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    鐵對紫球藻生長及可溶性蛋白和胞外多糖含量的影響

    2017-02-27 11:21:34谷兵張達(dá)娟王沂
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年1期

    谷兵+張達(dá)娟+王沂

    摘要:通過研究不同鐵離子濃度條件下紫球藻的比生長率、主要葉綠素含量、可溶性蛋白及胞外多糖含量的變化情況,來闡述鐵離子對紫球藻生長的影響。結(jié)果表明,添加不同濃度的Fe3+對紫球藻的生長有明顯的促進(jìn)作用;Fe3+濃度在5×10-7~5×10-5 mol/L范圍內(nèi)時(shí),紫球藻的生長和葉綠素a、β-胡蘿卜素、可溶性蛋白、胞外多糖的積累隨Fe3+濃度的升高而增加,當(dāng)Fe3+濃度為5×10-4 mol/L時(shí),紫球藻的生長較為緩慢,其細(xì)胞密度略低于其他處理及對照組,且上述各指標(biāo)均與5×10-5 mol/L處理組之間無顯著差異。因此,紫球藻培養(yǎng)中鐵的最適添加濃度約為5×10-5 mol/L。

    關(guān)鍵詞:紫球藻;鐵;可溶性蛋白;胞外多糖

    中圖分類號(hào): S968.43+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2017)01-0159-04

    鐵是浮游植物的微量營養(yǎng)元素和催化元素,是浮游植物生長的關(guān)鍵限制因子之一,影響著浮游植物的電子傳遞、氧的新陳代謝、氮的吸收利用、呼吸作用和光合作用[1],且在海洋“生物泵”循環(huán)過程起著關(guān)鍵作用[2]。20世紀(jì)30年代初,研究學(xué)者提出鐵是海洋浮游植物生長的潛在性限制因子[3-6]。李麗研究了鐵離子對三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、小球藻CS-01(Chlorella sorokiniana CS-01)和等鞭金藻(Isocrydid galbana)生長和脂質(zhì)積累的影響,發(fā)現(xiàn)鐵對這3株微藻的生長和脂質(zhì)積累均有促進(jìn)作用,同時(shí)還比較研究了鐵、鎂、銅、鈣對小球藻生長和脂質(zhì)積累的影響,其中鐵離子的影響最為顯著[7]。王培磊等研究了鐵對鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)生長和β-胡蘿卜素積累的影響,結(jié)果表明,較高濃度的鐵有利于其β-胡蘿卜素的積累[1]。

    紫球藻(Porphyridium cruentum)細(xì)胞呈圓形或卵圓形,外披黏質(zhì)的鞘膜,隸屬于紅藻門(Rhodophyta)原紅藻綱(Protofloridcophyceac)紫球藻目(Porphyridiales)紫球藻科(Porphyridiaceae)紫球藻屬(Porphyridium),是紅藻門中唯一的單細(xì)胞藻類,紫球藻廣泛分布于海水、淡水、咸水及潮濕的土壤中[8]。關(guān)于紫球藻的研究主要集中在培養(yǎng)工藝的優(yōu)化改良和多種生物活性物質(zhì)的開發(fā)利用方面[9]。已有相關(guān)文獻(xiàn)研究表明[10],基于藻類的光合作用效率和生長潛能,1 hm2大小的土地理論上計(jì)算可以生產(chǎn)超過30 000 L,即200桶油的量,相當(dāng)于同樣土地上大豆產(chǎn)油量的100倍,而紫球藻生長快、繁殖周期短,且抗鹽性強(qiáng),具廣闊的應(yīng)用前景及較大的潛在市場。本研究主要探討了不同濃度的鐵離子對紫球藻比生長率和葉綠素a、β-胡蘿卜素、可溶性蛋白、胞外多糖含量的影響,以期為進(jìn)一步探討紫球藻的培養(yǎng)條件以及生物活性物質(zhì)的提取提供有益參考。

    目前,國內(nèi)外關(guān)于海藻多糖的研究主要集中在其組成、結(jié)構(gòu)分析、生理活性及藥理試驗(yàn)等方面,而對于影響或促進(jìn)海藻多糖合成和分泌的外界物理因子的研究相對比較少。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)藻種

    紫球藻藻種,由中國科學(xué)院水生生物研究所藻種庫提供。

    1.2 培養(yǎng)條件

    試驗(yàn)采用f/2培養(yǎng)基,以自然光照為光源,光—暗周期為12 h—12 h,光照度為2 000~2 500 μmol/(m2·s),培養(yǎng)溫度為(27±2) ℃。設(shè)置對照組和4個(gè)處理組,處理組培養(yǎng)基中鐵離子濃度分別為5×10-7、5×10-6、5×10-5、5×10-4 mol/L,每組分別設(shè)置3個(gè)平行,按10%的量接種紫球藻液,試驗(yàn)進(jìn)行培養(yǎng)周期為14 d,每2 d取樣1次測定相關(guān)指標(biāo)。

    1.3 各項(xiàng)指標(biāo)的測定及方法

    1.3.1 紫球藻比生長率的測定 用血球計(jì)數(shù)板記錄紫球藻細(xì)胞數(shù),每個(gè)重復(fù)均需要測定后取平均數(shù)。

    相對生長率=ln(X2-X1)/(T2-T1)。

    式中:X1和X2分別代表T1和T2時(shí)紫球藻細(xì)胞的濃度。

    1.3.2 葉綠素a的提取與測定 參考韓娟等的方法[11],取紫球藻液,4 500 r/min離心5 min,棄上清液,藻團(tuán)中加入甲醇振蕩混勻,70 ℃水浴振蕩5 min,自然冷卻后4 500 r/min離心5 min取上清液,即為紫球藻葉綠素a提取液,1 cm光徑下測定750、665 nm波長處的吸光度。

    葉綠素a含量=13.9×(D665 nm-D750 nm)×V1/V2。

    式中:V1為最終體積,V2為取樣體積,13.9為相關(guān)系數(shù)。

    1.3.3 β-胡蘿卜素的提取與測定 參考劉建國等的方法[12-13],取紫球藻液,4 000 r/min離心15 min,棄上清液,將藻團(tuán)轉(zhuǎn)入到研磨器中,加入80%的丙酮溶液,研磨均勻,4 000 r/min 離心15 min,取上清液至容量瓶中,再將沉淀轉(zhuǎn)入研磨器中,重復(fù)上述操作,合并所有上清液并定容,450 nm 波長、1 cm光徑測定吸光度。

    β-胡蘿卜素含量=[D450 nm×稀釋倍數(shù)×10×1 000]÷2 500。公式中,10為所取藻液的體積,1 000為單位換算值,2 500 為β-胡蘿卜素系數(shù)。

    1.3.4 水溶性蛋白的測定

    1.3.4.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱取100 mg的牛血清蛋白溶于少量的無菌水中,并定容至100 mL容量瓶中,配制成1 000 μg/mL的母液,再分別稀釋制成不同濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(表1),分別吸取0.5 mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液置于 20 mL 的比色管中,加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑,反應(yīng)2 min后在1 cm光徑、595 nm波長處測定溶液的吸光度(表1),然后以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

    1.3.4.2 可溶性蛋白的提取與測定 取紫球藻液,5 000 r/min 離心10 min,棄上清液,分別用無菌水和 10 mmol/L、pH=6.8的磷酸鹽緩沖液沖洗藻團(tuán)1次,再將藻團(tuán)轉(zhuǎn)入到研缽中,并加入少許磷酸鹽緩沖液和0.05 g二氧化硅,在冰浴下充分研磨,5 000 r/min離心10 min,取上清液,即為可溶性蛋白的粗提取物,采用Bdarofdr法[14]測定其蛋白含量。

    1.3.5 多糖含量的測定

    1.3.5.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱取100 mg葡萄糖(烘干至恒質(zhì)量),溶于少量的無菌水中,并定容至100 mL容量瓶中,制成1 000 μg/mL的母液,再分別稀釋制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(表2)。以苯酚-硫酸法測定葡萄糖含量,取標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL,冰水浴一段時(shí)間后加入1 mL 6%的苯酚溶液,隨即加入5 mL的濃硫酸,反應(yīng)完全后在水浴鍋中加熱 20 min 使其充分反應(yīng),自然冷卻后490 nm波長、1 cm光徑測定吸光度(表2),以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。

    1.3.5.2 紫球藻多糖的制備與含量的測定 取紫球藻液,5 000 r/min 離心10 min,棄上清液,向藻細(xì)胞團(tuán)中加入 0.01 mol/L 的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)溶液,在磁力攪拌器上攪拌45 min,再加入同倍體積20%的三氯乙酸(TCA)溶液脫蛋白,4 ℃靜置過夜,5 000 r/min離心10 min,取上清液加入3倍體積的無水乙醇,4 ℃醇沉過夜,5 000 r/min離心 10 min,去上清液,將沉淀物裝入透析袋(透過分子量8 000),在無菌蒸餾水中透析24 h,透析后的溶液即為提取的多糖溶液。以無菌蒸餾水作為空白對照,用苯酚-硫酸法測定樣品多糖含量。

    1.3.6 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,在統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0中利用單因素方差分析(one-way ANOVA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較,標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著差異(P<0.05)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同濃度Fe3+對紫球藻生長的影響

    由圖3可知,各組紫球藻的生長趨勢基本相同,接種后各組的藻細(xì)胞都處于靜止適應(yīng)狀態(tài),從培養(yǎng)6 d開始,紫球藻進(jìn)入對數(shù)生長階段,生物量不斷增大,培養(yǎng)10 d紫球藻基本達(dá)到穩(wěn)定期,生長速度減慢。從紫球藻比生長率(表3)來看,紫球藻的生長狀況為處理組2>處理組3>處理組1>對照組>處理組4。Fe3+濃度在5×10-7~5×10-5 mol/L范圍內(nèi)時(shí)對紫球藻的生長具有促進(jìn)作用,以5×10-6 mol/L的Fe3+對紫球藻的生長促進(jìn)作用最大,其次是5×10-5 mol/L。5×10-4 mol/L 的Fe3+抑制了紫球藻的生長。

    2.2 不同濃度Fe3+對紫球藻葉綠素a含量的影響

    由圖4可知,紫球藻葉綠素a的含量在接種后基本保持不變,隨細(xì)胞濃度升高,葉綠素a的含量在培養(yǎng)6 d后逐漸升高,在培養(yǎng)10 d基本穩(wěn)定,隨后Fe3+濃度為5×10-4、5×10-5 mol/L 的處理組紫球藻葉綠素a含量還持續(xù)升高。單因素方差分析結(jié)果表明,在培養(yǎng)的前6 d,各處理組的葉綠素a含量差異不顯著(P>0.05),自培養(yǎng)8 d開始,5×10-5 mol/L處理組中紫球藻葉綠素a的含量顯著高于其他處理組及對照組(P<0.05)。

    2.3 不同濃度Fe3+對紫球藻β-胡蘿卜素含量的影響

    由圖5可知,紫球藻β-胡蘿卜素含量在接種后的一段時(shí)間里基本保持不變,隨細(xì)胞濃度升高,培養(yǎng)6 d后β-胡蘿卜素含量逐漸升高,但Fe3+濃度為5×10-4、5×10-5 mol/L的處理組β-胡蘿卜素含量升高的速率比對照組和Fe3+濃度為5×10-6、5×10-7 mol/L的處理組快。單因素方差分析結(jié)果表明,在培養(yǎng)的前6 d,各處理組的β-胡蘿卜素含量差異不顯著(P>0.05),自培養(yǎng)8 d開始,5×10-5 mol/L處理組中紫球藻β-胡蘿卜素含量顯著高于其他處理組及對照組(P<0.05)。

    2.4 不同濃度Fe3+對紫球藻可溶性蛋白含量的影響

    由圖6可知,在培養(yǎng)的前8 d,各處理組可溶性蛋白含量與對照組無顯著差異(P>0.05),在培養(yǎng)10 d,F(xiàn)e3+濃度為 5×10-5 mol/L處理組的紫球藻可溶性蛋白含量顯著高于其他處理組及對照組(P<0.05),在培養(yǎng)12、14 d,各處理組的可溶性蛋白含量與對照組相比均有顯著升高(P<0.05),添加不同濃度的Fe3+可以有效地促進(jìn)紫球藻可溶性蛋白的分泌。

    2.5 不同濃度Fe3+對紫球藻胞外多糖積累的影響

    由圖7可知,紫球藻胞外多糖含量在接種后的一段時(shí)間里基本保持不變,隨細(xì)胞濃度升高,從培養(yǎng)8 d開始,胞外多糖含量逐漸升高,在培養(yǎng)10 d基本達(dá)到穩(wěn)定。在培養(yǎng)的前 8 d,對照組與各處理組的胞外多糖含量差異不顯著(P>0.05),自培養(yǎng)8 d開始,各處理組胞外多糖含量出現(xiàn)差異,但差異不顯著(P>0.05),在培養(yǎng)10、12、14 d,各處理組與對照組的胞外多糖含量幾乎保持穩(wěn)定,但添加Fe3+的濃度越高,紫球藻胞外多糖的積累量越多。

    3 討論

    相關(guān)研究表明,F(xiàn)e對藻類的影響不僅取決于Fe的含量,更重要的是取決于它轉(zhuǎn)化成生物活性形式的速度以及藻類的有效吸收[1]。本試驗(yàn)研究表明,不同F(xiàn)e3+濃度下紫球藻的生長趨勢基本相同,在試驗(yàn)所涉及的Fe3+濃度范圍內(nèi),隨著Fe3+濃度升高,生長促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng),但并不是Fe3+濃度越高越好,適量的Fe3+(5×10-6、5×10-5 mol/L)會(huì)促進(jìn)紫球藻的生長,但Fe3+濃度增加到一定濃度(5×10-4 mol/L)后,紫球藻細(xì)胞的促進(jìn)作用開始減弱,甚至抑制了紫球藻的生長。Fe3+濃度高抑制了紫球藻細(xì)胞生長的原因可能為Fe3+過高時(shí),藻類光合作用效率下降,表現(xiàn)在葉綠素a含量的下降、細(xì)胞變小、細(xì)胞分裂率和生長率均下降[1]。劉丹楹等指出,紫球藻生長的最適Fe3+濃度為1×10-5 mol/L,其次為 5×10-6 mol/L[14],本試驗(yàn)結(jié)果與之相似。由此可見,最適紫球藻生長的Fe3+濃度為1×10-5~5×10-5 mol/L,這為實(shí)際生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)參考。

    藻體中色素含量的多少直接影響藻體的光合作用的能力[13],同時(shí)Fe是藻類細(xì)胞光合色素合成不可缺少的元素,F(xiàn)e3+添加量較低時(shí),紫球藻活性物質(zhì)的積累量少,這是因?yàn)镕e不足會(huì)影響細(xì)胞代謝活動(dòng)中一些重要的酶的合成或降低其催化活性[1]。隨著Fe3+添加量的升高,紫球藻主要色素葉綠素a和胡蘿卜素的含量明顯增多,本試驗(yàn)Fe3+最適濃度為5×10-5 mol/L。

    藻膽蛋白是藍(lán)藻、紅藻和隱藻光合作用的捕光色素,主要包括藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白,其中藻紅蛋白是十分有開發(fā)前景的一員。紫球藻細(xì)胞內(nèi)含有豐富的藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白,且以藻紅蛋白含量最多。紫球藻的生長環(huán)境會(huì)影響藻膽蛋白的含量,僅見少數(shù)報(bào)道[13-14]。在本試驗(yàn)中,紫球藻的可溶性蛋白在培養(yǎng)的中后期開始明顯升高。王明茲等指出,隨著紫球藻生長周期中細(xì)胞濃度的升高,可見光在培養(yǎng)液中的穿透和擴(kuò)散受到了影響,細(xì)胞僅由葉綠素吸收光能而不能滿足細(xì)胞代謝的需要,藻細(xì)胞在對數(shù)晚期開始積累代謝產(chǎn)物——藻膽蛋白[13],這在一定程度上解釋了本試驗(yàn)紫球藻可溶性蛋白含量在其對數(shù)生長期后期開始明顯升高的現(xiàn)象。本試驗(yàn)中,有利于紫球藻水溶性蛋白積累的Fe3+濃度為 5×10-5 mol/L,這與劉丹楹等的結(jié)果[14]相似。在通入1%二氧化碳后,紫球藻的水溶性蛋白含量顯著降低,不過在補(bǔ)加氮源后,紫球藻水溶性蛋白含量明顯升高[11]。

    紫球藻細(xì)胞外包圍著一層黏質(zhì)鞘,即細(xì)胞分泌出來的水溶性黏多糖,該多糖是一類由葡萄糖、木糖和半乳糖等單糖組成的易溶于水的多聚體。它是1種磺酸化多糖,在抗病毒、抗腫瘤、抗血脂、抗菌等方面具有特殊的生物活性作用。紫球藻多糖的產(chǎn)量和提取效率低、制備成本高限制了該多糖的大規(guī)模開發(fā)應(yīng)用[15]。因此,對不同生態(tài)條件下紫球藻多糖產(chǎn)量的研究具有十分重要的意義。盡管本試驗(yàn)中4個(gè)Fe3+處理組的紫球藻胞外多糖產(chǎn)量與對照組之間不存在顯著差異,但其產(chǎn)量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長和Fe3+濃度的升高而增大,說明Fe3+加富對紫球藻胞外多糖的分泌有著一定的促進(jìn)作用。由于紫球藻胞外多糖通過高爾基體合成并分泌到胞外,因此其產(chǎn)量受到培養(yǎng)條件的明顯影響[16]。因此,篩選適宜的培養(yǎng)條件對獲取紫球藻胞外多糖具有重要的作用。韓娟等在培養(yǎng)紫球藻時(shí)通入1%的二氧化碳,可以顯著提高紫球藻的活性物質(zhì)積累,其多糖含量最高可達(dá)238.8 mg/L,且在補(bǔ)加氮源后,其胞外多糖和水溶性蛋白的含量均顯著升高[11]。王明茲等指出,1 060 nm的激光照射可以使紫球藻多糖的分泌量提高 50%~150%[8]。此外,有研究表明,高鹽度對紫球藻胞外多糖的分泌具有一定的刺激作用,尤其在鹽度5%時(shí),胞外多糖的分泌量顯著增大[17],使藻細(xì)胞表面的外被增厚,有利于細(xì)胞形成表面的微環(huán)境,防治由于鹽度過高造成的細(xì)胞水分丟失,這是細(xì)胞防止離子毒害的機(jī)制之一[18]。

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