• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    大球蓋菇的分離純化及ITS序列鑒定

    2017-02-27 11:09:19張健張國權(quán)鄒莉
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年1期

    張健+張國權(quán)+鄒莉

    摘要:以吉林長白山地區(qū)的野生大球蓋菇為材料,對其進行1~5 h不同時間的晾曬處理,采用組織分離法分別對其菌蓋、菌蓋與菌柄交接處、菌柄上端和菌柄基部的組織進行分離純化,通過測定菌絲生長速度、生長勢和污染率等,篩選出分離純化的最適晾曬時間和最佳部位;設(shè)置5種液體培養(yǎng)基配方培養(yǎng)液體菌種,通過測定菌絲體生物量、菌絲球密度和形態(tài),篩選出最佳的液體培養(yǎng)基配方;最后將分離物進行ITS序列分析,計算遺傳距離,并采用鄰接法構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明,分離純化最適晾曬時間為2 h,最佳分離部位為菌蓋與菌柄交接處,此種情況下菌絲生長速度最快,菌絲長勢最好,污染率最低;最佳的液體培養(yǎng)基配方為A2,菌絲體生物量最高,菌絲球密度最大,形態(tài)最好;最后分離菌株經(jīng)ITS序列測定,系統(tǒng)發(fā)育分析證實其為大球蓋菇。

    關(guān)鍵詞:大球蓋菇;組織分離;ITS序列分析;系統(tǒng)發(fā)育分析

    中圖分類號: S646.904 文獻標志碼: A 文章編號:1002-1302(2017)01-0120-03

    大球蓋菇(Stropharia rugosoannulata)別稱酒紅球蓋菇、皺環(huán)球蓋菇,屬擔子菌門(Basidomycota)層菌綱(Hymenomycetes)傘菌目(Agaricales)球蓋菇科(Strophariaceae)球蓋菇屬(Stropharia),是國際菇類交易市場上十大菇類之一,也是聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)向發(fā)展中國家推薦栽培的特色食用菌之一[1]。大球蓋菇鮮菇色澤艷麗,肉質(zhì)脆嫩滑爽,干品氣味清香,營養(yǎng)豐富,具有很高的食用價值和藥用價值,頗受國內(nèi)外消費者歡迎,具有非常廣闊的發(fā)展前景。大球蓋菇的栽培管理較為粗放,對其冬閑田露地栽培[2]、大棚反季節(jié)栽培[3]、畦式栽培、層架式栽培、地坑式栽培等[4]多種栽培模式進行深入研究,對利用稻草、玉米秸稈、菌渣等不同栽培料栽培大球蓋菇也進行多樣化比較[5-8],取得了豐富的研究成果,但關(guān)于大球蓋菇母種的獲得、液體培養(yǎng)基配方的篩選以及如何對菌種進行準確鑒定還未見報道。ITS(internal transcribed spacer)是核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū),包括ITS1和ITS2兩部分,連同二者中間的5.8S rDNA基因組成ITS1-5.8S-ITS2結(jié)構(gòu),被廣泛應(yīng)用于真菌菌種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、條形碼和群體多樣性研究[9]。本研究對采自吉林長白山地區(qū)的野生大球蓋菇進行組織分離,獲取母種,篩選最適合液體菌種生長的培養(yǎng)基配方,并對子實體和分離菌株的ITS序列進行測序比對,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,旨在從分子水平上對大球蓋菇進行鑒定,進而為大球蓋菇的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    大球蓋菇子實體于2015年9月采自吉林省長白山地區(qū)。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 培養(yǎng)基的制備 研究使用的分離培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基,培養(yǎng)基制作方法如下:將馬鈴薯洗凈去皮,用電子天平稱取200 g切成1 cm3的小塊,用紗布包好后放入1 000 mL水中煮沸;待馬鈴薯塊軟化后撈出,加入葡萄糖20 g,瓊脂15 g,再次煮沸,加水補足 1 000 mL;再用雙層紗布過濾,倒入錐形瓶內(nèi);將瓶口用封口膜封好后,用高壓滅菌鍋121 ℃滅菌 20 min;滅菌結(jié)束后,待培養(yǎng)基溫度降至不燙手但未凝固時,在超凈工作臺內(nèi),定量倒入直徑為8 cm的培養(yǎng)皿中,裝液量為20 mL,凝固后備用。

    1.2.2 子實體晾曬時間對分離的影響 以剛采集到的部分野生大球蓋菇新鮮子實體作為對照,將大球蓋菇放置在充足陽光下晾曬,晾曬時間為10:00—15:00,分別取晾曬1、2、3、4、5 h的子實體和新鮮子實體進行組織分離。將菌蓋從中間撕開,挑取0.3 cm大小的菌肉組織接于PDA平板培養(yǎng)基中心部位,每個平板接1塊菌肉,蓋蓋后用封口膜封好,每組設(shè)置10個重復(fù),放置在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),每天觀察菌肉組織的萌發(fā)、污染以及菌絲生長情況。

    1.2.3 子實體不同部位對分離的影響 將分離要使用的解剖刀、鑷子、封口膜以及PDA平板放入超凈工作臺中進行紫外滅菌。將大球蓋菇經(jīng)處理后分離效果最好的子實體,用75%乙醇擦拭表面2~3遍,用無菌的解剖刀在菌蓋頂部中間劃口,用手撕開,注意避免手接觸到內(nèi)部的菌肉。用解剖刀分別在子實體菌蓋、菌蓋與菌柄交接處、菌柄上端和菌柄基部劃取一小塊組織,用無菌鑷子夾起,迅速放置于制備好的PDA平板培養(yǎng)基中心處,每個平板接1塊組織,每組設(shè)置10個重復(fù),封口膜封口后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),每天觀察并記錄組織體的萌發(fā)情況、污染情況和菌絲生長情況。

    1.2.4 液體培養(yǎng)基的制備 研究共采用5種液體培養(yǎng)基研究培養(yǎng)基對菌絲生長的影響,各培養(yǎng)基制作方法如下。

    (1)基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基A1。將馬鈴薯洗凈去皮,稱取 300 g,切成1 cm3小塊,用紗布包好后放入1 500 mL水中煮沸;待馬鈴薯塊軟化后撈出,加入30 g葡萄糖、1.5 g KH2PO4和0.75 g MgSO4,再次煮沸;加水補足1 500 mL,再用雙層紗布過濾,倒入500 mL錐形瓶內(nèi),每個錐形瓶分裝300 mL液體培養(yǎng)基;封口膜封口后,放入高壓滅菌鍋內(nèi),121 ℃滅菌 30 min 以備用。(2)加富液體培養(yǎng)基A2。基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基A1+15 g蛋白胨。(3)加富液體培養(yǎng)基A3?;A(chǔ)液體培養(yǎng)基A1+15 g尿素。(4)加富液體培養(yǎng)基A4?;A(chǔ)液體培養(yǎng)基A1+15 g酵母膏。(5)加富液體培養(yǎng)基A5。基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基A1+15 g硫酸銨。

    1.2.5 不同液體培養(yǎng)基配方對菌絲生長的影響

    1.2.5.1 菌塊培養(yǎng)及液體培養(yǎng)基接種培養(yǎng) 將由同一子實體的同一部位分離獲得的母種進行擴繁,接種于新的PDA平板培養(yǎng)基中心,待菌絲長滿整個平板培養(yǎng)基后,用直徑為 5 mm 滅過菌的打孔器在距平板中心接種點3 cm處打孔,將菌齡一致的菌塊轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中,每瓶液體培養(yǎng)基接入菌塊10塊,每個配方設(shè)置5個重復(fù)。將接入菌塊的液體培養(yǎng)基錐形瓶放入恒溫振蕩器內(nèi),在25 ℃、130 r/min的條件下培養(yǎng)10 d,觀察菌絲球形態(tài)。

    1.2.5.2 生物量的測定 取50 mL液體菌種,2 000 g離心20 min,去上清;菌絲體沉淀經(jīng)蒸餾水充分洗滌后,濾紙過濾;待濾液無色透明后收集菌絲體,80 ℃真空干燥至恒質(zhì)量,電子天平準確稱質(zhì)量。計算公式為:

    菌絲體生物量(g/L)=菌絲體干質(zhì)量(g)0.05(L)×1 000。

    1.2.5.3 菌絲球密度的測定 將培養(yǎng)至10 d的液體菌種搖勻后,用移液器吸取1 mL的菌液,加入9 mL的無菌水中,稀釋10倍,測定菌絲球個數(shù)。

    1.2.6 DNA的提取 采用快捷型植物基因組 DNA 提取試劑盒(天根)分別對大球蓋菇的子實體和分離培養(yǎng)得到的菌絲體進行基因組 DNA提取。將大球蓋菇子實體撕開用滅過菌的鑷子夾取內(nèi)部完好的菌肉,放于研缽中,加入液氮充分研磨;菌絲體采用錐形瓶中的液體菌種,經(jīng)紗布過濾后,用無菌水沖洗3~5遍,將菌絲擰干,取適量放于研缽中,加入液氮充分研磨。其余步驟參照說明書。

    1.2.7 ITS序列的擴增 采用通用引物ITS1和ITS4(ITS1:5′-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3′;ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)用于rDNA ITS 區(qū)段的 PCR 擴增[10]。擴增體系為50 μL,其中35.5 μL去離子水,5 μL 10×PCR buffer,4 μL dNTPs(2.5 mmol/L),ITS1/ITS4 引物各2 μL,0.5μL Taq DNA 酶(5 U/μL),1 μL模板DNA(濃度 20~50 mg/L)。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,35個循環(huán);72 ℃反應(yīng)7 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后4 ℃保存。

    1.2.8 ITS序列的測序與分析 為了保證測序的準確率,PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后用正反向引物雙向測序,測序由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司完成。

    將測序結(jié)果在NCBI中作BlastN比對,找出并下載 >90%相似性序列,用ClustalX2.1的Alignment程序?qū)λ型葱蛄羞M行多重對位排列。用MEGA 5.02軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析和進化樹的構(gòu)建。用Kimura2-parameter 模式計算遺傳距離,所有對位排列結(jié)果中的空位(gaps)或缺失數(shù)據(jù)(missing data)作完全刪除(complete deletion)處理,進化距離分析采用鄰位相連法(NJ,neighbor-joining)。系統(tǒng)樹每個分支的統(tǒng)計學(xué)顯著性分析以自展法(bootstrap)進行檢驗,重復(fù)次數(shù)為1 000次。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 子實體晾曬時間對分離的影響

    由表1可知,分離新鮮子實體污染率達到了30%,而經(jīng)過晾曬1 h,污染率降低至10%,晾曬2~5 h,污染率降為0。晾曬時間越長,萌發(fā)越慢,新鮮子實體和晾曬1~2 h的子實體分離時,萌發(fā)最快,只需2 d;晾曬5 h時,分離的菌肉組織不萌發(fā)。晾曬時間越長,菌絲生長越慢,晾曬2 h的子實體分離后,菌絲生長速度最快,為8.0 mm/d,但與新鮮子實體和晾曬1 h的子實體差別不大。新鮮子實體和晾曬1~2 h的子實體,菌絲生長濃密,長勢旺盛;但晾曬3 h之后,菌絲變得稀疏,長勢較弱。綜上所述,采用晾曬2 h的大球蓋菇子實體進行分離,既能有效地降低污染率,又不影響萌發(fā)和菌絲的生長。

    2.2 子實體不同部位對分離的影響

    從表2可以看出,大球蓋菇子實體菌蓋與菌柄交接處分離后,菌絲的生長速度最快,達到8.9 mm/d;其次是菌柄上端(8.5 mm/d)和菌蓋(8.0 mm/d);菌柄基部最慢,僅為 7.4 mm/d。除菌柄基部外,其他3個部位菌絲的長勢都很濃密旺盛;菌柄基部的污染率達到了10%,其他3個部位污染率則為0。綜合分析,菌蓋與菌柄交接處為最佳分離部位。

    2.3 不同液體培養(yǎng)基配方對菌絲生長的影響

    如表3所示,不同的液體培養(yǎng)基配方上生長的菌絲存在很大差異。A2的菌絲體生物量(6.8 g/L)和菌絲球密度(138個/mL)均明顯高于其他4組培養(yǎng)基;其次為A4培養(yǎng)基,菌絲體生物量為5.5 g/L,菌絲球密度為109個/mL;A3的菌絲體生物量和菌絲球密度則最小,分別為3.7 g/L、65個/mL。A2和A4配方的菌絲球如小米粒大小,呈圓球狀,大小均一,菌液稠密;其他3組配方的菌絲球都如綠豆粒大小,呈刺球狀,其中A1配方的菌絲球大小均一,菌液濃度較稠密;而A3和A5配方的菌絲球大小不均一,菌液濃度較稀疏。綜上分析,采用A2培養(yǎng)大球蓋菇菌絲體最佳,其次為A4培養(yǎng)基。

    2.4 ITS區(qū)段的PCR產(chǎn)物及測序

    對大球蓋菇子實體及分離培養(yǎng)得到的菌絲進行DNA提取,并以提取的DNA為模板進行PCR擴增,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,得到如圖1所示的特異性條帶。由圖1可以看出,S1與S2片段大小一致,約為650 bp,與測序得到的基因片段長度S1 (649 bp)和S2 (654 bp)大小相符,并且S1與S2有99%的同源性。由此可以初步判定,菌絲體S2為大球蓋菇子實體S1的純培養(yǎng)菌絲體。

    2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

    在NCBI中進行BLASTN比對,找到12條與S2相似性>90%的序列并下載,用ClustalX2.1軟件進行序列比對,并輔以人工修正。以靈芝(Ganoderma lucidum)作為外參,基于來自NCBI中的12個種的ITS序列,連同試驗中的 ITS 序列共14條序列一起用于系統(tǒng)發(fā)育分析。用MEGA 5.02中的鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)樹。從圖2可以看出,S2與球蓋菇屬大球蓋菇(Stropharia rugosoannulata)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近。

    3 結(jié)論與討論

    對于野生食用菌的人工馴化,首先須要獲得純化菌種,常見的菌種分離方法有組織分離法、孢子分離法和基內(nèi)菌絲分離法,其中組織分離法因簡單、易操作且純化率高,在實踐中被廣泛地應(yīng)用[11]。本試驗采用組織分離法對野生大球蓋菇進行分離,試驗結(jié)果表明,野生大球蓋菇能夠成功分離獲得母種,并且子實體經(jīng)2 h的晾曬,既能有效降低污染率,又不影響萌發(fā)和菌絲的生長,而長時間的晾曬則會嚴重抑制菌絲的萌發(fā)和生長??赡苁墙?jīng)過適宜時間的晾曬,子實體水分減少從而減少了細菌污染,再加上陽光中的紫外線具有殺菌功能,進一步降低污染,但長時間晾曬使子實體脫水,菌絲體細胞活力減弱甚至死亡,從而影響分離效果。大球蓋菇最佳的分離部位是菌蓋與菌柄交接處,該部位分離的菌絲生長速度快,長勢旺盛且污染率低,可能的原因是該部位是子實體的生長點,菌絲體細胞活力強,分裂速度快,且該部位與空氣接觸少,雜菌少。在食用菌工廠化生產(chǎn)中,液體菌種因其生產(chǎn)周期短、菌齡一致、菌種生產(chǎn)成本低、接種簡便等優(yōu)點,得到了十分廣泛的應(yīng)用[12]。本試驗篩選出最適宜的液體培養(yǎng)基配方為A2,即基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基A1+蛋白胨15 g,采用此配方培養(yǎng)的液體菌種,菌絲體生物量高,菌絲球密度大,形態(tài)好。原因可能是此配方所含的蛋白胨中營養(yǎng)更豐富,氮的形態(tài)更適合菌絲體吸收。

    目前菌種鑒定、遺傳多樣性研究主要基于形態(tài)學(xué)、細胞、生化及分子水平開展[13],其中ITS序列分析法因準確性高,簡便易行而具有很大的應(yīng)用價值。本試驗通過對供試子實體與菌絲體的ITS序列進行擴增、測序、比對,驗證了供試菌絲體為大球蓋菇子實體的分離物,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹后發(fā)現(xiàn),分離獲得的純培養(yǎng)菌絲體與球蓋菇屬的大球蓋菇(Stropharia rugosoannulata)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近,與其同源性高達99%,確定為大球蓋菇菌種。

    參考文獻:

    [1]黃年來. 大球蓋菇的分類地位和特征特性[J]. 食用菌,1995,17(6):11.

    [2]劉道調(diào),劉梅香,朱慧斌,等. 冬閑田稻草生料種植大球蓋菇技術(shù)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2014(2):132-133.

    [3]張 穎. 大球蓋菇北方棚內(nèi)反季栽培技術(shù)[J]. 中國林副特產(chǎn),2014(6):54-55.

    [4]鄭文彪,呂軍美,潘永柱,等. 大球蓋菇栽培模式比較試驗[J]. 食用菌,2015,37(2):46-48.

    [5]任 琪,方顯出. 秕谷料栽培大球蓋菇技術(shù)[J]. 食用菌,2015(4):53-53.

    [6]周祖法,閆 靜,王偉科. 不同培養(yǎng)料配方栽培大球蓋菇試驗[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2013(2):149-150.

    [7]武 旭,石建森,李 青,等. 不同配方玉米秸稈對大球蓋菇原種菌絲生長的影響[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(9):945-946,1002.

    [8]陳君琛,沈恒勝,李怡彬,等. 不同栽培基質(zhì)對大球蓋菇產(chǎn)量和品質(zhì)的影響[J]. 中國食用菌,2010,29(3):18-19.

    [9]陳玉華,劉君昂,周國英,等. 松乳菇ITS序列比較及其在乳菇屬中的系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 食用菌學(xué)報,2013,20(1):18-24.

    [10]Chen Y H,Yang X Y,Kun H,et al. The MYB transcription factor superfamily of Arabidopsis:expression analysis and phylogenetic comparison with the rice MYB family[J]. Plant Molecular Biology,2006,60(1):107-124.

    [11]任桂梅,趙海鷹,鄧振山,等. 菌種分離技術(shù)及其降低污染率與死亡率實驗教改初探[J]. 延安大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2007,26(4):65-67.

    [12]王 穩(wěn). 食用菌液體菌種的工藝研究及應(yīng)用[D]. 鎮(zhèn)江:江蘇大學(xué),2005:1-2.

    [13]張靠穩(wěn),楊振華,馬愛瑛. 標記技術(shù)在食用菌遺傳多樣性中的研究進展[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(6):6-9.王榆鑫,王進鑫,初江濤,等. 側(cè)柏和國槐幼苗生長對鉛脅迫的閾值[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,45(1):123-127.

    久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲精品国产色婷婷电影| 免费在线观看日本一区| 久久国产精品影院| 午夜福利乱码中文字幕| 国产精品 国内视频| 99热国产这里只有精品6| 久久午夜综合久久蜜桃| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲第一av免费看| 亚洲av日韩在线播放| 老司机午夜十八禁免费视频| 黄片播放在线免费| 超碰97精品在线观看| 另类亚洲欧美激情| 免费观看人在逋| 国产极品粉嫩免费观看在线| 一级毛片高清免费大全| 日韩欧美国产一区二区入口| 黄色视频不卡| 99精品久久久久人妻精品| 两个人看的免费小视频| 又紧又爽又黄一区二区| 免费看a级黄色片| 久久久久久久午夜电影 | 91av网站免费观看| 视频在线观看一区二区三区| 三级毛片av免费| 99精品在免费线老司机午夜| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 操出白浆在线播放| 色综合婷婷激情| 久久久久久久国产电影| 亚洲中文av在线| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 成年动漫av网址| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 村上凉子中文字幕在线| 久久久久久久午夜电影 | svipshipincom国产片| www日本在线高清视频| 国产野战对白在线观看| 在线看a的网站| 成人国语在线视频| 手机成人av网站| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美激情高清一区二区三区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲专区国产一区二区| 久久天堂一区二区三区四区| 嫁个100分男人电影在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| a级毛片黄视频| videos熟女内射| 亚洲,欧美精品.| 9191精品国产免费久久| 另类亚洲欧美激情| 精品一品国产午夜福利视频| 国产精品九九99| 亚洲熟妇熟女久久| 成年人免费黄色播放视频| 99re6热这里在线精品视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产高清国产精品国产三级| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 捣出白浆h1v1| x7x7x7水蜜桃| 免费日韩欧美在线观看| 欧美黑人精品巨大| 两性夫妻黄色片| 亚洲在线自拍视频| www.自偷自拍.com| 51午夜福利影视在线观看| 女人被狂操c到高潮| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲av日韩在线播放| 久久久国产一区二区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 日韩欧美三级三区| 免费观看a级毛片全部| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲熟妇熟女久久| 黄色片一级片一级黄色片| 热re99久久国产66热| 国产男靠女视频免费网站| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 免费av中文字幕在线| 又紧又爽又黄一区二区| 日本黄色日本黄色录像| 久久久国产成人精品二区 | 亚洲熟女毛片儿| 在线免费观看的www视频| 国产精品偷伦视频观看了| 91老司机精品| av中文乱码字幕在线| 国产有黄有色有爽视频| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 麻豆乱淫一区二区| 在线天堂中文资源库| 久久午夜亚洲精品久久| 丁香六月欧美| 亚洲第一av免费看| 青草久久国产| 丝袜美足系列| 精品一品国产午夜福利视频| 麻豆国产av国片精品| av国产精品久久久久影院| 三上悠亚av全集在线观看| 黄色视频不卡| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产精品国产高清国产av | av国产精品久久久久影院| 亚洲全国av大片| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品亚洲一级av第二区| 啦啦啦 在线观看视频| 精品国产一区二区久久| 欧美日韩av久久| 亚洲视频免费观看视频| 一进一出抽搐动态| 欧美性长视频在线观看| 免费在线观看完整版高清| 后天国语完整版免费观看| 成人精品一区二区免费| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产黄色免费在线视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久午夜综合久久蜜桃| 涩涩av久久男人的天堂| 99riav亚洲国产免费| 国产精品电影一区二区三区 | 欧美中文综合在线视频| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲av电影在线进入| 亚洲成国产人片在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 国产精品九九99| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲三区欧美一区| 叶爱在线成人免费视频播放| 伦理电影免费视频| 乱人伦中国视频| 亚洲av熟女| 国产精品一区二区在线不卡| 十八禁高潮呻吟视频| 男女免费视频国产| 国产激情欧美一区二区| 一a级毛片在线观看| 91国产中文字幕| 看黄色毛片网站| 精品久久久久久,| 亚洲精华国产精华精| 久久久久久久久免费视频了| av天堂在线播放| а√天堂www在线а√下载 | 久久中文字幕一级| 午夜久久久在线观看| 一区二区三区激情视频| 女性生殖器流出的白浆| 国产高清videossex| 999久久久精品免费观看国产| 女人久久www免费人成看片| 国产成人欧美在线观看 | 99精品久久久久人妻精品| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 午夜精品在线福利| 国产精品国产高清国产av | 久久精品国产综合久久久| 一a级毛片在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| netflix在线观看网站| 一区福利在线观看| 热99re8久久精品国产| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 9191精品国产免费久久| 欧美黄色片欧美黄色片| 少妇的丰满在线观看| 一级黄色大片毛片| 国产午夜精品久久久久久| 在线av久久热| 成人av一区二区三区在线看| 一级片免费观看大全| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产野战对白在线观看| 亚洲人成电影观看| 久久精品国产综合久久久| 国产av一区二区精品久久| 精品熟女少妇八av免费久了| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产亚洲精品久久久久5区| 正在播放国产对白刺激| 亚洲精品在线观看二区| 成年人黄色毛片网站| 一本大道久久a久久精品| 国产精品国产av在线观看| 精品国产一区二区久久| 国产99白浆流出| 免费观看人在逋| 两个人看的免费小视频| 精品一品国产午夜福利视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 不卡一级毛片| 久久久久久久久久久久大奶| netflix在线观看网站| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 亚洲欧美日韩另类电影网站| 欧美激情高清一区二区三区| 久久 成人 亚洲| 在线观看一区二区三区激情| 女警被强在线播放| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产精品.久久久| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 中文字幕制服av| 人成视频在线观看免费观看| 精品国内亚洲2022精品成人 | 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美日韩黄片免| 91av网站免费观看| 美女福利国产在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美成人免费av一区二区三区 | 久久久久久久久久久久大奶| 欧美乱色亚洲激情| 成年人免费黄色播放视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 午夜免费成人在线视频| 久久久久国内视频| 美国免费a级毛片| 日韩欧美三级三区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 欧美日韩黄片免| 男女下面插进去视频免费观看| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲,欧美精品.| 久久草成人影院| 黄色 视频免费看| 69av精品久久久久久| 在线观看免费高清a一片| 午夜福利一区二区在线看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 欧美激情久久久久久爽电影 | 国产欧美日韩一区二区三| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 精品国产亚洲在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 午夜免费观看网址| 高清av免费在线| 久久久精品区二区三区| 国产成人精品久久二区二区91| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久这里只有精品19| 女同久久另类99精品国产91| 天天操日日干夜夜撸| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产成人av激情在线播放| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 在线观看日韩欧美| 不卡一级毛片| 国产精华一区二区三区| 又紧又爽又黄一区二区| 狠狠狠狠99中文字幕| 久久 成人 亚洲| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 成人18禁在线播放| avwww免费| 国产亚洲欧美98| 不卡一级毛片| 青草久久国产| 日本黄色视频三级网站网址 | 久久久精品区二区三区| 最近最新免费中文字幕在线| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产有黄有色有爽视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产男女超爽视频在线观看| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久久久视频综合| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 在线观看免费午夜福利视频| 婷婷成人精品国产| 香蕉国产在线看| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 大香蕉久久网| 精品国产乱子伦一区二区三区| 精品人妻在线不人妻| 亚洲免费av在线视频| 少妇粗大呻吟视频| 69精品国产乱码久久久| 黄色 视频免费看| 十八禁人妻一区二区| 757午夜福利合集在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲精品av麻豆狂野| 日韩欧美三级三区| 欧美久久黑人一区二区| 午夜福利欧美成人| 国产单亲对白刺激| 亚洲美女黄片视频| 国产成人av教育| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产av又大| 激情在线观看视频在线高清 | 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 90打野战视频偷拍视频| 我的亚洲天堂| 深夜精品福利| 亚洲在线自拍视频| www.999成人在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 在线永久观看黄色视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲成人免费av在线播放| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 日韩免费av在线播放| 男女下面插进去视频免费观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 欧美激情极品国产一区二区三区| 一级毛片精品| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产成人精品久久二区二区免费| 午夜福利免费观看在线| 精品高清国产在线一区| 亚洲av电影在线进入| 看片在线看免费视频| 捣出白浆h1v1| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 十八禁网站免费在线| xxx96com| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产人伦9x9x在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲在线自拍视频| 亚洲精品美女久久av网站| www.熟女人妻精品国产| 黄色女人牲交| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 一进一出好大好爽视频| 两个人看的免费小视频| 一二三四社区在线视频社区8| 国产人伦9x9x在线观看| 午夜福利,免费看| 久久久久精品国产欧美久久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 成人三级做爰电影| 国产不卡一卡二| 亚洲精品乱久久久久久| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产麻豆69| av线在线观看网站| 欧美丝袜亚洲另类 | 欧美激情久久久久久爽电影 | 久久精品人人爽人人爽视色| 精品国产国语对白av| 午夜福利免费观看在线| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品.久久久| 99国产精品99久久久久| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲午夜理论影院| 丝袜美腿诱惑在线| 窝窝影院91人妻| 久久香蕉国产精品| 看黄色毛片网站| 90打野战视频偷拍视频| 午夜福利影视在线免费观看| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 中文字幕人妻丝袜制服| www日本在线高清视频| 亚洲av日韩在线播放| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产精品 国内视频| 一级a爱视频在线免费观看| 一级,二级,三级黄色视频| 成年版毛片免费区| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲中文字幕日韩| 久久久国产成人免费| ponron亚洲| 99热国产这里只有精品6| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 女警被强在线播放| 午夜影院日韩av| 久久久久视频综合| 久热这里只有精品99| 国产人伦9x9x在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 91精品国产国语对白视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 美女福利国产在线| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美精品亚洲一区二区| 久久性视频一级片| 大型黄色视频在线免费观看| 女人被狂操c到高潮| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 久久精品国产a三级三级三级| 免费在线观看亚洲国产| 一级a爱片免费观看的视频| 婷婷丁香在线五月| 国产欧美日韩一区二区三| 国产精品一区二区免费欧美| 国产三级黄色录像| 国产在视频线精品| cao死你这个sao货| 日韩中文字幕欧美一区二区| 免费在线观看黄色视频的| 好男人电影高清在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 免费少妇av软件| √禁漫天堂资源中文www| 另类亚洲欧美激情| 看免费av毛片| 亚洲人成77777在线视频| 欧美乱色亚洲激情| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲欧美激情综合另类| av在线播放免费不卡| 国产精品欧美亚洲77777| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 99精品在免费线老司机午夜| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 久久久久久人人人人人| 国产亚洲欧美98| 国产不卡一卡二| 国产精品一区二区在线不卡| 美女高潮到喷水免费观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 黑人猛操日本美女一级片| 99热只有精品国产| 丝袜美足系列| 国产成人精品无人区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 后天国语完整版免费观看| 嫩草影视91久久| 成年女人毛片免费观看观看9 | 首页视频小说图片口味搜索| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 老司机影院毛片| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| a在线观看视频网站| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产成人欧美在线观看 | 日日爽夜夜爽网站| 国产亚洲精品久久久久5区| av免费在线观看网站| 制服诱惑二区| 亚洲美女黄片视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 十八禁网站免费在线| 精品国产国语对白av| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲第一av免费看| 国产精品一区二区免费欧美| 成年人免费黄色播放视频| 人人澡人人妻人| 亚洲精品一二三| 成人黄色视频免费在线看| √禁漫天堂资源中文www| 村上凉子中文字幕在线| 69精品国产乱码久久久| 亚洲精品在线美女| 超色免费av| 亚洲五月色婷婷综合| 欧美在线一区亚洲| av电影中文网址| 免费高清在线观看日韩| 国产精品电影一区二区三区 | x7x7x7水蜜桃| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| а√天堂www在线а√下载 | 欧美黄色片欧美黄色片| 首页视频小说图片口味搜索| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久久久久久久久久久大奶| 曰老女人黄片| 69av精品久久久久久| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲七黄色美女视频| 热99国产精品久久久久久7| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产精品av久久久久免费| 国产亚洲精品一区二区www | 在线观看舔阴道视频| 免费高清在线观看日韩| 丝瓜视频免费看黄片| x7x7x7水蜜桃| 午夜免费成人在线视频| 最新在线观看一区二区三区| 免费黄频网站在线观看国产| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲成国产人片在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产真人三级小视频在线观看| 国产男女内射视频| 国产av一区二区精品久久| 久久影院123| 深夜精品福利| 欧美最黄视频在线播放免费 | 午夜福利一区二区在线看| 国产精品一区二区免费欧美| 日本黄色日本黄色录像| 国产成人免费无遮挡视频| 色94色欧美一区二区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 老司机亚洲免费影院| 亚洲av欧美aⅴ国产| 黄色成人免费大全| 1024视频免费在线观看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美乱妇无乱码| 国产高清视频在线播放一区| 精品熟女少妇八av免费久了| 午夜精品国产一区二区电影| a级片在线免费高清观看视频| 在线观看午夜福利视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲一码二码三码区别大吗| 无限看片的www在线观看| 欧美激情高清一区二区三区| 一本大道久久a久久精品| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产成人精品无人区| 在线观看66精品国产| 国产精品成人在线| 热re99久久精品国产66热6| 欧美日韩视频精品一区| 男人舔女人的私密视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 在线视频色国产色| 99久久综合精品五月天人人| 国产高清激情床上av| 成人影院久久| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 精品国产乱子伦一区二区三区| 岛国毛片在线播放| 成人精品一区二区免费| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产精品国产高清国产av | 午夜91福利影院| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产精品1区2区在线观看. | xxxhd国产人妻xxx| videosex国产| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 亚洲专区字幕在线| 中亚洲国语对白在线视频| 老司机靠b影院| 国产单亲对白刺激| 宅男免费午夜| 国产成人免费无遮挡视频| а√天堂www在线а√下载 | 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 韩国精品一区二区三区| 国产精品一区二区在线不卡| 国产伦人伦偷精品视频| 久久久久久人人人人人| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 极品教师在线免费播放| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 一级片'在线观看视频| 国产精品免费一区二区三区在线 | 丰满饥渴人妻一区二区三| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲在线自拍视频| 国产欧美亚洲国产| 超碰成人久久| 日韩欧美免费精品| 亚洲精品成人av观看孕妇| 中文字幕人妻熟女乱码| 丁香欧美五月| 人人澡人人妻人| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 老司机在亚洲福利影院| 两性夫妻黄色片| av中文乱码字幕在线| 多毛熟女@视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 美国免费a级毛片| 又大又爽又粗| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲男人天堂网一区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 一进一出抽搐动态| av欧美777|