• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    鐵對紫球藻生長及可溶性蛋白和胞外多糖含量的影響

    2017-02-27 11:21:34谷兵張達(dá)娟王沂
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年1期

    谷兵+張達(dá)娟+王沂

    摘要:通過研究不同鐵離子濃度條件下紫球藻的比生長率、主要葉綠素含量、可溶性蛋白及胞外多糖含量的變化情況,來闡述鐵離子對紫球藻生長的影響。結(jié)果表明,添加不同濃度的Fe3+對紫球藻的生長有明顯的促進(jìn)作用;Fe3+濃度在5×10-7~5×10-5 mol/L范圍內(nèi)時(shí),紫球藻的生長和葉綠素a、β-胡蘿卜素、可溶性蛋白、胞外多糖的積累隨Fe3+濃度的升高而增加,當(dāng)Fe3+濃度為5×10-4 mol/L時(shí),紫球藻的生長較為緩慢,其細(xì)胞密度略低于其他處理及對照組,且上述各指標(biāo)均與5×10-5 mol/L處理組之間無顯著差異。因此,紫球藻培養(yǎng)中鐵的最適添加濃度約為5×10-5 mol/L。

    關(guān)鍵詞:紫球藻;鐵;可溶性蛋白;胞外多糖

    中圖分類號(hào): S968.43+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2017)01-0159-04

    鐵是浮游植物的微量營養(yǎng)元素和催化元素,是浮游植物生長的關(guān)鍵限制因子之一,影響著浮游植物的電子傳遞、氧的新陳代謝、氮的吸收利用、呼吸作用和光合作用[1],且在海洋“生物泵”循環(huán)過程起著關(guān)鍵作用[2]。20世紀(jì)30年代初,研究學(xué)者提出鐵是海洋浮游植物生長的潛在性限制因子[3-6]。李麗研究了鐵離子對三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、小球藻CS-01(Chlorella sorokiniana CS-01)和等鞭金藻(Isocrydid galbana)生長和脂質(zhì)積累的影響,發(fā)現(xiàn)鐵對這3株微藻的生長和脂質(zhì)積累均有促進(jìn)作用,同時(shí)還比較研究了鐵、鎂、銅、鈣對小球藻生長和脂質(zhì)積累的影響,其中鐵離子的影響最為顯著[7]。王培磊等研究了鐵對鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)生長和β-胡蘿卜素積累的影響,結(jié)果表明,較高濃度的鐵有利于其β-胡蘿卜素的積累[1]。

    紫球藻(Porphyridium cruentum)細(xì)胞呈圓形或卵圓形,外披黏質(zhì)的鞘膜,隸屬于紅藻門(Rhodophyta)原紅藻綱(Protofloridcophyceac)紫球藻目(Porphyridiales)紫球藻科(Porphyridiaceae)紫球藻屬(Porphyridium),是紅藻門中唯一的單細(xì)胞藻類,紫球藻廣泛分布于海水、淡水、咸水及潮濕的土壤中[8]。關(guān)于紫球藻的研究主要集中在培養(yǎng)工藝的優(yōu)化改良和多種生物活性物質(zhì)的開發(fā)利用方面[9]。已有相關(guān)文獻(xiàn)研究表明[10],基于藻類的光合作用效率和生長潛能,1 hm2大小的土地理論上計(jì)算可以生產(chǎn)超過30 000 L,即200桶油的量,相當(dāng)于同樣土地上大豆產(chǎn)油量的100倍,而紫球藻生長快、繁殖周期短,且抗鹽性強(qiáng),具廣闊的應(yīng)用前景及較大的潛在市場。本研究主要探討了不同濃度的鐵離子對紫球藻比生長率和葉綠素a、β-胡蘿卜素、可溶性蛋白、胞外多糖含量的影響,以期為進(jìn)一步探討紫球藻的培養(yǎng)條件以及生物活性物質(zhì)的提取提供有益參考。

    目前,國內(nèi)外關(guān)于海藻多糖的研究主要集中在其組成、結(jié)構(gòu)分析、生理活性及藥理試驗(yàn)等方面,而對于影響或促進(jìn)海藻多糖合成和分泌的外界物理因子的研究相對比較少。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)藻種

    紫球藻藻種,由中國科學(xué)院水生生物研究所藻種庫提供。

    1.2 培養(yǎng)條件

    試驗(yàn)采用f/2培養(yǎng)基,以自然光照為光源,光—暗周期為12 h—12 h,光照度為2 000~2 500 μmol/(m2·s),培養(yǎng)溫度為(27±2) ℃。設(shè)置對照組和4個(gè)處理組,處理組培養(yǎng)基中鐵離子濃度分別為5×10-7、5×10-6、5×10-5、5×10-4 mol/L,每組分別設(shè)置3個(gè)平行,按10%的量接種紫球藻液,試驗(yàn)進(jìn)行培養(yǎng)周期為14 d,每2 d取樣1次測定相關(guān)指標(biāo)。

    1.3 各項(xiàng)指標(biāo)的測定及方法

    1.3.1 紫球藻比生長率的測定 用血球計(jì)數(shù)板記錄紫球藻細(xì)胞數(shù),每個(gè)重復(fù)均需要測定后取平均數(shù)。

    相對生長率=ln(X2-X1)/(T2-T1)。

    式中:X1和X2分別代表T1和T2時(shí)紫球藻細(xì)胞的濃度。

    1.3.2 葉綠素a的提取與測定 參考韓娟等的方法[11],取紫球藻液,4 500 r/min離心5 min,棄上清液,藻團(tuán)中加入甲醇振蕩混勻,70 ℃水浴振蕩5 min,自然冷卻后4 500 r/min離心5 min取上清液,即為紫球藻葉綠素a提取液,1 cm光徑下測定750、665 nm波長處的吸光度。

    葉綠素a含量=13.9×(D665 nm-D750 nm)×V1/V2。

    式中:V1為最終體積,V2為取樣體積,13.9為相關(guān)系數(shù)。

    1.3.3 β-胡蘿卜素的提取與測定 參考劉建國等的方法[12-13],取紫球藻液,4 000 r/min離心15 min,棄上清液,將藻團(tuán)轉(zhuǎn)入到研磨器中,加入80%的丙酮溶液,研磨均勻,4 000 r/min 離心15 min,取上清液至容量瓶中,再將沉淀轉(zhuǎn)入研磨器中,重復(fù)上述操作,合并所有上清液并定容,450 nm 波長、1 cm光徑測定吸光度。

    β-胡蘿卜素含量=[D450 nm×稀釋倍數(shù)×10×1 000]÷2 500。公式中,10為所取藻液的體積,1 000為單位換算值,2 500 為β-胡蘿卜素系數(shù)。

    1.3.4 水溶性蛋白的測定

    1.3.4.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱取100 mg的牛血清蛋白溶于少量的無菌水中,并定容至100 mL容量瓶中,配制成1 000 μg/mL的母液,再分別稀釋制成不同濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(表1),分別吸取0.5 mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液置于 20 mL 的比色管中,加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑,反應(yīng)2 min后在1 cm光徑、595 nm波長處測定溶液的吸光度(表1),然后以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

    1.3.4.2 可溶性蛋白的提取與測定 取紫球藻液,5 000 r/min 離心10 min,棄上清液,分別用無菌水和 10 mmol/L、pH=6.8的磷酸鹽緩沖液沖洗藻團(tuán)1次,再將藻團(tuán)轉(zhuǎn)入到研缽中,并加入少許磷酸鹽緩沖液和0.05 g二氧化硅,在冰浴下充分研磨,5 000 r/min離心10 min,取上清液,即為可溶性蛋白的粗提取物,采用Bdarofdr法[14]測定其蛋白含量。

    1.3.5 多糖含量的測定

    1.3.5.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱取100 mg葡萄糖(烘干至恒質(zhì)量),溶于少量的無菌水中,并定容至100 mL容量瓶中,制成1 000 μg/mL的母液,再分別稀釋制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(表2)。以苯酚-硫酸法測定葡萄糖含量,取標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL,冰水浴一段時(shí)間后加入1 mL 6%的苯酚溶液,隨即加入5 mL的濃硫酸,反應(yīng)完全后在水浴鍋中加熱 20 min 使其充分反應(yīng),自然冷卻后490 nm波長、1 cm光徑測定吸光度(表2),以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。

    1.3.5.2 紫球藻多糖的制備與含量的測定 取紫球藻液,5 000 r/min 離心10 min,棄上清液,向藻細(xì)胞團(tuán)中加入 0.01 mol/L 的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)溶液,在磁力攪拌器上攪拌45 min,再加入同倍體積20%的三氯乙酸(TCA)溶液脫蛋白,4 ℃靜置過夜,5 000 r/min離心10 min,取上清液加入3倍體積的無水乙醇,4 ℃醇沉過夜,5 000 r/min離心 10 min,去上清液,將沉淀物裝入透析袋(透過分子量8 000),在無菌蒸餾水中透析24 h,透析后的溶液即為提取的多糖溶液。以無菌蒸餾水作為空白對照,用苯酚-硫酸法測定樣品多糖含量。

    1.3.6 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,在統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0中利用單因素方差分析(one-way ANOVA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較,標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著差異(P<0.05)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同濃度Fe3+對紫球藻生長的影響

    由圖3可知,各組紫球藻的生長趨勢基本相同,接種后各組的藻細(xì)胞都處于靜止適應(yīng)狀態(tài),從培養(yǎng)6 d開始,紫球藻進(jìn)入對數(shù)生長階段,生物量不斷增大,培養(yǎng)10 d紫球藻基本達(dá)到穩(wěn)定期,生長速度減慢。從紫球藻比生長率(表3)來看,紫球藻的生長狀況為處理組2>處理組3>處理組1>對照組>處理組4。Fe3+濃度在5×10-7~5×10-5 mol/L范圍內(nèi)時(shí)對紫球藻的生長具有促進(jìn)作用,以5×10-6 mol/L的Fe3+對紫球藻的生長促進(jìn)作用最大,其次是5×10-5 mol/L。5×10-4 mol/L 的Fe3+抑制了紫球藻的生長。

    2.2 不同濃度Fe3+對紫球藻葉綠素a含量的影響

    由圖4可知,紫球藻葉綠素a的含量在接種后基本保持不變,隨細(xì)胞濃度升高,葉綠素a的含量在培養(yǎng)6 d后逐漸升高,在培養(yǎng)10 d基本穩(wěn)定,隨后Fe3+濃度為5×10-4、5×10-5 mol/L 的處理組紫球藻葉綠素a含量還持續(xù)升高。單因素方差分析結(jié)果表明,在培養(yǎng)的前6 d,各處理組的葉綠素a含量差異不顯著(P>0.05),自培養(yǎng)8 d開始,5×10-5 mol/L處理組中紫球藻葉綠素a的含量顯著高于其他處理組及對照組(P<0.05)。

    2.3 不同濃度Fe3+對紫球藻β-胡蘿卜素含量的影響

    由圖5可知,紫球藻β-胡蘿卜素含量在接種后的一段時(shí)間里基本保持不變,隨細(xì)胞濃度升高,培養(yǎng)6 d后β-胡蘿卜素含量逐漸升高,但Fe3+濃度為5×10-4、5×10-5 mol/L的處理組β-胡蘿卜素含量升高的速率比對照組和Fe3+濃度為5×10-6、5×10-7 mol/L的處理組快。單因素方差分析結(jié)果表明,在培養(yǎng)的前6 d,各處理組的β-胡蘿卜素含量差異不顯著(P>0.05),自培養(yǎng)8 d開始,5×10-5 mol/L處理組中紫球藻β-胡蘿卜素含量顯著高于其他處理組及對照組(P<0.05)。

    2.4 不同濃度Fe3+對紫球藻可溶性蛋白含量的影響

    由圖6可知,在培養(yǎng)的前8 d,各處理組可溶性蛋白含量與對照組無顯著差異(P>0.05),在培養(yǎng)10 d,F(xiàn)e3+濃度為 5×10-5 mol/L處理組的紫球藻可溶性蛋白含量顯著高于其他處理組及對照組(P<0.05),在培養(yǎng)12、14 d,各處理組的可溶性蛋白含量與對照組相比均有顯著升高(P<0.05),添加不同濃度的Fe3+可以有效地促進(jìn)紫球藻可溶性蛋白的分泌。

    2.5 不同濃度Fe3+對紫球藻胞外多糖積累的影響

    由圖7可知,紫球藻胞外多糖含量在接種后的一段時(shí)間里基本保持不變,隨細(xì)胞濃度升高,從培養(yǎng)8 d開始,胞外多糖含量逐漸升高,在培養(yǎng)10 d基本達(dá)到穩(wěn)定。在培養(yǎng)的前 8 d,對照組與各處理組的胞外多糖含量差異不顯著(P>0.05),自培養(yǎng)8 d開始,各處理組胞外多糖含量出現(xiàn)差異,但差異不顯著(P>0.05),在培養(yǎng)10、12、14 d,各處理組與對照組的胞外多糖含量幾乎保持穩(wěn)定,但添加Fe3+的濃度越高,紫球藻胞外多糖的積累量越多。

    3 討論

    相關(guān)研究表明,F(xiàn)e對藻類的影響不僅取決于Fe的含量,更重要的是取決于它轉(zhuǎn)化成生物活性形式的速度以及藻類的有效吸收[1]。本試驗(yàn)研究表明,不同F(xiàn)e3+濃度下紫球藻的生長趨勢基本相同,在試驗(yàn)所涉及的Fe3+濃度范圍內(nèi),隨著Fe3+濃度升高,生長促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng),但并不是Fe3+濃度越高越好,適量的Fe3+(5×10-6、5×10-5 mol/L)會(huì)促進(jìn)紫球藻的生長,但Fe3+濃度增加到一定濃度(5×10-4 mol/L)后,紫球藻細(xì)胞的促進(jìn)作用開始減弱,甚至抑制了紫球藻的生長。Fe3+濃度高抑制了紫球藻細(xì)胞生長的原因可能為Fe3+過高時(shí),藻類光合作用效率下降,表現(xiàn)在葉綠素a含量的下降、細(xì)胞變小、細(xì)胞分裂率和生長率均下降[1]。劉丹楹等指出,紫球藻生長的最適Fe3+濃度為1×10-5 mol/L,其次為 5×10-6 mol/L[14],本試驗(yàn)結(jié)果與之相似。由此可見,最適紫球藻生長的Fe3+濃度為1×10-5~5×10-5 mol/L,這為實(shí)際生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)參考。

    藻體中色素含量的多少直接影響藻體的光合作用的能力[13],同時(shí)Fe是藻類細(xì)胞光合色素合成不可缺少的元素,F(xiàn)e3+添加量較低時(shí),紫球藻活性物質(zhì)的積累量少,這是因?yàn)镕e不足會(huì)影響細(xì)胞代謝活動(dòng)中一些重要的酶的合成或降低其催化活性[1]。隨著Fe3+添加量的升高,紫球藻主要色素葉綠素a和胡蘿卜素的含量明顯增多,本試驗(yàn)Fe3+最適濃度為5×10-5 mol/L。

    藻膽蛋白是藍(lán)藻、紅藻和隱藻光合作用的捕光色素,主要包括藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白,其中藻紅蛋白是十分有開發(fā)前景的一員。紫球藻細(xì)胞內(nèi)含有豐富的藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白,且以藻紅蛋白含量最多。紫球藻的生長環(huán)境會(huì)影響藻膽蛋白的含量,僅見少數(shù)報(bào)道[13-14]。在本試驗(yàn)中,紫球藻的可溶性蛋白在培養(yǎng)的中后期開始明顯升高。王明茲等指出,隨著紫球藻生長周期中細(xì)胞濃度的升高,可見光在培養(yǎng)液中的穿透和擴(kuò)散受到了影響,細(xì)胞僅由葉綠素吸收光能而不能滿足細(xì)胞代謝的需要,藻細(xì)胞在對數(shù)晚期開始積累代謝產(chǎn)物——藻膽蛋白[13],這在一定程度上解釋了本試驗(yàn)紫球藻可溶性蛋白含量在其對數(shù)生長期后期開始明顯升高的現(xiàn)象。本試驗(yàn)中,有利于紫球藻水溶性蛋白積累的Fe3+濃度為 5×10-5 mol/L,這與劉丹楹等的結(jié)果[14]相似。在通入1%二氧化碳后,紫球藻的水溶性蛋白含量顯著降低,不過在補(bǔ)加氮源后,紫球藻水溶性蛋白含量明顯升高[11]。

    紫球藻細(xì)胞外包圍著一層黏質(zhì)鞘,即細(xì)胞分泌出來的水溶性黏多糖,該多糖是一類由葡萄糖、木糖和半乳糖等單糖組成的易溶于水的多聚體。它是1種磺酸化多糖,在抗病毒、抗腫瘤、抗血脂、抗菌等方面具有特殊的生物活性作用。紫球藻多糖的產(chǎn)量和提取效率低、制備成本高限制了該多糖的大規(guī)模開發(fā)應(yīng)用[15]。因此,對不同生態(tài)條件下紫球藻多糖產(chǎn)量的研究具有十分重要的意義。盡管本試驗(yàn)中4個(gè)Fe3+處理組的紫球藻胞外多糖產(chǎn)量與對照組之間不存在顯著差異,但其產(chǎn)量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長和Fe3+濃度的升高而增大,說明Fe3+加富對紫球藻胞外多糖的分泌有著一定的促進(jìn)作用。由于紫球藻胞外多糖通過高爾基體合成并分泌到胞外,因此其產(chǎn)量受到培養(yǎng)條件的明顯影響[16]。因此,篩選適宜的培養(yǎng)條件對獲取紫球藻胞外多糖具有重要的作用。韓娟等在培養(yǎng)紫球藻時(shí)通入1%的二氧化碳,可以顯著提高紫球藻的活性物質(zhì)積累,其多糖含量最高可達(dá)238.8 mg/L,且在補(bǔ)加氮源后,其胞外多糖和水溶性蛋白的含量均顯著升高[11]。王明茲等指出,1 060 nm的激光照射可以使紫球藻多糖的分泌量提高 50%~150%[8]。此外,有研究表明,高鹽度對紫球藻胞外多糖的分泌具有一定的刺激作用,尤其在鹽度5%時(shí),胞外多糖的分泌量顯著增大[17],使藻細(xì)胞表面的外被增厚,有利于細(xì)胞形成表面的微環(huán)境,防治由于鹽度過高造成的細(xì)胞水分丟失,這是細(xì)胞防止離子毒害的機(jī)制之一[18]。

    參考文獻(xiàn):

    [1]王培磊,劉明河,張學(xué)成,等. Fe對兩株鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)生長和β-胡蘿卜素積累的影響[J]. 食品研究與開發(fā),2007,28(5):39-43.

    [2]金 心,石廣玉. 生物泵在海洋碳循環(huán)中的作用[J]. 大氣科學(xué),2001,25(5):683-688.

    [3]Coale K H,Johnson K S,F(xiàn)itzwater S E,et al.A massive phytoplankton bloom induced by an ecosystem-scale iron fertilization experiment in the equatorial Pacific Ocean[J]. Nature,1996,383:495-501.

    [4]Hutchins D A,Ditullio G R,Zhang Y,et al.An iron limitation mosaic in the California upwelling regime[J]. Limnology and Oceanography,1998,43(6):1037-1054.

    [5]Flynn K J,Hipkin C R. Interactions between iron,light,ammonium and nitrite:insights from the construction of a dynamic model of algal physiology[J]. Journal of Phycology,1999,35(6):1171-1190.

    [6]Geider R J. Complex lessons of iron uptake[J]. Nature,1999,400(400):815-816.

    [7]李 麗. 鐵離子對三株典型微藻生長和脂質(zhì)積累及相關(guān)基因表達(dá)的影響研究[D]. 長沙:中南大學(xué),2010:10-19.

    [8]王明茲,施巧琴,鄭梅清,等. 紫球藻的培養(yǎng)與利用(綜述)[J]. 亞熱帶植物科學(xué),2001,30(2):66-69.

    [9]鄭彩云,盧偉婷,王 艷,等. 不同氮濃度對紫球藻生長及藻膽蛋白和葉綠素a含量變化的影響[J]. 中國釀造,2013,32(6):133-135.

    [10]趙 薇. 紫球藻脂肪酸代謝調(diào)控[D]. 福州:福建師范大學(xué),2009:12-27.

    [11]韓 娟,王江宏,李愛芬,等. 通入CO2和補(bǔ)加氮源對紫球藻生長和代謝物質(zhì)積累的影響[J]. 生態(tài)科學(xué),2013,32(1):51-56.

    [12]劉建國,趙學(xué)武,王玉君,等. 脅迫條件下鹽藻β-胡蘿卜素及其異構(gòu)體累積的研究[J]. 海洋與湖沼,1994,25(1):71-72.

    [13]王明茲,施曉琴,陳必鏈,等. 紫球藻生長周期可見光吸收光譜與生化變化[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(4):23-26.

    [14]劉丹楹,陸 波,李玲玉. Fe3+對紫球藻生長及蛋白質(zhì)和β-胡蘿卜素含量的影響[J]. 資源開發(fā)與市場,2013,29(5):464-466.

    [15]李 戰(zhàn). 三種紫球藻培養(yǎng)、胞外多糖提取及RAPD分析[D]. 上海:上海師范大學(xué),2004:37-42.

    [16]王長海. 紫球藻及其應(yīng)用研究[J]. 海洋通報(bào),1998,17(3):79-84.

    [17]劉洪艷,王 麟. 不同NaCl濃度對紫球藻生長及生化組分含量的影響[J]. 鹽業(yè)與化工,2008,37(5):35-37,43.

    [18]賈順義. 不同鹽度及氮磷濃度對紫球藻生長代謝的影響[D]. 大連:大連理工大學(xué),2006:28-35.張永福,牛燕芬,任 禛,等. 外源SA、6-BA對藠頭鱗莖耐貯性及貯藏品質(zhì)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,45(1):163-166.

    欧美另类亚洲清纯唯美| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 成年女人毛片免费观看观看9 | 色在线成人网| 成人国产一区最新在线观看| 搡老岳熟女国产| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 精品一品国产午夜福利视频| 一进一出好大好爽视频| 超碰97精品在线观看| 午夜久久久在线观看| 精品视频人人做人人爽| 欧美亚洲日本最大视频资源| 黄色视频在线播放观看不卡| 超碰成人久久| 男男h啪啪无遮挡| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲九九香蕉| 亚洲精品美女久久av网站| 精品人妻1区二区| 麻豆乱淫一区二区| 精品久久久精品久久久| 色播在线永久视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产高清国产精品国产三级| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产不卡一卡二| 国产精品久久久久久精品古装| 精品国产国语对白av| 国产一区二区 视频在线| 男女边摸边吃奶| 91成年电影在线观看| 一进一出好大好爽视频| 亚洲精品一二三| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲中文字幕日韩| 日韩一区二区三区影片| 亚洲专区国产一区二区| 午夜激情av网站| 一区二区三区乱码不卡18| 在线观看免费高清a一片| 黄片播放在线免费| 色尼玛亚洲综合影院| 一夜夜www| av天堂久久9| 精品国内亚洲2022精品成人 | 九色亚洲精品在线播放| 男男h啪啪无遮挡| 大香蕉久久成人网| 午夜久久久在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 水蜜桃什么品种好| 老熟女久久久| 在线观看一区二区三区激情| 久久久水蜜桃国产精品网| 一个人免费在线观看的高清视频| 女人久久www免费人成看片| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲五月婷婷丁香| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 一区二区av电影网| av天堂久久9| 他把我摸到了高潮在线观看 | 精品人妻熟女毛片av久久网站| 日韩欧美一区视频在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产精品久久久久成人av| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| www.999成人在线观看| 中文字幕制服av| 色综合婷婷激情| 久久精品国产亚洲av高清一级| 丝袜美足系列| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美久久黑人一区二区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| av国产精品久久久久影院| 最近最新中文字幕大全电影3 | avwww免费| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产精品国产av在线观看| 国产在线视频一区二区| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲精品乱久久久久久| 黄色怎么调成土黄色| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产免费现黄频在线看| 超色免费av| 最黄视频免费看| 搡老乐熟女国产| 亚洲午夜理论影院| 成人特级黄色片久久久久久久 | 天堂俺去俺来也www色官网| 精品人妻在线不人妻| 精品久久久久久久毛片微露脸| a在线观看视频网站| 中文字幕人妻熟女乱码| 美女扒开内裤让男人捅视频| 丝袜美足系列| 午夜福利视频在线观看免费| 深夜精品福利| 日本a在线网址| 国产精品偷伦视频观看了| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产精品九九99| 欧美精品一区二区大全| 国产高清videossex| 国产亚洲精品一区二区www | 国产精品1区2区在线观看. | 国产精品免费视频内射| 9191精品国产免费久久| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 18禁国产床啪视频网站| 久久香蕉激情| 多毛熟女@视频| 老司机福利观看| 国产免费av片在线观看野外av| 久久国产精品人妻蜜桃| 中文欧美无线码| 大型av网站在线播放| 国产午夜精品久久久久久| 性色av乱码一区二区三区2| 两性夫妻黄色片| 亚洲国产av影院在线观看| 在线永久观看黄色视频| 老汉色∧v一级毛片| 女性被躁到高潮视频| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 51午夜福利影视在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 婷婷成人精品国产| 不卡av一区二区三区| 色婷婷av一区二区三区视频| cao死你这个sao货| 久久av网站| 12—13女人毛片做爰片一| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 色播在线永久视频| netflix在线观看网站| 精品第一国产精品| 美女扒开内裤让男人捅视频| 中亚洲国语对白在线视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 日韩三级视频一区二区三区| 久久久欧美国产精品| 午夜福利乱码中文字幕| 国产精品久久久av美女十八| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲精品在线观看二区| 精品人妻1区二区| 日本五十路高清| 免费看a级黄色片| 精品人妻在线不人妻| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 1024香蕉在线观看| 欧美在线黄色| 一区二区三区激情视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 最新的欧美精品一区二区| 午夜老司机福利片| 精品国产乱子伦一区二区三区| 啦啦啦在线免费观看视频4| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 精品久久蜜臀av无| 久久中文字幕人妻熟女| 乱人伦中国视频| 老司机亚洲免费影院| 国产成+人综合+亚洲专区| 日韩中文字幕视频在线看片| 99热网站在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| 在线av久久热| 亚洲人成伊人成综合网2020| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 中文欧美无线码| 久久免费观看电影| 久久性视频一级片| 成人精品一区二区免费| 一区二区三区乱码不卡18| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 美女高潮到喷水免费观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲五月婷婷丁香| 国产av国产精品国产| 天堂俺去俺来也www色官网| 91老司机精品| 亚洲色图av天堂| 在线观看一区二区三区激情| cao死你这个sao货| 人人澡人人妻人| 国产精品亚洲一级av第二区| 免费在线观看完整版高清| 日本一区二区免费在线视频| 久久久国产一区二区| 水蜜桃什么品种好| av视频免费观看在线观看| 在线看a的网站| 成年女人毛片免费观看观看9 | 精品人妻在线不人妻| 黄色视频,在线免费观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 美女高潮到喷水免费观看| 麻豆av在线久日| 中文字幕最新亚洲高清| 建设人人有责人人尽责人人享有的| videos熟女内射| 午夜福利在线免费观看网站| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一级片'在线观看视频| 美国免费a级毛片| 涩涩av久久男人的天堂| 高清视频免费观看一区二区| 99精品久久久久人妻精品| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲精品自拍成人| 无人区码免费观看不卡 | 99九九在线精品视频| 男女免费视频国产| 黑人欧美特级aaaaaa片| 这个男人来自地球电影免费观看| avwww免费| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 青青草视频在线视频观看| 久久久久久久久免费视频了| 欧美国产精品一级二级三级| 精品一区二区三区av网在线观看 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 午夜激情久久久久久久| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产成人欧美| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久久国产成人免费| 国产精品一区二区在线不卡| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久人妻av系列| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲精品国产区一区二| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 午夜福利,免费看| 欧美乱妇无乱码| 色婷婷av一区二区三区视频| 在线看a的网站| 香蕉丝袜av| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产在视频线精品| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 一二三四社区在线视频社区8| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久久久久免费高清国产稀缺| 99久久人妻综合| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久精品亚洲av国产电影网| 美女福利国产在线| 亚洲精品国产色婷婷电影| 中文字幕制服av| 久久中文字幕人妻熟女| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲国产欧美网| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲精品在线美女| 久久久久久久国产电影| 在线看a的网站| 成年女人毛片免费观看观看9 | 日韩欧美国产一区二区入口| 国产av精品麻豆| av片东京热男人的天堂| 窝窝影院91人妻| 亚洲专区中文字幕在线| 中文字幕人妻丝袜制服| 黑人欧美特级aaaaaa片| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 99九九在线精品视频| 久久国产精品影院| 国产免费现黄频在线看| 免费在线观看黄色视频的| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美激情高清一区二区三区| 国产精品久久电影中文字幕 | 1024视频免费在线观看| 人妻久久中文字幕网| av线在线观看网站| 美女主播在线视频| 欧美成人午夜精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 黄色片一级片一级黄色片| 日日夜夜操网爽| 黄片小视频在线播放| 高清av免费在线| 久久久久网色| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 日韩欧美一区视频在线观看| 成年人黄色毛片网站| 久久久国产一区二区| 黄色视频在线播放观看不卡| 高清视频免费观看一区二区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 黄片播放在线免费| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产av精品麻豆| 日日夜夜操网爽| 国产精品久久久av美女十八| 波多野结衣一区麻豆| 国产国语露脸激情在线看| 国产高清国产精品国产三级| 老司机在亚洲福利影院| 日韩一区二区三区影片| av超薄肉色丝袜交足视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲午夜理论影院| 国产在线一区二区三区精| 在线永久观看黄色视频| 色综合婷婷激情| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲熟妇熟女久久| 男女边摸边吃奶| 精品国产乱码久久久久久男人| 两个人免费观看高清视频| 久久婷婷成人综合色麻豆| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 欧美精品亚洲一区二区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 日韩中文字幕欧美一区二区| 自线自在国产av| 国产免费av片在线观看野外av| 99re6热这里在线精品视频| 国产精品二区激情视频| 女人久久www免费人成看片| 后天国语完整版免费观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 人人澡人人妻人| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲第一青青草原| 午夜福利乱码中文字幕| 欧美国产精品va在线观看不卡| 最新的欧美精品一区二区| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 女警被强在线播放| 欧美精品av麻豆av| 免费在线观看日本一区| 午夜成年电影在线免费观看| 天天添夜夜摸| 精品人妻1区二区| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 又紧又爽又黄一区二区| 女性生殖器流出的白浆| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 亚洲全国av大片| 国产免费福利视频在线观看| 国产人伦9x9x在线观看| 午夜激情av网站| 成人免费观看视频高清| 国产精品欧美亚洲77777| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产黄色免费在线视频| 国产在视频线精品| 亚洲av日韩在线播放| 脱女人内裤的视频| 90打野战视频偷拍视频| 国产人伦9x9x在线观看| 中文字幕色久视频| 色视频在线一区二区三区| 亚洲国产欧美网| 国产高清激情床上av| 波多野结衣一区麻豆| 精品少妇久久久久久888优播| 国产伦人伦偷精品视频| 国产在线视频一区二区| 精品久久久久久电影网| av线在线观看网站| 在线观看免费日韩欧美大片| 成人精品一区二区免费| av欧美777| 一个人免费看片子| 精品久久久久久电影网| 久久国产精品影院| 国产又色又爽无遮挡免费看| 成年人免费黄色播放视频| 午夜久久久在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 日本黄色日本黄色录像| 中亚洲国语对白在线视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 乱人伦中国视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 亚洲五月色婷婷综合| 另类精品久久| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 亚洲国产成人一精品久久久| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 婷婷丁香在线五月| 自线自在国产av| 在线观看免费日韩欧美大片| 757午夜福利合集在线观看| 国产一卡二卡三卡精品| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲精品成人av观看孕妇| 黄色视频不卡| 丝袜美腿诱惑在线| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产高清激情床上av| 精品久久久久久电影网| 丰满少妇做爰视频| 91精品三级在线观看| 精品久久久久久电影网| 在线观看免费视频日本深夜| 国产av精品麻豆| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久国产精品影院| 黑丝袜美女国产一区| 91大片在线观看| 搡老岳熟女国产| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 99国产精品一区二区三区| 91成年电影在线观看| 两个人看的免费小视频| 久久精品国产a三级三级三级| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 91精品国产国语对白视频| 久久久欧美国产精品| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲七黄色美女视频| 两个人免费观看高清视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲精品av麻豆狂野| 9色porny在线观看| 久久婷婷成人综合色麻豆| 五月开心婷婷网| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产精品一区二区在线不卡| 蜜桃国产av成人99| 超碰成人久久| 热99久久久久精品小说推荐| 大陆偷拍与自拍| 最近最新中文字幕大全免费视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 欧美变态另类bdsm刘玥| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 天堂中文最新版在线下载| 国产单亲对白刺激| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 久久 成人 亚洲| 中文字幕最新亚洲高清| av不卡在线播放| 国产精品久久久人人做人人爽| 午夜福利乱码中文字幕| 国产精品免费一区二区三区在线 | 免费日韩欧美在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 极品教师在线免费播放| 精品福利永久在线观看| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产免费现黄频在线看| 老司机午夜十八禁免费视频| 无限看片的www在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产精品成人在线| 美女福利国产在线| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产精品二区激情视频| 日本vs欧美在线观看视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产在视频线精品| 色视频在线一区二区三区| 18禁美女被吸乳视频| 两性夫妻黄色片| 国产一区二区在线观看av| 黄色a级毛片大全视频| 欧美 日韩 精品 国产| 51午夜福利影视在线观看| 国产福利在线免费观看视频| 国产高清videossex| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 又紧又爽又黄一区二区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲成a人片在线一区二区| 99精品在免费线老司机午夜| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲成人手机| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产在线观看jvid| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲熟女精品中文字幕| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲成a人片在线一区二区| 色播在线永久视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 天天影视国产精品| 黄片大片在线免费观看| 高清在线国产一区| 激情视频va一区二区三区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久久精品94久久精品| 国产成人欧美在线观看 | 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 精品高清国产在线一区| 国产成人欧美| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 久久久久精品国产欧美久久久| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 9热在线视频观看99| 黑丝袜美女国产一区| 在线播放国产精品三级| 韩国精品一区二区三区| 三上悠亚av全集在线观看| 国产午夜精品久久久久久| 两性夫妻黄色片| 人人澡人人妻人| 久久天堂一区二区三区四区| 免费av中文字幕在线| 国产av一区二区精品久久| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 少妇的丰满在线观看| 国产1区2区3区精品| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产精品二区激情视频| 99re6热这里在线精品视频| 精品人妻在线不人妻| 女人精品久久久久毛片| 久久 成人 亚洲| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产黄频视频在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲性夜色夜夜综合| av电影中文网址| 亚洲av第一区精品v没综合| 午夜福利影视在线免费观看| 天堂中文最新版在线下载| 老司机午夜福利在线观看视频 | 香蕉丝袜av| av不卡在线播放| 国产成人欧美| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 亚洲国产欧美在线一区| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 美女午夜性视频免费| 99久久精品国产亚洲精品| videos熟女内射| 老司机影院毛片| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产野战对白在线观看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产成人免费观看mmmm| 丝袜在线中文字幕| 午夜久久久在线观看| 亚洲精品在线美女| 最黄视频免费看| 悠悠久久av| 国产熟女午夜一区二区三区| 中文亚洲av片在线观看爽 | 精品久久久久久久毛片微露脸| 久久这里只有精品19| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 99精品在免费线老司机午夜| 91精品三级在线观看| 高清欧美精品videossex| 亚洲伊人色综图| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产男靠女视频免费网站| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产精品熟女久久久久浪| 中文亚洲av片在线观看爽 | 久久久精品区二区三区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 日本vs欧美在线观看视频| 午夜日韩欧美国产| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 在线永久观看黄色视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美在线一区亚洲| 欧美国产精品va在线观看不卡| 动漫黄色视频在线观看| 电影成人av|