection)的基本原理是：選擇對細(xì)胞具有選擇性的光敏劑(Photosensitizer, PS)，使其在目標(biāo)細(xì)菌周圍或內(nèi)部聚集，在合適光源照射下引發(fā)光化學(xué)反應(yīng)，光敏劑從基態(tài)經(jīng)壽命極短的單線態(tài)帶間穿越到三線態(tài)這一高能態(tài)，處于高能態(tài)的光敏劑能級躍遷產(chǎn)生自由基或者單線態(tài)氧1O2，上述過程產(chǎn)生的單線態(tài)氧或自由基可以與細(xì)胞或微生物的磷脂、核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子反應(yīng)，破壞生物膜結(jié)構(gòu)或其他功能單位，使細(xì)胞或微生物死亡[3-4].

采用光動力滅菌方法治療疾病的方法稱為光動力療法(Photodynamic therapy, PDT)或者光動力抗菌藥物療法(Photodynamic antimicrobial chemotherapy, PACT).光動力滅菌技術(shù)最早起源于“一戰(zhàn)”前，“一戰(zhàn)”中采用該方法挽救了許多生命.但隨著“抗生素時代”的到來，光動力滅菌技術(shù)沒有得到重視，直到近年來“超級細(xì)菌”出現(xiàn)及病菌耐藥性問題凸顯，研究一種有效的且不易產(chǎn)生耐受性的方法十分有必要，因此有關(guān)光動力滅菌法的研究再次被廣泛開展.國內(nèi)唐姝姝等[3]研究亞甲基藍(lán)對大腸桿菌的殺傷作用，得出的結(jié)論為亞甲基藍(lán)對革蘭氏陰性腸出血性大腸桿菌有非常明顯的光滅活效果.此外，研究發(fā)現(xiàn)二氧化硅納米粒對大腸桿菌也具有較好的殺菌作用[4].

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康募皽?zhǔn)備

光動力技術(shù)是一種藥械聯(lián)用的技術(shù)，涉及到給藥和光照兩個過程，影響光動力滅菌效果取決于兩個方面：一是光敏劑藥物的有效性，包括藥物靶向性、在一定的光劑量激發(fā)下自由基或者單線態(tài)氧的產(chǎn)生效率；二是激發(fā)光敏劑的光源及光源參數(shù).國內(nèi)外針對影響滅菌效果的原因開展了研究，如有研究者提出細(xì)菌細(xì)胞壁對光敏劑吸收而對滅菌效果的影響[5-6]，革蘭氏陰性菌具有復(fù)雜的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，屏蔽了單重態(tài)氧和細(xì)胞膜的有效結(jié)合，從而降低了滅菌作用.由于光動力滅菌技術(shù)多數(shù)研究人員的學(xué)科背景為醫(yī)學(xué)或藥物研究人員，因此目前絕大多數(shù)關(guān)于光動力滅菌的研究主要是針對光敏劑的研發(fā)及與生物體相關(guān)實(shí)驗(yàn)，較少涉及光源的使用問題.

在光劑量的問題上，目前國內(nèi)外的研究者大多采用經(jīng)驗(yàn)劑量[7-8]，人們直觀的感覺，光強(qiáng)越強(qiáng)或者光照時間越長，對滅菌效果的提升應(yīng)當(dāng)是有效的，然而，事實(shí)并非如此.從光學(xué)角度出發(fā)，利用實(shí)驗(yàn)方法，以獲得最優(yōu)滅菌效果時所需要的光強(qiáng)和光照時間，從而獲得光動力滅菌最佳效果時所需要的光強(qiáng)和光照時間兩個光劑量參數(shù).為此，進(jìn)行3組對比實(shí)驗(yàn)，分別是加入光敏劑情況下的光照和不用光照、相同光強(qiáng)情況下的不同光照時間和相同光照時間情況下的不同光照強(qiáng)度，以獲得光動力滅菌最佳效果時所需要的光強(qiáng)和光照時間兩個光劑量參數(shù).

2 實(shí)驗(yàn)材料

甲苯胺藍(lán)是一種能有效對抗多鐘微生物的光敏劑，其作為光敏劑的光動力療法在殺滅病原微生物方面有很多優(yōu)勢，它能立刻與微生物結(jié)合，幾分鐘之內(nèi)就可以進(jìn)行光照滅菌，不需要在病灶處保持長時間的高質(zhì)量濃度[9-10].實(shí)驗(yàn)以質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL甲苯胺藍(lán)為光敏劑，滅菌光源為中心波長為660 nm、功率為200 mW的激光二極管，大腸桿菌為試驗(yàn)菌種，通過細(xì)菌平板菌落計數(shù)法對比獲得滅菌率.實(shí)驗(yàn)所用材料如下：

1) 實(shí)驗(yàn)菌種采用大腸桿菌菌株(浙江工業(yè)大學(xué)生環(huán)學(xué)院提供)，主要基于以下兩點(diǎn)考慮：一是大腸桿菌代謝類型是異養(yǎng)兼性厭氧型，即在有氧和無氧環(huán)境均能活動，對細(xì)菌培養(yǎng)要求較低；二是大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，對這類菌種研究單位較多，比較容易獲取菌株.

將活化的大腸桿菌接種到液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，將細(xì)菌懸濁液取出，用分光光度計測出OD600=0.05(108CFU/mL左右)，此時細(xì)菌形狀穩(wěn)定，且具有活力.

2) 光敏劑采用甲苯胺藍(lán)(Toluidine blue O，TBO)(上海晶純生化科技股份有限公司)，粉末平均相對分子質(zhì)量為305.82，用去離子水將其配置成高質(zhì)量濃度母液，并按比例稀釋成不同質(zhì)量濃度，避光保存，備用.經(jīng)分光光度計(島津UV2550)測量，其峰值吸收波長為663 nm.

3) 光源采用光源為中心波長為660 nm、最大出光功率為200 mW的激光二極管(Laser diode, LD)，光源波長選擇主要考慮光敏劑的吸收波譜與光源的波長相匹配的問題，實(shí)驗(yàn)選用660 nm正好處于TBO的強(qiáng)吸收峰范圍內(nèi).

4) 采用激光二極管控制器(ILX LightWave LDC-3990)控制光功率.利用透鏡對出光光束進(jìn)行聚焦，根據(jù)焦距和光束參數(shù)，獲得光束尺寸最小處的面積，并確保光照時光束尺寸最小處照在細(xì)菌溶液內(nèi)，即光照面積不變，而通過控制光功率達(dá)到改變光照強(qiáng)度的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?

5) LB液體培養(yǎng)基和LB計數(shù)培養(yǎng)基(購自青島海博生物技術(shù)有限公司).LB液體培養(yǎng)基用于大腸桿菌培養(yǎng)，LB計數(shù)培養(yǎng)基用于平板菌落計數(shù).

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

為了獲得最優(yōu)滅菌效果時所需要的光強(qiáng)和光照時間，進(jìn)行3組對比實(shí)驗(yàn)，分別是加入光敏劑情況下的光照和不用光照、相同光強(qiáng)情況下的不同光照時間和相同光照時間情況下的不同光照強(qiáng)度，通過實(shí)驗(yàn)得到光照強(qiáng)度、光照時間分別與滅菌率的關(guān)系，進(jìn)而獲得光動力滅菌最佳效果時所需要的光強(qiáng)和光照時間兩個光劑量參數(shù).

3.1 有無光照對滅菌效果的影響

首先進(jìn)行光滅菌效果影響的實(shí)驗(yàn).將制備好的大腸桿菌懸液各取2 mL分別放入3個試劑瓶中，第1和第2個瓶中分別加入0.1 mg/mL的甲苯胺藍(lán)溶液100 μL，第3個試劑瓶不加入甲苯胺藍(lán)也不進(jìn)行光照，作為對照組.3個瓶都避光孕育10 min后，取出第1試劑瓶進(jìn)行光照實(shí)驗(yàn)，使細(xì)菌溶液處于光束照射下，通過設(shè)定驅(qū)動器的時間設(shè)置使光照時間為60 s，控制LED的電流控制輸出光功率，根據(jù)光束面積估算，使光強(qiáng)約為200 mW/cm2.

光照實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用移液器分別從3個瓶中取出0.5 mL細(xì)菌量溶液，分別滴入LB瓊脂培養(yǎng)皿，并放入37 ℃培養(yǎng)環(huán)境中分別進(jìn)行培養(yǎng)，采用平板菌落計數(shù)法統(tǒng)計，得到3個瓶中每毫升中菌落單位數(shù)分別為的N1，N2和N，其中N為對照組中的細(xì)菌菌落數(shù).細(xì)菌滅菌率計算公式為

式中：N為對照組每毫升中菌落單位數(shù)；Nx為實(shí)驗(yàn)組每毫升中菌落單位數(shù).

無光照和有光照射條件下的對比實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表1所示.

表1 有無光照情況下的滅菌率

由表1看出：加入光敏劑而沒有光照的情況下，對大腸桿菌也有滅活作用.這是由于甲苯胺藍(lán)通常用作細(xì)胞染料，可以為細(xì)胞著色，但作為堿性燃料，其對細(xì)胞具有一定的滅活作用，但滅菌效率僅為24%，顯著低于經(jīng)過光照后的76.4%.結(jié)果表明：光照會使得光敏劑產(chǎn)生活化，從而提高光敏劑對大腸桿菌的殺滅能力.

3.2 光照時間對滅菌效果的影響

實(shí)驗(yàn)過程和步驟與3.1類似，即將制備好的大腸桿菌懸液各取2 mL分別放入5個試劑瓶中，分別加入0.1 mg/mL的甲苯胺藍(lán)溶液100 μL，避光孕育10 min后，將其中4個試劑瓶進(jìn)行光照實(shí)驗(yàn)，設(shè)置光照時間分別為0，30，60，90 s，第5個作為對照組.光強(qiáng)對比實(shí)驗(yàn)同樣采用控制變量法，將光強(qiáng)度固定為50 mW/cm2，改變光照時間的長度.測得的數(shù)據(jù)如表2所示.

表2 不同光照時間的滅菌率

由表2可知：當(dāng)光敏劑質(zhì)量濃度保持不變，并保持光強(qiáng)不變，在光照時間由短變長的過程中，滅菌效率先是呈現(xiàn)增長的趨勢，然后在75%～80%之前趨于穩(wěn)定，當(dāng)時間持續(xù)增長時又會出現(xiàn)明顯的下降.說明甲苯胺藍(lán)在光強(qiáng)50 mW/cm2的情況下，對大腸桿菌的殺滅效率峰值出現(xiàn)在光照60 s左右，滅菌效率接近80%.這與人們的常規(guī)認(rèn)識不同，即存在一個最佳照射時間，并非時間越長越好.

該結(jié)果出現(xiàn)的非常重要的一個原因是：光照不僅激發(fā)光敏劑產(chǎn)生自由并殺滅細(xì)菌，同時光照也對細(xì)菌液有一定的加溫作用，而該光動力滅菌實(shí)驗(yàn)是在室溫情況下進(jìn)行，光照而導(dǎo)致的適當(dāng)升溫使得溫度更接近于細(xì)菌適宜繁衍的溫度，反而更有助于細(xì)菌生長，故存在最佳照射時間.

3.3 光強(qiáng)對滅菌效果的影響

將制備好的大腸桿菌懸液各取2 mL分別放入5個試劑瓶中，分別加入0.1 mg/mL的甲苯胺藍(lán)溶液100 μL，避光孕育10 min后，將其中4個試劑瓶進(jìn)行光照實(shí)驗(yàn)，設(shè)置光照強(qiáng)度分別為10，18，50，200 mW/cm2，第5個作為對照組.光強(qiáng)對比實(shí)驗(yàn)采用控制變量法，將光照時間固定為60 s，改變激光器功率以改變光強(qiáng)，測得的數(shù)據(jù)如表3所示.

表3 不同光強(qiáng)的滅菌率

由表3可知：光照時間一定時，隨著光強(qiáng)度的增加，滅菌先是呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)光強(qiáng)到達(dá)一定強(qiáng)度后，繼續(xù)增大光強(qiáng)度，滅菌效率不會出現(xiàn)大的變化，說明當(dāng)光強(qiáng)達(dá)到一定強(qiáng)度以后，光強(qiáng)不再與滅菌效率呈正相關(guān)趨勢.也就是說，存在一個臨界光強(qiáng)度值，當(dāng)光強(qiáng)超過該臨界值，對提高滅菌效率并沒有大的提升，說明通過增大光照強(qiáng)度以提高滅菌率是沒有意義的，該結(jié)果對于將光動力治療法應(yīng)用于臨床具有重要意義，不僅對于光治療儀的光源選擇更加寬泛，即無需選用功率超大型的光源，降低了對散熱的要求，而且對降低患者治療時的不舒適度也大有益處，因?yàn)榇蠊β使庠丛诳拷梭w時所帶來的熱量會讓人感覺不適.

4 結(jié) 論

以甲苯胺藍(lán)為光敏劑、紅光激光二極管為滅菌光源、大腸桿菌為試驗(yàn)菌種，采用細(xì)菌平板菌落計數(shù)法獲得各種情況下的滅菌率，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用方法可以實(shí)現(xiàn)光動力滅菌，且滅菌率隨光照時間呈現(xiàn)先提高后下降的趨勢，同時隨光強(qiáng)的增強(qiáng)呈現(xiàn)先提高后略有下降的趨勢，表明滅菌率并非隨著光劑量的提高而單調(diào)提高.分析原因，光照產(chǎn)生的熱可能是一個重要因素，光照的增強(qiáng)和光照時間的加長給而產(chǎn)生額外的熱量，加快了細(xì)菌繁殖速度，在一定程度上抵消了滅菌進(jìn)程.

本文得到浙江工業(yè)大學(xué)優(yōu)秀課程建設(shè)項(xiàng)目(YX1318)的資助.

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(責(zé)任編輯：劉 巖)

The efficiency ofEscherichiacoliphotodynamic disinfection effected by light intensity and illumination time

YAN Jinhua, YANG Chen, LI Zelin, SHI Junyu, XU Zhousu

(College of Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310023, China)

In order to obtain the optimal efficiency of photodynamic disinfection, a series of comparative experiments were carried out by changing two parameters including light intensity and illumination time. In the experiments, toluidine blue with concentration of 0.1 mg/mL acts as the photosensitizer, the optical source for sterilization is Laser diode with 650 nm central wavelength and 200 mW power and Escherichia coli is used as test strains. A plate counting method is adopted to evaluate the Disinfection efficiency. Experiments show that photodynamic disinfection efficiency is effected by two optical parameter, i.e. light intensity and illumination time. With the strengthening of optical light intensity and prolonging of illumination time, the disinfection efficiency is firstly increasing and then slightly decreasing. It is concluded that the optimal disinfection efficiency could be obtained by adopting appropriate light intensity and time.

photodynamic disinfection; toluidine blue;Escherichiacoli

2016-03-30

浙江省公益技術(shù)研究項(xiàng)目(2015C31094)

嚴(yán)金華(1979—)，男，江蘇南通人，副教授，研究方向?yàn)楣怆娮悠骷c光學(xué)傳感，E-mail：jinhua@zjut.edu.cn.

O439

A

1006-4303(2017)01-0060-04