基于3種基因啟動子甲基化聯(lián)合端粒長度構(gòu)建肺癌篩查神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型*

王 威，段曉冉，譚善娟，姚永成，吳逸明，吳擁軍

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與職業(yè)病學(xué)教研室 鄭州450001 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室 鄭州450001

#通訊作者，男，1968年1月生，博士，教授，研究方向:肺癌的早期診斷，E-mail:wuyongjun@zzu.edu.cn

目前無論是在經(jīng)濟發(fā)達還是發(fā)展中國家，肺癌已成為男性癌癥死亡的首要原因。在中國，肺癌居各類惡性腫瘤之首，發(fā)病率和病死率逐年上升，因早期無特異癥狀，且臨床缺乏有效早期診斷方法，大部分肺癌患者確診時已到中晚期，總體5 a 生存率大約只有15%［1-2］。因此，運用分子生物學(xué)的方法檢測腫瘤發(fā)生過程中的早期分子標志，從而發(fā)現(xiàn)癌前病變或早期癌變被認為是肺癌早期診斷最具應(yīng)用前景的手段。大量研究［3-4］表明，p16、RASSF1A 和脆性組氨酸三聯(lián)體(fragile histidine traid，F(xiàn)HIT)等基因甲基化修飾引起的抑癌基因表達沉默在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。外周血DNA 端粒長度縮短亦可增加患肺癌的危險性。該研究采用3 層拓撲結(jié)構(gòu)的BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，以上述4 項分子生物標志為基礎(chǔ)建立肺癌的早期預(yù)警模型，為肺癌的早期診斷提供有效的方法。

1 對象與方法

1.1 研究對象和內(nèi)容 肺癌組的血標本取自于2009年1月至2010年6月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科和胸外科200例原發(fā)性肺癌患者(鱗癌87例，腺癌72例，小細胞肺癌33例，大細胞肺癌8例;臨床Ⅰ+Ⅱ期共55例，Ⅲ+Ⅳ期共145例);對照組的血標本取自同期鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢科體檢的200例正常人(均未發(fā)現(xiàn)肺部或者其他器官的惡性腫瘤)。所有研究對象均知情同意。研究內(nèi)容包括年齡、性別、吸煙史(每天吸煙1 支且吸煙1 a以上視為吸煙者［5］)和實驗室檢測指標。

1.2 主要儀器和試劑 PTC200 型PCR 擴增儀(美國MJ Research 公司)，EPS-350 電泳儀(瑞典Pharmaera-LKB 公司)，Real-time PCR 儀MX3000P(美國Startagene 公司)，全血基因組DNA 提取試劑盒(上海萊楓生物科技有限公司)，引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，GoTaq qPCR Master Mix(美國Promega 公司)，甲基轉(zhuǎn)移酶(美國NEB 公司)。

1.3 實驗室指標的檢測 嚴格按照全血基因組DNA 提取試劑盒的操作步驟提取外周血基因組DNA。采用實時熒光定量甲基化特異PCR(realtime methylation specific PCR，qMSP)方法檢測p16、RASSF1A 和FHIT 基因的甲基化水平，參考文獻［6］計算樣本甲基化水平(甲基化率)。以GAPDH 作為內(nèi)參基因，用熒光定量PCR 法測定端粒相對長度［4，7］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 12.0 處理數(shù)據(jù)。應(yīng)用兩獨立樣本秩和檢驗比較2組甲基化率的差異，兩獨立樣本t 檢驗比較2組患者年齡、端粒相對長度的差異，χ2檢驗比較2組性別構(gòu)成和吸煙史的差異;檢驗水準α=0.05。

1.5 Fisher 判別分析模型的構(gòu)建 見文獻［4］。

1.6 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建

1.6.1 數(shù)據(jù)的預(yù)處理 ①數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換:用SPSS Clementine 12.0 對數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，根據(jù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型中Sigmoid 傳遞函數(shù)的要求，選用最大最小法對數(shù)據(jù)進行歸一化處理，以避免由于輸入和輸出數(shù)據(jù)之間的數(shù)量級別差異較大而造成較大的訓(xùn)練誤差。②數(shù)據(jù)分組:按3∶1 的比例將200例肺癌患者和200例正常對照分成75%的訓(xùn)練集(肺癌患者和正常對照各150例)和25%的預(yù)測集(肺癌患者和正常對照各50例)。

1.6.2 模型的建立 采用3 層拓撲結(jié)構(gòu)的BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，分別在SPSS Clementine 12.0(C-神經(jīng)網(wǎng)絡(luò))和Matlab 7.1(M-神經(jīng)網(wǎng)絡(luò))下進行訓(xùn)練，BP算法的傳遞函數(shù)取在［0，1］內(nèi)連續(xù)的Sigmoid函數(shù)。

1.6.3 模型的評價 評價指標包括靈敏度、特異度、準確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及ROC 曲線下面積(AUC)，AUC ＜0.5 表示無診斷意義，0.5～表示準確度較低，0.7～表示準確度較好，0.9～表示準確度最好;用MedCalc V11.6.0.0 計算不同模型的AUC 及95%CI。

2 結(jié)果

2.1 2組人群一般特征 見表1。

表1 肺癌組和正常對照組研究對象的一般特征

2.2 2組基因啟動子甲基化水平及端粒相對長度的比較 見表2。肺癌組p16、RASSF1A 和FHIT 基因啟動子甲基化水平高于正常對照組，端粒相對長度低于對照組。

表2 2組外周血p16、RASSF1A和FHIT 甲基化率(%)及端粒相對長度的比較

2.3 Fisher 判別分析模型和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建見表3。

表3 各模型對訓(xùn)練集和預(yù)測集的分類結(jié)果

2.4 3 種模型的效果評估結(jié)果 見表4。Fisher 判別分析模型準確度較低，而BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型準確度較高，但是3 種模型AUC 及95%CI 重疊，說明模型的預(yù)測效果并無差異。

表4 3 種模型效果評估

3 討論

已經(jīng)證實，基因啟動子異常甲基化是抑癌基因失活的一個重要表觀遺傳學(xué)機制，并且參與包括肺癌在內(nèi)的腫瘤的發(fā)生發(fā)展［8-9］。許多研究［10-11］結(jié)果均顯示p16、RASSF1A 和FHIT 基因的甲基化與肺癌相關(guān)。該研究也表明，肺癌組p16、RASSF1A 和FHIT 基因啟動子甲基化水平均高于正常對照組。已有研究［12］證明p16 基因的啟動子區(qū)CpG 島高甲基化是p16 基因在癌癥發(fā)生早期就失活的主要機制。該研究結(jié)果表明外周血p16 基因甲基化水平可以作為預(yù)測肺癌的一項重要腫瘤標志。RASSF1A基因也是一個抑癌基因，主要是通過細胞周期蛋白的聚集而誘導(dǎo)細胞周期阻滯［13］。且已有研究［14-15］證實FHIT 基因啟動子甲基化是該基因表達失活的主要機制，因此，檢測FHIT 基因啟動子甲基化可能有助于肺癌早期診斷。

端粒是真核細胞中用于維持染色體完整性和穩(wěn)定性的線性染色體末端的非編碼DNA 的重復(fù)序列以及與之相連的端粒結(jié)合蛋白功能復(fù)合體［16］。課題組前期研究［16］發(fā)現(xiàn)肺癌組端粒長度要短于對照組，這與國外的研究［17-18］結(jié)果一致。這些結(jié)果提示外周血基因組DNA 端粒長度可以作為預(yù)測肺癌的一項重要的腫瘤標志。

BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型是迄今為止應(yīng)用最廣泛的一種神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，在樣本的學(xué)習(xí)過程中強調(diào)對樣本的錯分最小，即經(jīng)驗風(fēng)險最小化。該研究精簡了納入的生物標志，將4 種生物標志納入神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型中，在不同軟件環(huán)境下對肺癌進行預(yù)測，準確度達到76.0%和78.0%，而Fisher 判別分析，準確度僅為67.0%。課題組前期采用腫瘤標志聯(lián)合數(shù)據(jù)挖掘建立的模型對肺癌的預(yù)測準確度都達到90% 以上［19］。該研究建立的模型準確度低于前期研究模型，可能與樣本不同有關(guān)，也可能與納入模型的生物標志類型和數(shù)量不同有關(guān)。下一步需要用同一批標本對不同生物標志模型進行比較，進一步篩選生物標志、優(yōu)化判別模型。

總之，該研究發(fā)現(xiàn)人外周血DNA 中 p16、RASSF1A、FHIT 基因啟動子甲基化及端粒相對長度與肺癌有關(guān)，首次應(yīng)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型成功構(gòu)建了基于上述4 種生物標志的肺癌判別模型。該研究結(jié)果具有較高的潛在應(yīng)用價值，如果能夠應(yīng)用于肺癌高危人群篩查，對肺癌的早期診斷、早期治療和疾病康復(fù)具有重要價值。

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