黃蜀葵提取物對大鼠背部深Ⅱ度燙傷的治療作用

宋必衛(wèi)，劉潔瓊，章方珺，楊軼安，付再林

(浙江工業(yè)大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

黃蜀葵提取物對大鼠背部深Ⅱ度燙傷的治療作用

宋必衛(wèi)，劉潔瓊，章方珺，楊軼安，付再林

(浙江工業(yè)大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

為觀察黃蜀葵提取物(HSK)促進SD大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合作用，利用超級控溫燙傷儀制備大鼠深Ⅱ度燙傷模型，以美寶濕潤燒傷膏(MEBO)為陽性藥，觀察燙傷皮膚創(chuàng)面外涂HSK后開始結(jié)痂和脫痂時間、愈合時間、創(chuàng)面愈合率和瘢痕形成情況，并取燙傷部位全層皮膚做HE染色切片觀察組織損傷和修復狀況.結(jié)果顯示：與模型組相比，HSK給藥組大鼠燙傷創(chuàng)面開始結(jié)痂、脫痂及完全愈合的時間均明顯縮短，各時間點創(chuàng)面愈合率顯著提高，燙傷創(chuàng)面愈后瘢痕面積顯著減小，燙傷皮膚病理形態(tài)顯著改善.結(jié)果表明：HSK能顯著促進燙傷創(chuàng)面的愈合，是一種良好的外用燙傷治療藥物.

黃蜀葵；MEBO；燙傷；創(chuàng)面愈合；瘢痕

燒燙傷一般是指由物化因素如沸水(油)、蒸汽、電、火焰、放射線或化學物質(zhì)等作用于人體引起的外傷性疾病，是臨床上最常見的意外性傷害之一[1-3].我國每年約有2 000萬人遭受不同程度的燒燙傷，在因意外傷害而死亡的人數(shù)中，燒燙傷僅次于交通事故，排第二位[4-5].燒燙傷常用局部外用藥治療，西藥主要用磺胺嘧啶銀預防創(chuàng)面感染，毒副作用較多；中藥多用濕潤燒傷膏(MEBO)治療.

黃蜀葵是錦葵科秋葵屬植物，是傳統(tǒng)民間用藥，歷史悠久，始載于宋代劉禹錫所著的《嘉佑本草》.現(xiàn)代藥理研究證明黃蜀葵花主要含黃酮類、有機酸類、甾類及揮發(fā)性成分等，具有鎮(zhèn)痛、抗氧化、保護心腦血管、治療慢性支氣管炎等功能[6-7].盡管中國藥典已明確其功能主治為“外治癰疽腫毒、水火燙傷”[8]，但其治療燒燙傷作用一直未見藥理學研究報道.因此，本研究通過采用超級控溫燙傷儀建立大鼠背部深Ⅱ度燙傷模型，觀察HSK提取物對實驗性燙傷的治療作用.

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

黃蜀葵干燥花(購自安徽)；美寶濕潤燒傷膏(產(chǎn)品批號1506903A，汕頭市美寶制藥有限公司).

試劑采用95%工業(yè)酒精；乙醚、硫化鈉(均為分析純，杭州化學試劑有限公司)；甲醛溶液(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司).

1.2 實驗儀器

真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號RE-S2A，上海亞龍生化儀器廠)；超級控溫燙傷儀(型號YLS-5Q，濟南益延科技發(fā)展有限公司)；電子分析天平(Mettler Toledo，型號AL104)；倒置光學顯微鏡(Nikon Eclipse，型號TS100-F DH1).

1.3 實驗動物

清潔級SD大鼠，體重220～250 g，雌雄各半，購自浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心，動物許可證號：scxk(浙)20140001.

1.4 黃蜀葵花提取物(HSK)的制備

采用乙醇回流法制備HSK[9-10]，取已粉碎過篩的黃蜀葵花粗粉50.0 g，加入500 mL 80%乙醇，加熱回流重復提取3次，每次2 h，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇得HSK，計算得率為：得率=(浸膏重量/原料重量)×100%.

1.5 大鼠背部深Ⅱ度燙傷模型制備

標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水，保持飼養(yǎng)環(huán)境相對濕度40%～70%，恒溫(22±2) ℃，適應性喂養(yǎng)7 d后開始實驗.燙傷前24 h，用8%硫化鈉溶液小心脫去大鼠背部被毛.次日，用10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠后，于超級控溫燙傷儀上固定，背部朝上，控制壓力0.5 kg、溫度80 ℃，燙傷時間20 s，即可造成大鼠背部深Ⅱ度燙傷模型，每鼠4個燙傷創(chuàng)面.

1.6 分組與給藥

SD大鼠隨機分為4組，即正常組、模型組、陽性藥對照組和HSK實驗組，每組8只，雌雄各半.正常組脫毛但不燙傷，其余組用1.5方法制作大鼠背部深Ⅱ度燙傷模型.除模型組外，其余兩組造模后1 h開始外用給藥，對照組外涂MEBO(20 mg/cm2)，實驗組外涂HSK(10 mg/cm2).參照MEBO使用方法，第1周外涂藥物，每天4次，每4～6 h換藥1次，每次換藥前用溫開水清洗創(chuàng)面，洗去殘留藥物，暴露創(chuàng)面，使藥物均勻覆蓋創(chuàng)面；第2周，每天3次，每6～8 h換藥1次；第3周，每天早晚各給藥1次，3周之后直到愈合，每天給藥1次.

1.7 創(chuàng)面愈合情況及相關(guān)評價指標的測定

1.7.1 創(chuàng)面結(jié)痂及脫痂時間的測定

肉眼觀察燙傷創(chuàng)面開始結(jié)痂、開始脫痂所需的時間.具體判斷方法為：燙傷皮膚的邊緣開始干燥，形成鱗狀皮屑，即為開始結(jié)痂的時間；皮膚燙傷部位痂塊明顯隆起，痂皮邊緣開始上翹，與皮膚脫離，即為開始脫痂時間[11].

1.7.2 創(chuàng)面愈合率的測定

給藥后每3 d拍攝燙傷創(chuàng)面，記錄創(chuàng)面愈合情況.并于造模后1 h和7，14，21 d四個時間點，用透明硫酸紙描繪創(chuàng)面圖形，稱取創(chuàng)面面積圖紙的重量，以該重量的變化間接表示燙傷皮膚愈合面積的變化，并以燙傷后1 h的創(chuàng)面面積作為燙傷面積，分別計算創(chuàng)面愈合率[11-12].創(chuàng)面愈合率計算公式為

1.7.3 創(chuàng)面愈合時間的測定

肉眼觀察，以燙傷創(chuàng)面痂皮完全脫落，創(chuàng)面被新生上皮覆蓋的時間為創(chuàng)面愈合時間[11]，觀察記錄每組實驗動物創(chuàng)面完全愈合的時間，比較HSK對燙傷創(chuàng)面愈合的影響.

1.7.4 愈后瘢痕面積的測定

待燙傷創(chuàng)面完全愈合后，觀察瘢痕形成情況，并用透明硫酸紙覆蓋于瘢痕，描繪瘢痕圖形，記錄下瘢痕面積圖紙的重量，計算出瘢痕面積，作為愈后瘢痕面積.

1.8 病理組織學觀察

分別于燙傷給藥后第7，14，21，28 d處死大鼠，取燙傷部位全層皮膚，10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，于光鏡下觀察.

1.9 統(tǒng)計處理

采用GraphPad Prism 5軟件處理實驗數(shù)據(jù)，用Mean±SD表示；采用One-way ANOVA檢驗樣本均數(shù)差異顯著性，以p<0.05為差異有顯著性意義.

2 結(jié) 果

2.1 HSK制備

減壓回收乙醇后得到棕褐色HSK浸膏6.65 g，浸膏得率13.3%，其質(zhì)量分數(shù)含生藥7.52 g/g浸膏.

2.2 創(chuàng)面開始結(jié)痂和脫痂及愈合時間的比較

與模型組(Model)相比較，陽性對照組(MEBO組)完全愈合時間明顯縮短(縮短7.8%，p<0.01)，結(jié)痂時間和脫痂時間均有縮短趨勢；HSK組完全愈合時間縮短13.5%(p<0.001；是MEBO組的1.73倍)，脫痂時間亦顯著縮短(p<0.05)，結(jié)痂時間縮短趨勢明顯.上述結(jié)果(表1)表明：HSK能顯著促進燙傷創(chuàng)面愈合，作用效果比MEBO更佳.

表1 HSK縮短大鼠燙傷創(chuàng)面愈合時間(Mean±SD，n=8)1)

Table 1 HSK shortened the wound healing time in rats (Mean±SD,n=8)

組別劑量/(mg·cm-2)結(jié)痂時間/d脫痂時間/d愈合時間/dModel4．70±1．259．62±1．5128．54±1．13MEBO203．90±0．888．15±1．8626．31±1．32??HSK103．60±1．177．66±1．85?24．69±2．11???

注：1) 與模型組(Model)相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001.

2.3 創(chuàng)面愈合率的測定

深Ⅱ度燙傷累及真皮深層，僅殘留深部的少量皮膚附件，需借助創(chuàng)面周圍的正常細胞增殖向中心移行覆蓋創(chuàng)口；底部的成纖維細胞增殖填補創(chuàng)口以及底部的表皮干細胞增殖、分化形成新表皮以完成修復.從圖1動態(tài)進程照片中可直觀看出：用藥后6d，HSK組大鼠燙傷創(chuàng)面痂皮開始脫落，至用藥后24d，創(chuàng)面基本愈合，且毛發(fā)生長旺盛.與HSK組相比，MEBO組9d時開始出現(xiàn)痂皮脫落現(xiàn)象，24d時創(chuàng)面未完全愈合，表明HSK能明顯促進創(chuàng)面愈合且優(yōu)于MEBO.

分時(7，14，21d)創(chuàng)面愈合率見表2(Mean±SD，n=8)，與模型組相比，HSK組的促愈合效果最為顯著，在21d時的創(chuàng)面愈合率已達94%以上，比模型組提高了15.36%，是MEBO組的1.49倍，證明HSK能夠明顯提高大鼠燙傷創(chuàng)面的愈合速率，是促進燙傷修復的有效藥物.

A—模型組；B—MEBO組；C—HSK組圖1 大鼠創(chuàng)面愈合進程Fig.1 The process of the scald wound healing

組別劑量/(mg·cm-2)愈合率/%7d14d21dModel10．04±5．8160．24±5．6581．75±2．79MEBO2011．98±5．9481．46±2．21???90．18±4．83??HSK1014．08±6．8483．33±2．65???94．31±3．82???

注：1) 與模型組(Model)相比，**p<0.01，***p<0.001.

2.4 愈后瘢痕面積測定

大鼠燙傷創(chuàng)面愈后瘢痕面積見表3(Mean±SD，n=8)，MEBO組和HSK組的瘢痕面積均明顯小于模型組，具有顯著性差異(p<0.001)，且HSK亦有優(yōu)于MEBO的趨勢，表明HSK可以在促進愈合同時極為顯著抑制體表瘢痕的形成，具有上佳皮膚美容價值.

表3 HSK減小大鼠燙傷創(chuàng)面愈后瘢痕面積1)

注：1) 與模型組(Model)比較，***p<0.001.

2.5 燙傷創(chuàng)面愈合過程病理學變化

分別于給藥后7，14，21，28 d取材，HE染色鏡下連續(xù)觀察各組病理組織學變化(圖2).正常組皮膚全層完好，角質(zhì)層、表皮及真皮結(jié)構(gòu)清晰，毛囊及皮膚附屬結(jié)構(gòu)完整.模型組在燙傷7 d后，表皮結(jié)構(gòu)破壞，組織水腫并有較多壞死，結(jié)構(gòu)模糊，存在大量炎性細胞浸潤；14 d時，表皮仍有壞死組織且崩解；21 d時，創(chuàng)面由肉芽組織覆蓋，肉芽組織層薄，上皮爬行速度慢，可見少量纖維細胞排列紊亂；用藥后28 d，創(chuàng)面尚未完全上皮化，愈合部分皮下未見毛囊形成，形成瘢痕.HSK組燙傷后7 d鏡下可見少量炎性細胞，肉芽組織大量生長；14 d時，表層痂皮脫落，創(chuàng)面被一層較厚的肉芽組織所覆蓋，肉芽組織生長明顯，成纖維細胞大量增生；21 d，創(chuàng)面基本被上皮組織所覆蓋，鏡下可見大量纖維細胞；至用藥后28 d，表皮已全部覆蓋創(chuàng)面，表皮層生長較好，皮下可見少量新生毛囊，纖維細胞排列規(guī)則.與HSK組相比，MEBO組14 d時部分創(chuàng)面仍有壞死組織崩解；至28 d未見新生毛囊.綜合來看，以HSK修復最快最好.

A—正常組；B—模型組；C—MEBO組；D—HSK組圖2 大鼠創(chuàng)面病理學變化Fig.2 The dermatic pathological changes of scald skin in rats

3 結(jié) 論

燙傷是日常生活和工作中發(fā)生率最高的皮膚性損傷之一.燙傷創(chuàng)面愈合過程復雜，且愈后可遺留瘢痕或功能障礙[13].燙傷創(chuàng)面開始結(jié)痂和脫痂時間、創(chuàng)面愈合率及愈合時間是直接、客觀而有效的創(chuàng)面愈合評價指標，而創(chuàng)面愈后瘢痕面積的測定則能更加直觀的考察藥物對創(chuàng)面愈后疤痕的影響.本研究利用超級控溫燙傷儀建立大鼠背部深Ⅱ度燙傷模型，考察外涂HSK對燙傷創(chuàng)面愈合的療效，證明HSK能顯著減少創(chuàng)面結(jié)痂和脫痂時間，縮短創(chuàng)面愈合時間，提高創(chuàng)面愈合率，且能明顯減小瘢痕面積，效果上佳.研究發(fā)現(xiàn)所有測定指標上，HSK均有優(yōu)于MEBO的傾向，限于動物實驗樣本量小，未達到有統(tǒng)計學意義的結(jié)果，基于統(tǒng)計學知識，相信在較大樣本研究中完全能實現(xiàn)有統(tǒng)計學意義的結(jié)果.文獻報道黃蜀葵花主要有效成分為黃酮類化合物，具有抗氧化損傷、鎮(zhèn)痛和抗心腦缺血等作用，對口腔潰瘍治療效果好[14-17].目前，我們雖然缺乏其促創(chuàng)面愈合方面的研究，但有理由推論黃酮類化合物也是HSK促進燙傷創(chuàng)面愈合的有效部分，這部分內(nèi)容將在今后的研究中進一步闡明.總之，HSK安全無毒(可作蔬菜食用)，在減輕創(chuàng)面疼痛和炎癥的同時，顯著促進創(chuàng)口愈合修復，是一種理想的標本兼治的創(chuàng)面外用治療劑，開發(fā)潛力大.我們的研究還表明：HSK促進燒燙傷修復的機制是保護和促進成纖維細胞和表皮細胞增殖，基于篇幅，留待后續(xù)發(fā)表.

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The therapeutic effect of Abelmoschus manihot (L.) medic extract on deep second-degree scald in rats

SONG Biwei, LIU Jieqiong, ZHANG Fangjun, YANG Yian, FU Zailin

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

To observe the effect of HSK extracted from the flower of Abelmoschus manihot (L.) medic on wound healing of deep second-degree scald in rats. Deep second-degree scald model was set up with a scald apparatus in SD rats. Moist Exposed Burn Ointment (MEBO) was used as the positive control. After modeling, HSK (10 mg/cm2) or MEBO (20 mg/cm2) were applied to the wound surface everyday until the wound healing completely. The time of incrustation and decrustation, wound healing time, the wound healing rate and the scar formation were recorded. The animals were sacrificed and the skin samples were taken for the histological examination. The results showed that, compared with the control group, HSK groups not only significantly decreased the time of incrustation and decrustation, shortened the wound healing time, increased the wound healing rate at the same time, but also reduced the scar area after burn wound healing. Moreover the HSK also can improve the dermatic pathological changes of scald skin. In conclusion: HSK can promote wound healing and can be a satisfying therapy for scald injuries.

Abelmoschus manihot (L.) medic；MEBO；burn wound；wound healing；scar

(責任編輯：劉 巖)

2016-03-23

宋必衛(wèi)(1956—)，男，安徽岳西人，教授，研究方向為神經(jīng)分子藥理學，E-mail: bwsong@zjut.edu.cn.

R965

A

1006-4303(2017)01-0047-04