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    大球蓋菇的分離純化及ITS序列鑒定

    2017-02-27 11:09:19張健張國權(quán)鄒莉
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年1期

    張健+張國權(quán)+鄒莉

    摘要:以吉林長白山地區(qū)的野生大球蓋菇為材料,對其進行1~5 h不同時間的晾曬處理,采用組織分離法分別對其菌蓋、菌蓋與菌柄交接處、菌柄上端和菌柄基部的組織進行分離純化,通過測定菌絲生長速度、生長勢和污染率等,篩選出分離純化的最適晾曬時間和最佳部位;設(shè)置5種液體培養(yǎng)基配方培養(yǎng)液體菌種,通過測定菌絲體生物量、菌絲球密度和形態(tài),篩選出最佳的液體培養(yǎng)基配方;最后將分離物進行ITS序列分析,計算遺傳距離,并采用鄰接法構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明,分離純化最適晾曬時間為2 h,最佳分離部位為菌蓋與菌柄交接處,此種情況下菌絲生長速度最快,菌絲長勢最好,污染率最低;最佳的液體培養(yǎng)基配方為A2,菌絲體生物量最高,菌絲球密度最大,形態(tài)最好;最后分離菌株經(jīng)ITS序列測定,系統(tǒng)發(fā)育分析證實其為大球蓋菇。

    關(guān)鍵詞:大球蓋菇;組織分離;ITS序列分析;系統(tǒng)發(fā)育分析

    中圖分類號: S646.904 文獻標志碼: A 文章編號:1002-1302(2017)01-0120-03

    大球蓋菇(Stropharia rugosoannulata)別稱酒紅球蓋菇、皺環(huán)球蓋菇,屬擔子菌門(Basidomycota)層菌綱(Hymenomycetes)傘菌目(Agaricales)球蓋菇科(Strophariaceae)球蓋菇屬(Stropharia),是國際菇類交易市場上十大菇類之一,也是聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)向發(fā)展中國家推薦栽培的特色食用菌之一[1]。大球蓋菇鮮菇色澤艷麗,肉質(zhì)脆嫩滑爽,干品氣味清香,營養(yǎng)豐富,具有很高的食用價值和藥用價值,頗受國內(nèi)外消費者歡迎,具有非常廣闊的發(fā)展前景。大球蓋菇的栽培管理較為粗放,對其冬閑田露地栽培[2]、大棚反季節(jié)栽培[3]、畦式栽培、層架式栽培、地坑式栽培等[4]多種栽培模式進行深入研究,對利用稻草、玉米秸稈、菌渣等不同栽培料栽培大球蓋菇也進行多樣化比較[5-8],取得了豐富的研究成果,但關(guān)于大球蓋菇母種的獲得、液體培養(yǎng)基配方的篩選以及如何對菌種進行準確鑒定還未見報道。ITS(internal transcribed spacer)是核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū),包括ITS1和ITS2兩部分,連同二者中間的5.8S rDNA基因組成ITS1-5.8S-ITS2結(jié)構(gòu),被廣泛應(yīng)用于真菌菌種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、條形碼和群體多樣性研究[9]。本研究對采自吉林長白山地區(qū)的野生大球蓋菇進行組織分離,獲取母種,篩選最適合液體菌種生長的培養(yǎng)基配方,并對子實體和分離菌株的ITS序列進行測序比對,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,旨在從分子水平上對大球蓋菇進行鑒定,進而為大球蓋菇的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    大球蓋菇子實體于2015年9月采自吉林省長白山地區(qū)。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 培養(yǎng)基的制備 研究使用的分離培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基,培養(yǎng)基制作方法如下:將馬鈴薯洗凈去皮,用電子天平稱取200 g切成1 cm3的小塊,用紗布包好后放入1 000 mL水中煮沸;待馬鈴薯塊軟化后撈出,加入葡萄糖20 g,瓊脂15 g,再次煮沸,加水補足 1 000 mL;再用雙層紗布過濾,倒入錐形瓶內(nèi);將瓶口用封口膜封好后,用高壓滅菌鍋121 ℃滅菌 20 min;滅菌結(jié)束后,待培養(yǎng)基溫度降至不燙手但未凝固時,在超凈工作臺內(nèi),定量倒入直徑為8 cm的培養(yǎng)皿中,裝液量為20 mL,凝固后備用。

    1.2.2 子實體晾曬時間對分離的影響 以剛采集到的部分野生大球蓋菇新鮮子實體作為對照,將大球蓋菇放置在充足陽光下晾曬,晾曬時間為10:00—15:00,分別取晾曬1、2、3、4、5 h的子實體和新鮮子實體進行組織分離。將菌蓋從中間撕開,挑取0.3 cm大小的菌肉組織接于PDA平板培養(yǎng)基中心部位,每個平板接1塊菌肉,蓋蓋后用封口膜封好,每組設(shè)置10個重復(fù),放置在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),每天觀察菌肉組織的萌發(fā)、污染以及菌絲生長情況。

    1.2.3 子實體不同部位對分離的影響 將分離要使用的解剖刀、鑷子、封口膜以及PDA平板放入超凈工作臺中進行紫外滅菌。將大球蓋菇經(jīng)處理后分離效果最好的子實體,用75%乙醇擦拭表面2~3遍,用無菌的解剖刀在菌蓋頂部中間劃口,用手撕開,注意避免手接觸到內(nèi)部的菌肉。用解剖刀分別在子實體菌蓋、菌蓋與菌柄交接處、菌柄上端和菌柄基部劃取一小塊組織,用無菌鑷子夾起,迅速放置于制備好的PDA平板培養(yǎng)基中心處,每個平板接1塊組織,每組設(shè)置10個重復(fù),封口膜封口后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),每天觀察并記錄組織體的萌發(fā)情況、污染情況和菌絲生長情況。

    1.2.4 液體培養(yǎng)基的制備 研究共采用5種液體培養(yǎng)基研究培養(yǎng)基對菌絲生長的影響,各培養(yǎng)基制作方法如下。

    (1)基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基A1。將馬鈴薯洗凈去皮,稱取 300 g,切成1 cm3小塊,用紗布包好后放入1 500 mL水中煮沸;待馬鈴薯塊軟化后撈出,加入30 g葡萄糖、1.5 g KH2PO4和0.75 g MgSO4,再次煮沸;加水補足1 500 mL,再用雙層紗布過濾,倒入500 mL錐形瓶內(nèi),每個錐形瓶分裝300 mL液體培養(yǎng)基;封口膜封口后,放入高壓滅菌鍋內(nèi),121 ℃滅菌 30 min 以備用。(2)加富液體培養(yǎng)基A2。基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基A1+15 g蛋白胨。(3)加富液體培養(yǎng)基A3?;A(chǔ)液體培養(yǎng)基A1+15 g尿素。(4)加富液體培養(yǎng)基A4?;A(chǔ)液體培養(yǎng)基A1+15 g酵母膏。(5)加富液體培養(yǎng)基A5。基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基A1+15 g硫酸銨。

    1.2.5 不同液體培養(yǎng)基配方對菌絲生長的影響

    1.2.5.1 菌塊培養(yǎng)及液體培養(yǎng)基接種培養(yǎng) 將由同一子實體的同一部位分離獲得的母種進行擴繁,接種于新的PDA平板培養(yǎng)基中心,待菌絲長滿整個平板培養(yǎng)基后,用直徑為 5 mm 滅過菌的打孔器在距平板中心接種點3 cm處打孔,將菌齡一致的菌塊轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中,每瓶液體培養(yǎng)基接入菌塊10塊,每個配方設(shè)置5個重復(fù)。將接入菌塊的液體培養(yǎng)基錐形瓶放入恒溫振蕩器內(nèi),在25 ℃、130 r/min的條件下培養(yǎng)10 d,觀察菌絲球形態(tài)。

    1.2.5.2 生物量的測定 取50 mL液體菌種,2 000 g離心20 min,去上清;菌絲體沉淀經(jīng)蒸餾水充分洗滌后,濾紙過濾;待濾液無色透明后收集菌絲體,80 ℃真空干燥至恒質(zhì)量,電子天平準確稱質(zhì)量。計算公式為:

    菌絲體生物量(g/L)=菌絲體干質(zhì)量(g)0.05(L)×1 000。

    1.2.5.3 菌絲球密度的測定 將培養(yǎng)至10 d的液體菌種搖勻后,用移液器吸取1 mL的菌液,加入9 mL的無菌水中,稀釋10倍,測定菌絲球個數(shù)。

    1.2.6 DNA的提取 采用快捷型植物基因組 DNA 提取試劑盒(天根)分別對大球蓋菇的子實體和分離培養(yǎng)得到的菌絲體進行基因組 DNA提取。將大球蓋菇子實體撕開用滅過菌的鑷子夾取內(nèi)部完好的菌肉,放于研缽中,加入液氮充分研磨;菌絲體采用錐形瓶中的液體菌種,經(jīng)紗布過濾后,用無菌水沖洗3~5遍,將菌絲擰干,取適量放于研缽中,加入液氮充分研磨。其余步驟參照說明書。

    1.2.7 ITS序列的擴增 采用通用引物ITS1和ITS4(ITS1:5′-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3′;ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)用于rDNA ITS 區(qū)段的 PCR 擴增[10]。擴增體系為50 μL,其中35.5 μL去離子水,5 μL 10×PCR buffer,4 μL dNTPs(2.5 mmol/L),ITS1/ITS4 引物各2 μL,0.5μL Taq DNA 酶(5 U/μL),1 μL模板DNA(濃度 20~50 mg/L)。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,35個循環(huán);72 ℃反應(yīng)7 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后4 ℃保存。

    1.2.8 ITS序列的測序與分析 為了保證測序的準確率,PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后用正反向引物雙向測序,測序由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司完成。

    將測序結(jié)果在NCBI中作BlastN比對,找出并下載 >90%相似性序列,用ClustalX2.1的Alignment程序?qū)λ型葱蛄羞M行多重對位排列。用MEGA 5.02軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析和進化樹的構(gòu)建。用Kimura2-parameter 模式計算遺傳距離,所有對位排列結(jié)果中的空位(gaps)或缺失數(shù)據(jù)(missing data)作完全刪除(complete deletion)處理,進化距離分析采用鄰位相連法(NJ,neighbor-joining)。系統(tǒng)樹每個分支的統(tǒng)計學(xué)顯著性分析以自展法(bootstrap)進行檢驗,重復(fù)次數(shù)為1 000次。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 子實體晾曬時間對分離的影響

    由表1可知,分離新鮮子實體污染率達到了30%,而經(jīng)過晾曬1 h,污染率降低至10%,晾曬2~5 h,污染率降為0。晾曬時間越長,萌發(fā)越慢,新鮮子實體和晾曬1~2 h的子實體分離時,萌發(fā)最快,只需2 d;晾曬5 h時,分離的菌肉組織不萌發(fā)。晾曬時間越長,菌絲生長越慢,晾曬2 h的子實體分離后,菌絲生長速度最快,為8.0 mm/d,但與新鮮子實體和晾曬1 h的子實體差別不大。新鮮子實體和晾曬1~2 h的子實體,菌絲生長濃密,長勢旺盛;但晾曬3 h之后,菌絲變得稀疏,長勢較弱。綜上所述,采用晾曬2 h的大球蓋菇子實體進行分離,既能有效地降低污染率,又不影響萌發(fā)和菌絲的生長。

    2.2 子實體不同部位對分離的影響

    從表2可以看出,大球蓋菇子實體菌蓋與菌柄交接處分離后,菌絲的生長速度最快,達到8.9 mm/d;其次是菌柄上端(8.5 mm/d)和菌蓋(8.0 mm/d);菌柄基部最慢,僅為 7.4 mm/d。除菌柄基部外,其他3個部位菌絲的長勢都很濃密旺盛;菌柄基部的污染率達到了10%,其他3個部位污染率則為0。綜合分析,菌蓋與菌柄交接處為最佳分離部位。

    2.3 不同液體培養(yǎng)基配方對菌絲生長的影響

    如表3所示,不同的液體培養(yǎng)基配方上生長的菌絲存在很大差異。A2的菌絲體生物量(6.8 g/L)和菌絲球密度(138個/mL)均明顯高于其他4組培養(yǎng)基;其次為A4培養(yǎng)基,菌絲體生物量為5.5 g/L,菌絲球密度為109個/mL;A3的菌絲體生物量和菌絲球密度則最小,分別為3.7 g/L、65個/mL。A2和A4配方的菌絲球如小米粒大小,呈圓球狀,大小均一,菌液稠密;其他3組配方的菌絲球都如綠豆粒大小,呈刺球狀,其中A1配方的菌絲球大小均一,菌液濃度較稠密;而A3和A5配方的菌絲球大小不均一,菌液濃度較稀疏。綜上分析,采用A2培養(yǎng)大球蓋菇菌絲體最佳,其次為A4培養(yǎng)基。

    2.4 ITS區(qū)段的PCR產(chǎn)物及測序

    對大球蓋菇子實體及分離培養(yǎng)得到的菌絲進行DNA提取,并以提取的DNA為模板進行PCR擴增,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,得到如圖1所示的特異性條帶。由圖1可以看出,S1與S2片段大小一致,約為650 bp,與測序得到的基因片段長度S1 (649 bp)和S2 (654 bp)大小相符,并且S1與S2有99%的同源性。由此可以初步判定,菌絲體S2為大球蓋菇子實體S1的純培養(yǎng)菌絲體。

    2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

    在NCBI中進行BLASTN比對,找到12條與S2相似性>90%的序列并下載,用ClustalX2.1軟件進行序列比對,并輔以人工修正。以靈芝(Ganoderma lucidum)作為外參,基于來自NCBI中的12個種的ITS序列,連同試驗中的 ITS 序列共14條序列一起用于系統(tǒng)發(fā)育分析。用MEGA 5.02中的鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)樹。從圖2可以看出,S2與球蓋菇屬大球蓋菇(Stropharia rugosoannulata)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近。

    3 結(jié)論與討論

    對于野生食用菌的人工馴化,首先須要獲得純化菌種,常見的菌種分離方法有組織分離法、孢子分離法和基內(nèi)菌絲分離法,其中組織分離法因簡單、易操作且純化率高,在實踐中被廣泛地應(yīng)用[11]。本試驗采用組織分離法對野生大球蓋菇進行分離,試驗結(jié)果表明,野生大球蓋菇能夠成功分離獲得母種,并且子實體經(jīng)2 h的晾曬,既能有效降低污染率,又不影響萌發(fā)和菌絲的生長,而長時間的晾曬則會嚴重抑制菌絲的萌發(fā)和生長??赡苁墙?jīng)過適宜時間的晾曬,子實體水分減少從而減少了細菌污染,再加上陽光中的紫外線具有殺菌功能,進一步降低污染,但長時間晾曬使子實體脫水,菌絲體細胞活力減弱甚至死亡,從而影響分離效果。大球蓋菇最佳的分離部位是菌蓋與菌柄交接處,該部位分離的菌絲生長速度快,長勢旺盛且污染率低,可能的原因是該部位是子實體的生長點,菌絲體細胞活力強,分裂速度快,且該部位與空氣接觸少,雜菌少。在食用菌工廠化生產(chǎn)中,液體菌種因其生產(chǎn)周期短、菌齡一致、菌種生產(chǎn)成本低、接種簡便等優(yōu)點,得到了十分廣泛的應(yīng)用[12]。本試驗篩選出最適宜的液體培養(yǎng)基配方為A2,即基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基A1+蛋白胨15 g,采用此配方培養(yǎng)的液體菌種,菌絲體生物量高,菌絲球密度大,形態(tài)好。原因可能是此配方所含的蛋白胨中營養(yǎng)更豐富,氮的形態(tài)更適合菌絲體吸收。

    目前菌種鑒定、遺傳多樣性研究主要基于形態(tài)學(xué)、細胞、生化及分子水平開展[13],其中ITS序列分析法因準確性高,簡便易行而具有很大的應(yīng)用價值。本試驗通過對供試子實體與菌絲體的ITS序列進行擴增、測序、比對,驗證了供試菌絲體為大球蓋菇子實體的分離物,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹后發(fā)現(xiàn),分離獲得的純培養(yǎng)菌絲體與球蓋菇屬的大球蓋菇(Stropharia rugosoannulata)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近,與其同源性高達99%,確定為大球蓋菇菌種。

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