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    miR-581對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖能力的影響①

    2017-02-27 05:56:33李龍梅泮紅飛羅軍敏馮繼紅
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2017年2期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞株克隆直腸癌

    李龍梅 泮紅飛 張 紅 羅軍敏 馮繼紅

    (遵義醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地,遵義563003)

    miR-581對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖能力的影響①

    李龍梅 泮紅飛 張 紅 羅軍敏 馮繼紅②

    (遵義醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地,遵義563003)

    目的:探討miR-581對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖能力的影響。方法:分別用攜帶miR-581基因的慢病毒顆粒(LV-miR-581-GFP)和miR-581 mimics(miR-581)轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620作為實(shí)驗(yàn)組;用對(duì)照組病毒顆粒(LV-GFP)和對(duì)照組mimics (Vector)轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞株作為陰性對(duì)照組。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-581的mRNA表達(dá)水平;CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力的變化。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組SW620細(xì)胞中miR-581表達(dá)較對(duì)照組明顯增高(P<0.05);CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖及克隆形成能力較對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P<0.05)。 結(jié)論:miR-581對(duì)結(jié)直腸癌SW620 細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。

    miR-581;結(jié)直腸癌;增殖

    結(jié)直腸癌是世界上常見(jiàn)惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率逐年上升,2015年癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)道,其每年新發(fā)病例130多萬(wàn),死亡率49萬(wàn)多,嚴(yán)重威脅人類的健康[1]。盡管近年來(lái)結(jié)直腸癌治療水平不斷提高,但結(jié)直腸癌患者死亡率仍不斷上升[2]。結(jié)直腸癌發(fā)病是一個(gè)多因素,多步驟的過(guò)程。因此,在分子水平揭示結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,尋找新的靶分子治療和干預(yù)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。

    miRNAs是一類長(zhǎng)度約22~24個(gè)核苷酸的非編碼RNA,通過(guò)與靶基因的3′端結(jié)合調(diào)控靶基因的表達(dá)[3,4]。近年研究發(fā)現(xiàn),多種miRNAs在結(jié)直腸癌中異常表達(dá),miRNAs作為促癌基因或抑癌基因參與細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程,與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。miR-130b可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)凋亡[6];miR-21通過(guò)靶向MARCKS對(duì)前列腺癌的增殖、侵襲和凋亡發(fā)生作用[7]。miR-581是新近發(fā)現(xiàn)的miRNA,有研究發(fā)現(xiàn),miR-581在肝癌組織中低表達(dá),且對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[8]。在我們前期研究中,通過(guò)基因芯片篩查發(fā)現(xiàn)miR-581與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。因此,本研究初步探討miR-581對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖及生長(zhǎng)的影響,為進(jìn)一步探討miR-581在結(jié)直腸癌中所發(fā)揮的生物學(xué)功能作用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞株及主要試劑 實(shí)驗(yàn)所選用SW620細(xì)胞株購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù);L-15培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;慢病毒誘導(dǎo)表達(dá)載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因;miR-581 mimics購(gòu)自北京歐格林生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司;細(xì)胞增殖檢測(cè)CCK8試劑購(gòu)自Sigam公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620選用L-15培養(yǎng)基,培養(yǎng)液中含10%FBS和1% PEST。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2,每2~3 d換液1次,當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部時(shí),收集細(xì)胞。

    1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620細(xì)胞用胰酶消化,計(jì)數(shù)后均勻接種于6 孔板,分為2組:實(shí)驗(yàn)組(LV-miR-581)、空載慢病毒對(duì)照組(LV-NC) 。待細(xì)胞完全貼壁、細(xì)胞匯合率達(dá)60% 左右后進(jìn)行轉(zhuǎn)染,依次加入終濃度為8 μg/ml Polybrene、Eni.S、L-15 培養(yǎng)基及稀釋的標(biāo)準(zhǔn)濃度病毒液( MOI 為100) ,使其總體積達(dá)1 ml,轉(zhuǎn)染48 h 后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。

    1.2.3 mimics轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620 細(xì)胞用胰酶消化,計(jì)數(shù)后均勻接種于6 孔板,分為2組:實(shí)驗(yàn)組(miR-581)、對(duì)照組(Vector)。待細(xì)胞完全貼壁、待細(xì)胞匯合率達(dá)到75%進(jìn)行轉(zhuǎn)染,用無(wú)血清培養(yǎng)基分別稀釋Lipofectamine 2000(3 μl)、miR-581 mimics (5 μl)或?qū)φ战Mmimics(5 μl)。室溫孵育5 min,將mimics和Lipofecta mine 2000混合,混勻后,37℃孵箱孵育20 min,分別加入細(xì)胞中,培養(yǎng)條件同上。

    1.2.4 總RNA提取 用Trizol 法按說(shuō)明書(shū)提取SW620細(xì)胞的總RNA,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的總RNA 的純度,要求A260/A280比值為1.8~2.0。

    1.2.5 cDNA 合成和qRT-PCR 取1 μg總RNA行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),miR-581逆轉(zhuǎn)錄體系及反應(yīng)條件按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。qRT-PCR反應(yīng)體系及條件:Premix Ex Taq Version 2.0 10 μl,ddH2O 8 μl, cDNA 1 μl, 20×TaqMan Small RNA Assay 1 μl, 95℃預(yù)變性 5 min,95℃ 15 s,60℃ 15 s,45個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增產(chǎn)物在4%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行凝膠電泳,確定擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段大小。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

    1.2.6 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化 參照CCK8試劑說(shuō)明進(jìn)行,分別取上述2組細(xì)胞以5×103孔-1的密度接種于96孔培養(yǎng)板(100 μl/孔),37℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)24 h后,加入10 μl CCK8繼續(xù)孵育2 h后,用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度值。每隔24 h檢測(cè)一次,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.7 克隆形成檢測(cè)克隆形成能力 分別取上述兩組細(xì)胞以500/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板(2 ml/孔),37℃、5%的CO2條件下培養(yǎng),2~3 d換液一次;15 d后PBS清洗細(xì)胞3次,10%甲醛固定30 min,結(jié)晶紫染色20 min,PBS清洗干凈,鏡下觀察計(jì)數(shù)。

    2 結(jié)果

    2.1 miR-581慢病毒感染效果 慢病毒感染結(jié)腸癌SW620細(xì)胞后48 h,倒置熒光顯微鏡下觀察感染效果,兩組細(xì)胞熒光感染率均達(dá)到80%左右,見(jiàn)圖1,qRT-PCR檢測(cè)感染后SW620細(xì)胞miR-581表達(dá),實(shí)驗(yàn)組(LV-miR-581)細(xì)胞miR-581的表達(dá)明顯高于對(duì)照組 (LV-NC)細(xì)胞,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2.2 miR-581過(guò)表達(dá)對(duì)增殖的影響

    2.2.1 CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果 培養(yǎng)2 d時(shí),兩組細(xì)胞之間的增殖速度沒(méi)有明顯差異(P>0.05),從第3天開(kāi)始,實(shí)驗(yàn)組(LV-miR-581)細(xì)胞增殖速度明顯高于對(duì)照組(LV-NC)細(xì)胞 (P<0.05),見(jiàn)圖2,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,miR-581過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)SW620細(xì)胞的增殖能力。

    2.2.2 克隆形成結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組(LV-miR-581)細(xì)胞克隆數(shù)明顯高于對(duì)照組(LV-NC)細(xì)胞(P<0.05),見(jiàn)圖3,表明過(guò)表達(dá)miR-581可以增強(qiáng)SW620細(xì)胞的克隆形成能力。

    圖1 慢病毒感染SW620細(xì)胞熒光表達(dá)情況及qPCR檢測(cè)感染后miR-581表達(dá)Fig.1 Lentivirus infection of SW620 cells and GFP expression and expression of miR-581 in SW620 cells were detected by qRT-PCRNote:*.P<0.05.

    圖2 miR-581過(guò)表達(dá)對(duì)SW620增殖能力的影響Fig.2 Effects of miR-581 overexpression on proliferation of SW620 cellsNote:*.P<0.05.

    圖3 過(guò)表達(dá)miR-581對(duì)SW620克隆形成能力的影響Fig.3 Effects of miR-581 overexpression on clone formation of SW620 cellsNote:**.P<0.01.

    圖4 qRT-PCR檢測(cè)SW620細(xì)胞miR-581的表達(dá)Fig.4 Expression of miR-581 in SW620 cells were detected by qRT-PCRNote:*.P<0.05.

    2.3 miR-581在結(jié)腸癌SW620細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率測(cè)定 以上結(jié)果可以看出miR-581可促進(jìn)細(xì)胞的增殖能力,為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果,用mimics轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48 h,qRT-PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞miR-581的表達(dá),實(shí)驗(yàn)組(miR-581)細(xì)胞miR-581的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(Vector)細(xì)胞(P<0.05),見(jiàn)圖4。

    圖5 過(guò)表達(dá)miR-581對(duì)SW620增殖能力的影響Fig.5 Effects of miR-581 overexpression on proliferation of SW620 cellsNote:*.P<0.05.

    圖6 過(guò)表達(dá)miR-581對(duì)SW620增殖能力的影響Fig.6 Effects of miR-581 overexpression on clone formation of SW620 cellsNote:*.P<0.05.

    2.4 miR-581過(guò)表達(dá)對(duì)增殖的影響

    2.4.1 CCK8結(jié)果 同miR-581慢病毒感染后結(jié)果相同,培養(yǎng)2 d時(shí),兩組細(xì)胞之間的增殖速度沒(méi)有明顯差異。從第3天開(kāi)始,實(shí)驗(yàn)組(miR-581)細(xì)胞的增殖能力高于對(duì)照組(Vector)細(xì)胞(P<0.05),見(jiàn)圖5。進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果,過(guò)表達(dá)miR-581可以促進(jìn)SW620細(xì)胞的增殖能力。

    2.4.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與慢病毒結(jié)果相吻合,實(shí)驗(yàn)組(miR-581)細(xì)胞克隆形成率較對(duì)照組(Vector)細(xì)胞明顯增高(P<0.05),見(jiàn)圖6。說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-581可以促進(jìn)SW620細(xì)胞的克隆形成能力。

    3 討論

    結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年上升,現(xiàn)居世界第三位。我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率也逐年增高,尋找新的靶基因是近年來(lái)腫瘤研究的熱點(diǎn)。miRNA通過(guò)與靶基因的3′端結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控基因表達(dá),近年研究發(fā)現(xiàn),miRNA既可作為促癌基因,也可作為抑癌基因,介導(dǎo)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成等多個(gè)病理過(guò)程,miRNA在腫瘤中的作用越來(lái)越受到人們的重視。例如,miR-21在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào),并分別通過(guò)靶向調(diào)控PDCD4、TIAM1、SPRY2、PTEN、TGFBR2、CDC25A等分子促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等[9-13];miR-224通過(guò)調(diào)節(jié)SMAD4促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移[14];miR-27通過(guò)作用于VEGFR發(fā)揮抗腫瘤血管生成作用[15];miR-126可下調(diào)乳腺癌中VEGF的表達(dá)而抑制其增殖和遷移能力[16]。

    miRNA可調(diào)控多種基因,參與多條信號(hào)通路網(wǎng)的調(diào)控,在腫瘤的增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)miR-581在肝癌組織中表達(dá)下調(diào),將miR-581 轉(zhuǎn)染入人肝腫瘤細(xì)胞株HepG2.2.15 可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖,并可通過(guò)靶向Dicer 和EDEM1 促進(jìn)HBsAg 的表達(dá),認(rèn)為在肝癌發(fā)生過(guò)程中下調(diào)miR-581可降低HBsAg 表達(dá)從而抑制肝細(xì)胞癌進(jìn)展[8,17]。而關(guān)于miR-581在結(jié)直腸癌進(jìn)展中的作用沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。本研究分別將miR-581的慢病毒載體和miR-581轉(zhuǎn)染入SW620細(xì)胞,經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩種方法均使SW620細(xì)胞高表達(dá)miR-581,并且發(fā)現(xiàn)兩種方法都顯示過(guò)表達(dá)miR-581組細(xì)胞增殖較對(duì)照組增強(qiáng),克隆數(shù)目較對(duì)照組增多,促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng),表明miR-581可促進(jìn)SW620細(xì)胞的增殖能力。

    本研究初步證實(shí)了miR-581過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌的增殖具有促進(jìn)作用。然而, miRNA在腫瘤調(diào)控機(jī)制中復(fù)雜,且細(xì)胞的增殖也是由多種基因進(jìn)行調(diào)控,所以,miR-581調(diào)控腫瘤增殖具體是通過(guò)哪個(gè)靶基因,其促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制具體又是什么,這些問(wèn)題都有待深入研究。在以后的研究中我們將繼續(xù)對(duì)其促增殖的具體機(jī)制及在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用進(jìn)行研究,全面了解miR-581在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用,為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。

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    [收稿2016-07-25 修回2016-09-21]

    (編輯 許四平)

    Effects of miR-581 overexpression on proliferation of human colorectal cancer SW620 cells

    LILong-Mei,PANHong-Fei,ZHANGHong,LUOJun-Min,FENGJi-Hong.

    DepartmentofImmunology,ZunyiMedicalCollege,BaseforGraduateEducationinGuizhouProvince,Zunyi563003,China

    Objective:To investigate the role of miR-581 overexpression on the proliferation of human colorectal cancer cell line SW620.Methods: The expression group,colorectal cancer SW620 cells were transfected with recombinant lentivirus vector (LV-miR-581) and miR-581 mimics(miR-581),the negative control group were transfected with negative control lentiviral vector (LV-GFP) and negative control mimics (vector).The mRNA expression of miR-581 was identified by qRT-PCR.Proliferation of the cells were detected by CCK8 assary and colony forming assary.Results: The expression of miR-581 at mRNA significantly increased in LV-miR-581 group compared with control groups were detected by qRT-PCR (P<0.05).Up-regulation of miR-581 markedly enhanced human colorectal cancer SW620 cells proliferation than those in the cells transfected with control vector (P<0.05).Conclusion: Forced expression of miR-581 accelerates the proliferation of colorectal cancer SW620 cells.

    miR-581;Colorectal cancer;Proliferation

    10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.018

    ①本文受國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81560407)資助。

    李龍梅(1987年-),女,在讀碩士,主要從事臨床免疫的研究。

    及指導(dǎo)教師:馮繼紅(1977年-),男,博士,副教授,主要從事結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移及腫瘤干細(xì)胞調(diào)控機(jī)制研究,E-mail:jh_f@163.com。

    R735.3

    A

    1000-484X(2017)02-0252-04

    ②遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院腹部腫瘤科,遵義563003。

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