野生白芨再生體系的建立及抗性篩選

余磊磊+周京龍+高中南

摘要：建立白芨的再生體系和優(yōu)化抗性篩選的最佳條件，為野生白芨高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定基礎(chǔ)。以野生白芨種子為外植體，研究野生白芨種子在萌發(fā)、愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽分化和增殖以及不定根誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，并利用梯度篩選出其對卡那霉素（Kan）和氨芐青霉素（Amp） 的抗性。種子萌發(fā)最佳培養(yǎng)基為1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+100 g/L 馬鈴薯；不定芽分化最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+8 mg/L硝酸銀+50 g/L馬鈴薯，誘導(dǎo)率高達(dá)95%；誘導(dǎo)生根最佳培養(yǎng)基為1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+100g/L 馬鈴薯。100 mg/L Kan和100 mg/L Amp為野生白芨遺傳轉(zhuǎn)化的最佳篩選壓；培養(yǎng)過程中添加外源有機(jī)物可以有效地促進(jìn)愈傷組織和不定芽的分化與增殖。建立了野生白芨種子的再生體系，發(fā)現(xiàn)了野生白芨種子的第3條發(fā)育途徑——愈傷組織分化途徑，并篩選出了適宜于野生白芨遺傳轉(zhuǎn)化體系的Kan和Amp篩選壓。

關(guān)鍵詞：白芨；愈傷組織分化途徑；再生體系；抗性篩選

中圖分類號：S567.23+9.043 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2017）01-0043-04

白芨為蘭科（Orchidaceae）白芨屬（Bletilla）多年生草本植物。因其花色和形狀等形態(tài)的不同，又被分為黃花白芨（B. ochracea）、華白芨（B. sinensis）、小白芨（B. formosana）和白芨（B. striata）4種[1]。在我國白芨主要分布于長江流域地區(qū)，其獨(dú)特的藥用價值，使其遭遇多年的掠奪式采挖，野生資源日益減少，瀕臨滅絕邊緣，現(xiàn)已被國家列為重點(diǎn)保護(hù)的野生藥用植物資源。白芨果莢內(nèi)種子多呈紡錘形，僅僅由幾個發(fā)育不完全的胚細(xì)胞構(gòu)成，無胚乳，無貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)供給種子萌芽[2]，因而其在自然條件下萌發(fā)率極低。構(gòu)建其再生體系，可以初步有效解決育苗難題。白芨屬植物因其花色艷麗多彩，花型引人注目而具有較高觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值，其地下假鱗莖中含有的白芨膠具有收斂止血、清熱解毒、消腫生肌之功效[3]，同時還具有較強(qiáng)的抗氧化和抗衰老作用，可用于保健、護(hù)膚及美容養(yǎng)顏等[4-5]。而野生白芨資源本身稀缺，加之含有的藥用成分白芨膠較少，野生采挖的白芨假鱗莖根本無法滿足目前的提取需求。現(xiàn)有的研究大多集中在其再生體系的建立上，很少通過生物技術(shù)增加白芨膠的含量，因此要以白芨種子為基礎(chǔ)，篩選出葉芽對卡那霉素（Kan）、氨芐青霉素（Amp）的抗性臨界點(diǎn)，通過基因工程途徑構(gòu)建其遺傳轉(zhuǎn)化體系，培育白芨膠含量更高的白芨品種。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白芨蒴果采自湖北神龍架林區(qū)，蒴果采期為花期結(jié)束后約120 d，蒴果未開裂且內(nèi)部白芨種子成熟。

1.2 蒴果消毒及種子萌芽

將果莢用自來水沖洗10 min，在超凈工作臺上先用75%乙醇消毒30 s，再用4%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，消毒期間不停地翻動果莢，使其消毒徹底，無菌水漂洗3次，然后用無菌濾紙吸干果莢表面的水分待用。在無菌條件下剖開蒴果，將種子均勻地抖落到培養(yǎng)基表面。本實(shí)驗(yàn)室篩選的白芨種子萌芽培養(yǎng)基：1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA（pH值5.8），然后置于溫度為（25±2） ℃的恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)[6]，前2周為暗培養(yǎng)，2周之后轉(zhuǎn)為光暗交替培養(yǎng)，光照度為2 000～2 500 lx，光—暗周期14 h—10 h。

1.3 白芨愈傷組織的誘導(dǎo)

愈傷組織的形成有2種方式，一是在種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，有部分種胚直接發(fā)育形成愈傷組織。二是將培養(yǎng)60 d的野生白芨的無菌幼苗切去根部和子葉，留下原球莖或者根狀莖，切成0.3～0.5 cm2 小塊，用不同質(zhì)量濃度的細(xì)胞分裂素6-BA與生長素NAA組合誘導(dǎo)形成愈傷組織，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計如下：（1） 1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+2 mg/L硝酸銀+50 g/L馬鈴薯；（2） 1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+4 mg/L硝酸銀+50 g/L馬鈴薯；（3）1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+6 mg/L硝酸銀+100 g/L馬鈴薯；（4）1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+8 mg/L硝酸銀+100 g/L馬鈴薯；所有培養(yǎng)基的pH值均為5.8，愈傷組織的誘導(dǎo)在黑暗條件下進(jìn)行。

1.4 白芨不定芽的分化誘導(dǎo)

當(dāng)愈傷組織長到約1 cm3左右，可進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)。叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計如下：（1）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；（2）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+4 mg/L硝酸銀；（3）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+8 mg/L硝酸銀；（4）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+12 mg/L硝酸銀；（5）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+8 mg/L硝酸銀+50 g/L馬鈴薯；（6）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+8 mg/L硝酸銀+100 g/L馬鈴薯；（7）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+8 mg/L硝酸銀+200 g/L馬鈴薯；所有培養(yǎng)基的pH值均為5.8，不定芽的分化誘導(dǎo)在光照條件下進(jìn)行，光照度為2 000～2 500 lx。

1.5 白芨的生根培養(yǎng)

待叢生芽長到2～3 cm 時切下，放置在下列培養(yǎng)基進(jìn)行生根誘導(dǎo)：（1）1/2MS+2.0 mg/L NAA；（2）1/2MS+1.5 mg/L NAA；（3）1/2MS+1.0 mg/L NAA；（4）1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA；（5）1/2MS+0.5 mg/L NAA+50 g/L 馬鈴薯；（6）1/2MS+0.5 mg/L NAA+100 g/L 馬鈴薯；共6種不同的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)生根，所有培養(yǎng)基的pH值均為58。在光暗交替下進(jìn)行誘導(dǎo)生根，光照度為2 000～2 500 lx，光—暗周期14 h—10 h。

1.6 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

由于野生白芨種子為不完全結(jié)構(gòu)，其種子中僅有胚，而不含有胚乳，且種子表面被1層透明的種皮包被，使得外源營養(yǎng)物質(zhì)很難進(jìn)入到種皮內(nèi)，因此對于幾乎沒有營養(yǎng)物質(zhì)貯藏的野生白芨種子來說，添加其他物質(zhì)于培養(yǎng)基中就可能會有助于其愈傷組織的分化增殖和防止褐化現(xiàn)象。本試驗(yàn)以最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)添加以下物質(zhì)，外源有機(jī)物馬鈴薯過濾液：10、50、100 g/L；硝酸銀：4、6、8、10 mg/L；活性炭0.8 g/L。

1.7 野生白芨對抗生素敏感性的測定

將白芨愈傷組織切成 0.5 cm3左右的小塊，分別放置到不同濃度氨芐青霉素（Amp）和卡那霉素（Kan）的再生培養(yǎng)基1/2MS+3% Surcose+0.3% Phytagel+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+100 g/L馬鈴薯上，觀察不同濃度的Amp和Kan對白芨愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響，以確定最優(yōu)的篩選壓，篩選出適宜的濃度用于遺傳轉(zhuǎn)化。Amp的濃度梯度為0、20、50、100、150 mg/L，Kan的濃度梯度為0、25、50、75、100、125、150 mg/L，培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計篩選的效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子的有胚率分析

成熟野生白芨的果莢顏色為黃褐色，野生白芨種子的結(jié)構(gòu)，多呈紡錘形，由1層透明的種皮和乳白色的胚組成，且無胚乳，幾乎沒有營養(yǎng)物質(zhì)的貯藏[6]，有些種子顯微鏡下觀察還可以發(fā)現(xiàn)其殘留的胚柄，而且經(jīng)試驗(yàn)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)有一些種子只有種皮而沒有胚，這是因?yàn)椴勺陨颀埣芰謪^(qū)的的野生白芨果莢未完全成熟所致，這與張建霞等報道的白芨種子的胚齡為20 周（140 d）后，胚基本停止發(fā)育，有胚率不再明顯提高，而胚的成熟度達(dá)到最佳[7]基本一致。在組織培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7 d后，含有胚的種子會逐漸膨大且轉(zhuǎn)為綠色。顯微觀察和統(tǒng)計結(jié)果（表1）表明，本次試驗(yàn)所用野生白芨種子的有胚率為57.5%。

2.2 野生白芨種子發(fā)育情況分析

白芨種胚如圖1所示，主要以2種途徑發(fā)育成小苗，第1種是種胚轉(zhuǎn)綠膨大形成小球體，進(jìn)而發(fā)育成原球莖；第2種是種胚膨大形成小球體，小球體先形成根狀莖，然后頂端逐漸轉(zhuǎn)綠分化出芽， 形成葉片[8]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)野生白芨種胚在培養(yǎng)基上，還存在除了張燕等報道的2種主要的發(fā)育途徑[5]以外的第3種次要發(fā)育途徑：由種胚直接發(fā)育為淡綠色的愈傷組織，而后不斷增殖，發(fā)育為叢生芽，進(jìn)而生長成完整植株。試驗(yàn)初步推測愈傷組織發(fā)育途徑可能與培養(yǎng)基中的外源添加有機(jī)物和種子的呼吸作用有關(guān)，其發(fā)生機(jī)理有待進(jìn)一步研究。對所有試驗(yàn)中種胚的發(fā)生情況進(jìn)行統(tǒng)計分析，在基本培養(yǎng)基相同且馬鈴薯的含量都為100 g/L的情況下，當(dāng)硝酸銀的含量為6、8 mg/L時，種胚的愈傷組織為濃綠色（圖2），其愈傷組織發(fā)育率分別為26.0%和22.8%（表1），表明6 mg/L的硝酸銀是種胚愈傷組織發(fā)育的最佳含量，且當(dāng)硝酸銀含量在6 mg/L以下時，其種胚的愈傷組織發(fā)育率與硝酸銀的含量呈正相關(guān)。由表1可知種胚的愈傷組織發(fā)育率和馬鈴薯的含量呈正相關(guān)。

2.3 不同激素濃度對野生白芨叢生芽的誘導(dǎo)

試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明不定芽的誘導(dǎo)率最高的培養(yǎng)基為A3培養(yǎng)基（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+ 8 mg/L 硝酸銀+50 g/L馬鈴薯），其誘導(dǎo)率高達(dá)95%，增殖系數(shù)為324，誘導(dǎo)的叢生芽較多，呈濃綠色，較粗壯，但生長緩慢，有褐化現(xiàn)象出現(xiàn)。而A4培養(yǎng)基（MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+10 mg/L硝酸銀+100 g/L馬鈴薯）中不定芽的誘導(dǎo)率為85%，叢生芽增殖系數(shù)最高，為6.03，誘導(dǎo)的叢生芽，多為青綠色，生長較快且很粗壯，較少有玻璃化現(xiàn)象出現(xiàn)（圖3）。A1培養(yǎng)基（MS+0.2 mg/L 6-BA+1.5mg/L NAA+4 mg/L硝酸銀+50 g/L馬鈴薯）和A2培養(yǎng)基（MS+0.5mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+6 mg/L硝酸銀+100 g/L馬鈴薯）的分化效率和增殖系數(shù)較低，誘導(dǎo)率分別為22.5%和67.5%，增殖系數(shù)分別為2.12和3.11，且玻璃化現(xiàn)象和褐化現(xiàn)象嚴(yán)重。統(tǒng)計分析可知，A4培養(yǎng)基雖然叢生芽誘導(dǎo)率未達(dá)到最高，為85%，但其增殖系數(shù)高達(dá)6.03，可有效誘導(dǎo)葉芽分化和增殖，能更好地滿足植物基因工程研究的需要。

在野生白芨無菌苗的根狀莖上進(jìn)行間接愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，青綠色的愈傷組織質(zhì)地較緊密，可誘導(dǎo)分化出粗壯的叢生芽， 且分化效率更高（圖4）。由表2數(shù)據(jù)分析可知，愈傷組織的分化誘導(dǎo)率和叢生芽的增殖系數(shù)與NAA的濃度、6-BA/NAA的濃度配比以及外源有機(jī)物馬鈴薯的含量呈正相關(guān)，在硝酸銀濃度不超過8 mg/L時，愈傷組織的分化誘導(dǎo)率和叢生芽的增殖系數(shù)會隨著其濃度的增加而提高，但當(dāng)硝酸銀的濃度為10 mg/L時，其愈傷組織的分化誘導(dǎo)率出現(xiàn)下降，說明過高的硝酸銀濃度不利于其愈傷組織的誘導(dǎo)分化。外源有機(jī)物可以有效提高其叢生芽的增殖系數(shù)，有利于芽的生長[9]。

2.4 不定根的誘導(dǎo)

不定根的誘導(dǎo)對于植株再生體系的建立至關(guān)重要[10]，在本研究中采用的4種生根培養(yǎng)基中，B4培養(yǎng)基（1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+100 g/L 馬鈴薯）為最佳誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基，其不定根誘導(dǎo)率高達(dá)97.5%，不定根發(fā)生密集，生長速度快且粗壯，為白色或者綠色（圖5）。B1培養(yǎng)基（1/2MS+1.0 mg/L NAA+50 g/L 馬鈴薯）的誘導(dǎo)率較高，為85%，但其不定根的發(fā)生量較少。其他2種培養(yǎng)基B2和B3也能有效誘導(dǎo)不定根的分化，但也存在不定根較瘦弱的不足。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，NAA可以有效促進(jìn)不定根的誘導(dǎo)和分化，對不定根的生長有著決定性的作用，而細(xì)胞分裂6-BA會極大抑制不定根的發(fā)生。而添加了馬鈴薯的培養(yǎng)基中不定根生長更為健壯，且生長速度更快，說明馬鈴薯可以提高不定根的誘導(dǎo)效率（表3）。

2.5 Kan 和Amp 抗性濃度的篩選

將葉芽分別置于含有不同濃度Kan和Amp的MS+05 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+100 g/L馬鈴薯培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d 后觀察致死率（圖6、圖7），葉芽的致死率與Amp和Kan的濃度都成反比，當(dāng)Amp濃度為20 mg/L，其致死率僅為122%， 分化率高達(dá) 87.8%； 當(dāng)Amp濃度增加到 150 mg/L時，其致死率高達(dá)99.2%，分化率僅為0.6%（表4）。綜合試驗(yàn)的其他因素考慮，100 mg/L的Amp和100 mg/L的Kan是最佳的抗性濃度。

3 討論

野生白芨為蘭科植物，其種子發(fā)育不完整，且種子表面包被1層種皮，對于僅有種胚的種子的發(fā)芽是極大的障礙，這也使得野生白芨種子很難在自然條件下發(fā)芽。而合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境便成了其萌發(fā)的關(guān)鍵。在本試驗(yàn)采用的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)了野生白芨種胚發(fā)生的第3條途徑——愈傷組織途徑。對于野生白芨種胚直接從種子發(fā)育成愈傷組織的現(xiàn)象，初步猜想可能是以下原因造成的：（1）種子的不完全胚被種皮限制，種胚無法進(jìn)行正常生長；（2）由于采收的種子中種胚的發(fā)育程度和成熟度不一致，導(dǎo)致部分種子不能提供種胚正常發(fā)育的營養(yǎng)物質(zhì)。這也正好可以解釋白芨在野外自然條件下萌發(fā)率不足萬分之一，但是其愈傷組織途徑的發(fā)生機(jī)理還有待更進(jìn)一步的研究。

蘭科植物的整個生活史中均有共生菌參與其中，這種生長的特異性也使得蘭科植物組織培養(yǎng)過程的各個階段都需要外源有機(jī)物。在野生白芨的再生體系中，馬鈴薯過濾液對野生白芨種子再生體系各個階段的生長都有著極大的促進(jìn)作用，在培養(yǎng)基中添加100 g/L的馬鈴薯過濾液等外源有機(jī)物和硝酸銀等可以極大促進(jìn)愈傷組織的分化和叢生芽的增殖，從而為野生白芨的再生體系建立更為優(yōu)越的條件。

在本研究中成功篩選出野生白芨的葉芽對 Kan和Amp 抗性的濃度分別為100 mg/L 和100 mg/L。本研究結(jié)果為野生白芨應(yīng)用于植物基因工程，尤其是為培育白芨膠含量更高的優(yōu)質(zhì)白芨品種提供了參考。

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