新疆楊樹葉紋斑病病原菌分離及致病性測定

張金萍+蔣萍

摘要：2014—2015年通過實地考察、采集病葉標本并采用常規(guī)的組織分離方法對病葉中的病原菌進行分離，對分離物培養(yǎng)純化，并觀察其形態(tài)特征，為確定這些分離物是否為楊樹葉紋斑病的致病菌，根據柯赫氏法則進行分離物的致病性測定及再分離試驗。結果表明，相同癥狀的病葉可以分離出多個不同的菌株，由于不同菌株的致病性強弱不一，使得在不同的接種條件下，不同菌株對健康楊樹葉片的致病性差異顯著，潛育期及發(fā)病率均不相同，根據ArcGIS軟件對病葉進行分級，統(tǒng)計病情指數(shù)，并進行LSD檢驗，判斷出強致病菌。通過再分離試驗得到原致病菌，在顯微鏡下對強致病菌進行形態(tài)學鑒定，初步判定為鏈格孢屬（Alternaria sp.）真菌。

關鍵詞：楊樹葉紋斑病；病原菌分離；致病性測定；鏈格孢屬

中圖分類號： S763.15 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0110-04

楊樹是楊柳科楊屬（Populus L.）落葉喬木的通稱，全屬共有100多個品種，其中有50多種分布在我國，主要栽種于我國西部各省。在北疆的額爾齊斯河流域、南疆的塔里木河流域以及天山南北坡的河谷中分布著大面積的楊樹原始林[1-2]，楊樹也是新疆地區(qū)綠化造林的重要樹種之一。國內外報道的有關楊樹葉部壞死斑類的病害主要有褐斑?。∕arssonina brunnea）[3]（別稱黑斑?。?、灰斑?。–oryenum populinum）、皺葉?。‥riophyes dispar）[4]、角斑病（Cercospora populina）[5]、葉緣枯?。∕acrophama sp.）[6]、花葉?。–MV）、黑星病（Fusicladium tremulae）、葉枯?。ˋlternaria alternata）[7]、斑枯病（Septoria）等，其中葉枯病別稱葉紋斑病（Alternaria）[8-9]。徐素琴等1984年對黑龍江省森林植物園、遼寧省蓋縣楊樹研究所的病葉中的病原菌進行分離培養(yǎng)、鑒定，確定病原菌為細極鏈格孢（Alternaria tenuis），但未作病原菌的致病性測定[10]。1979年趙震宇首次報道了新疆楊樹葉紋斑病的病原菌為細鏈格孢菌，但未對病原菌進行分離及致病性測定[11]。黃毅2010年對采自東北林業(yè)大學林場的楊樹葉枯病病樣中的病原菌也進行了分離培養(yǎng)、鑒定，確定病原菌為[A. alternate （Fr.） Keissl]，但未作病原菌的致病性測定[5]。因此，本研究通過對新疆楊樹葉紋斑病病葉中的病原菌分離培養(yǎng)、純化及致病性測定，為進一步對楊樹葉紋斑病的病原菌進行鑒定及確認其分類地位提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

楊樹病葉于2014年5月至2015年9月采自烏魯木齊市、石河子市、沙雅縣、阿拉爾市、瑪納斯縣等地區(qū)。

1.2 病原菌分離培養(yǎng)

采用組織分離法[12]，取病健交界處組織，切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，放入無菌的燒杯中，用0.1%氯化汞溶液消毒60 s，然后用無菌水漂洗3次，最后用無菌濾紙吸去多余的水分，將病塊組織移入PDA培養(yǎng)基平板上，每皿放5塊，3次重復，以健康葉片組織作對照，放入25 ℃光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后挑取菌落邊緣菌絲進行純化。分離率=病原菌菌落數(shù)/分離組織塊總數(shù)×100%。

1.3 致病性測定

1.3.1 接種菌株 根據菌株的菌落特征，從烏魯木齊市分離菌株中選3個菌株、阿拉爾市選2個菌株、瑪納斯縣選2個菌株、石河子市選3個菌株、沙雅縣選2個菌株，共選取12個菌株。

1.3.2 接種材料 離體葉片：從活體樹上摘下健康的楊樹葉片?；铙w樹：田間健康楊樹。

1.3.3 接種體 菌餅：在純化7 d后的菌落上，打取直徑為 6 mm 的菌餅作為接種體。

孢子懸浮液的制備：將菌餅接種到PDA液體培養(yǎng)基（100 mL/瓶）中，每個菌株接種3瓶，共接種36瓶。置于 28 ℃ 恒溫箱中振蕩培養(yǎng)7 d后，用磁力攪拌機攪拌3 min制成孢子懸浮液。

1.3.4 接種方法 將葉片用流水沖洗，再用70%乙醇表面消毒，自然晾干，備用。接種方法分為刺傷和無傷接種，刺傷接種時先用無菌針在葉片接種部位刺傷4個點，將直徑為 6 mm 的菌餅的菌絲面貼于傷口上，對照接空白培養(yǎng)基塊。孢子懸浮液接種用同樣的刺傷方法，將配制好的孢子懸浮液噴灑在刺傷葉片的正反兩面，對照噴灑無菌水。無傷接種時直接將菌餅貼在葉片接種部位上，對照接空白培養(yǎng)基塊。無傷孢子懸浮液接種即將配制好的孢子懸浮液噴灑在健康葉片的正反兩面，對照噴灑無菌水。各接種處理均重復3次，接種后噴無菌水保濕48 h，定期觀察并記錄發(fā)病情況，計算發(fā)病率。發(fā)病率= 發(fā)病點數(shù)/接種總點數(shù)×100%。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離結果

2014—2015年對不同地區(qū)的病葉進行5次常規(guī)組織分離[11]，共分離268塊組織（表1），其中真菌菌落232個，占總數(shù)的86.6%；根據真菌菌落的顏色、形態(tài)特征及生長速度的差異性[13]共分為5類菌株，將菌株在PDA平板上純化3 d后，可以觀察到菌落形態(tài)特征的差異性。如圖1所示，第1類菌株表面呈灰白色的絨毛狀，菌落疏松；第2類菌株表面呈灰色棉絮狀，較為蓬松；第3類菌株表面呈深褐色的絨毛狀，菌落較為緊密；第4類菌株表面呈紫紅色且有較長的絨毛覆蓋，菌落疏松；第5類菌株表面呈粉紅色且有較短的絨毛，菌落緊密。

2.2 分離物致病性測定結果

2.2.1 室內離體材料接種 由表2可知，健康的楊樹葉片接種12個真菌（表3）后，用菌餅接種的楊樹葉片發(fā)病速度最快，潛育期最短，其中楊樹葉片接種菌株M1、M2、M3、M11后發(fā)病率均達到100%，接種菌株M4、M8后發(fā)病率均為91.7%，接種菌株M6、M9后楊樹葉片的發(fā)病率均為83.3%。剩余菌株致病性較弱，在相同的接種時間內，潛育期較長，發(fā)病率較低。用孢子懸浮液接種后，對照均不發(fā)病，楊樹葉片接種菌株M1、M2、M4、M11后發(fā)病率均大于50.0%。