• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外對(duì)臍帶血CD4+T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的研究

    2017-02-27 05:56:29徐志國(guó)王紹紅程紅玲閆銘杰
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2017年2期
    關(guān)鍵詞:臍帶血臍血調(diào)節(jié)性

    貢 波 徐志國(guó) 王紹紅 程紅玲 劉 超 閆銘杰

    (浙江省臍帶血造血干細(xì)胞庫(kù),協(xié)和華東干細(xì)胞基因工程有限公司,湖州313000)

    臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外對(duì)臍帶血CD4+T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的研究

    貢 波 徐志國(guó) 王紹紅 程紅玲 劉 超 閆銘杰①

    (浙江省臍帶血造血干細(xì)胞庫(kù),協(xié)和華東干細(xì)胞基因工程有限公司,湖州313000)

    目的:研究臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSCs)在體外對(duì)異源臍血CD4+T淋巴細(xì)胞增殖、凋亡及向CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)分化的免疫調(diào)控作用。方法:建立不同比例UCMSCs與植物血凝素(PHA)活化的臍血CD4+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),或與Transwell共培養(yǎng)體系,檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞增殖情況、CD4+CD25+/CD4+比率的變化及調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞標(biāo)志基因Foxp3相對(duì)表達(dá)量的變化。同時(shí),建立UCMSCs與地塞米松(DXM)刺激的臍血CD4+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),或與Transwell共培養(yǎng)體系,檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果:PHA活化的臍血CD4+T淋巴細(xì)胞在與UCMSCs共培養(yǎng)3 d后,較無(wú)UCMSCs對(duì)照組相比,細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05)且CD4+CD25+/CD4+T淋巴細(xì)胞的比率及Foxp3的相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P<0.01),并隨UCMSCs數(shù)量增加,作用增強(qiáng)(P<0.05)。DXM誘導(dǎo)的臍血CD4+T淋巴細(xì)胞與UCMSCs共培養(yǎng)7 d后,細(xì)胞凋亡比率較無(wú)UCMSCs對(duì)照組顯著降低(P<0.01)。上述效應(yīng)在Transwell共培養(yǎng)中部分減弱但無(wú)法消除。結(jié)論:UCMSCs對(duì)臍血CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)具有負(fù)調(diào)節(jié)作用,其作用主要表現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞增殖能力和分化的調(diào)控而不是促進(jìn)凋亡。

    臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞;臍血CD4+T細(xì)胞;CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;增殖;分化;凋亡

    間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層,最初由Friedenstein等[1]從骨髓中發(fā)現(xiàn)。MSCs擁有的天然免疫調(diào)節(jié)作用,在體外表現(xiàn)出了非MHC限制性、劑量依賴(lài)性抑制T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的特性[2],使其在器官移植、骨髓移植和自身免疫性疾病的防治中,發(fā)揮了重要作用[3,4]。

    目前,自身免疫性疾病是繼心血管疾病、癌癥后威脅人類(lèi)健康的第三大殺手,已被列入我國(guó)十類(lèi)重大疾病之一。某些自身免疫性疾病,如重癥肌無(wú)力(Myasthenia gravis,MG)、皮肌炎(Dermatomyositis,DM)等,對(duì)嬰幼兒童造成的困擾遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)成人。因此,研究MSCs對(duì)臍帶血來(lái)源T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能,對(duì)新生兒和兒童自身免疫性疾病的臨床研究具有重要提示意義。

    人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Human umbilical mesenchymal stem cells,hUCMSCs)與其他的成體干細(xì)胞相比,增殖分化能力更強(qiáng),已成為難治性疾病潛在的治療手段[5,6]。UCMSCs其在體外發(fā)揮抑制作用時(shí)沒(méi)有MHC限制性[7],能顯著降低移植物抗宿主病(Graft versus host disease,GVHD)反應(yīng),且同種異源性UCMSCs有不引起副反應(yīng)產(chǎn)生的特點(diǎn)[8]。hUCMSCs的培養(yǎng)及MSCs對(duì)成人外周血T淋巴細(xì)胞的調(diào)控研究已經(jīng)為眾多研究者報(bào)道[9-11],但有關(guān)hUCMSCs對(duì)臍帶血來(lái)源的免疫細(xì)胞調(diào)控作用的研究報(bào)道相對(duì)較少。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要試劑 ALyS505N-175培養(yǎng)基為日本細(xì)胞研究所產(chǎn)品;DMEM/F12培養(yǎng)基為Invitrogen產(chǎn)品;植物血凝素(Phytohemagglutinin,PHA)、地塞米松(Dexamethasone,DXM)為Sigma產(chǎn)品;胎牛血清(FBS)為Excell產(chǎn)品;淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll,1.077 g/L)為深圳達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn);CD4+T細(xì)胞分選試劑盒(CD4+T Cell Isolation Kit)為美天旎產(chǎn)品;絲裂霉素C(Mitomycin C,MMC)為Roche產(chǎn)品;RNA提取試劑盒(Ultrapure RNA Kit)為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTra Ace qPCR RT Kit)、Real-time PCR試劑盒(SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-)為日本TOYOBO產(chǎn)品;CD73-PE抗體、CD90-PE抗體、CD105-FITC抗體、CD29-PE抗體、CD44-PE抗體、CD31-PE抗體、CD34-PE抗體、CD45-FITC抗體、CD4-FITC抗體、CD25-PE抗體、凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin V-FITC/PI)為美國(guó)BD產(chǎn)品。

    1.1.2 樣本來(lái)源 實(shí)驗(yàn)?zāi)殠Ъ澳殠а獊?lái)源于浙江省臍帶血造血干細(xì)胞庫(kù)的捐獻(xiàn)標(biāo)本,HIV、HBV、HCV、CMV、梅毒螺旋體等檢測(cè)均為陰性。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 UCMSCs的分離培養(yǎng)及表面標(biāo)志檢測(cè) 將臍帶消毒后剪成2 mm3左右小塊,置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,加入15 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液,5%CO2,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取P3代細(xì)胞,將細(xì)胞密度調(diào)整為106個(gè)/ml,單抗(CD73-PE、CD90-PE、CD105-FITC、CD29-PE、CD44-PE、CD31-PE、CD34-PE、CD45-FITC)標(biāo)記,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞免疫表型。

    1.2.2 臍帶血CD4+T(UCB-CD4+T)淋巴細(xì)胞的獲取 采用Ficoll密度梯度離心法取得臍帶血單個(gè)核細(xì)胞(UCB-MNC)后,用含10%胎牛血清的ALyS505N-175培養(yǎng)基將UCB-MNC調(diào)整至106個(gè)/ml,置培養(yǎng)瓶中37℃孵育30 min,收集未貼壁細(xì)胞,按CD4+T Cell Isolation Kit說(shuō)明書(shū)操作,分選得到CD4+T淋巴細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4表達(dá)量。收集貼壁的抗原提呈細(xì)胞(Antigen-presenting cells,APCs),調(diào)整密度至104個(gè)/ml待用。

    1.2.3 不同數(shù)量UCMSCs與PHA作用下的UCB-CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng) 將達(dá)到80%融合的P3代UCMSCs分別以1×105個(gè)/孔和1×104/孔個(gè)兩種數(shù)量接種于24孔培養(yǎng)板或Transwell小室中,2 h后加入終濃度10 μg/ml的MMC去增殖處理3 h。將分選得到的臍帶血CD4+T淋巴細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的數(shù)量接種至含UCMSCs的培養(yǎng)板中,同時(shí)每孔接種1×103個(gè)APCs,并加入終濃度為10 μg/ml的PHA。接觸共培養(yǎng)1×105、1×104UCMSCs設(shè)為C1、C2組,Transwell 1×105、1×104UCMSCs設(shè)為D1、D2組,臍帶血CD4+T細(xì)胞+PHA為對(duì)照組A,臍帶血CD4+T細(xì)胞+UCMSCs為對(duì)照組B,各組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

    培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2孵箱中連續(xù)培養(yǎng)3 d后,收集細(xì)胞PBS洗滌離心后,鏡下計(jì)數(shù)。各組收集3個(gè)孔的細(xì)胞,洗滌后加入CD4-FITC、CD25-PE抗體各20 μl室溫避光孵育30 min,PBS緩沖液混勻離心后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+表達(dá)。

    各組收集3個(gè)孔的細(xì)胞提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后,進(jìn)行Real-time PCR,檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞標(biāo)志基因Foxp3表達(dá)量的變化,目標(biāo)基因Foxp3引物F:AACAGCACATTCCCAGAGTTCCT,R:CATTGAGTGTCCGCTGCTTCT;內(nèi)參基因GAPDH引物F:CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC,R:ACGACCAAATCCGTTGACTC;在測(cè)定兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率后,使用2-ΔΔCT法分析基因表達(dá)量的差異。

    1.2.4 UCMSCs與DXM作用下UCB-CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng) 將達(dá)到80%融合的P3代UCMSCs以5×104/孔的數(shù)量接種于24孔培養(yǎng)板或Transwell小室中,2 h后加入終濃度10 μg/ml的MMC增殖處理3 h。將分選得到的臍帶血CD4+T淋巴細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的數(shù)量接種至含UCMSCs的培養(yǎng)板中,并加入終濃度為10-5mol/L的DXM。設(shè)置無(wú)MSCs對(duì)照組A,24孔板實(shí)驗(yàn)組B,Transwell實(shí)驗(yàn)組C,同時(shí)設(shè)置不含DXM對(duì)照組1,含DXM實(shí)驗(yàn)組2,各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

    培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2孵箱中連續(xù)培養(yǎng)7 d后,PBS洗滌離心后將細(xì)胞調(diào)整至106個(gè)/ml,取200 μl細(xì)胞懸液加入5 μl的AnnexinV-FITC混勻避光,室溫孵育15 min,加入5 μl的PI染色,補(bǔ)加200 μl PBS后流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

    2 結(jié)果

    2.1 UCMSCs的分離培養(yǎng)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) UCMSCs呈貼壁生長(zhǎng),流式結(jié)果顯示高表達(dá)CD73、CD90、CD105、CD29和CD44,極少表達(dá)CD31、 CD34、CD45,說(shuō)明細(xì)胞純度較好,見(jiàn)圖1。

    2.2 共培養(yǎng)后細(xì)胞計(jì)數(shù) 在 PHA刺激下,可見(jiàn)細(xì)胞分裂活化聚集成團(tuán),形成明顯的細(xì)胞團(tuán)塊。第3天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量均少于對(duì)照組A,且UCMSCs數(shù)量越多,細(xì)胞數(shù)量越少,在相同UCMSCs數(shù)量的前提下,Transwell共培養(yǎng)組細(xì)胞數(shù)多于接觸共培養(yǎng)組。鏡下細(xì)胞狀態(tài)以一組實(shí)驗(yàn)為例見(jiàn)圖2,細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)見(jiàn)圖3。

    2.3 流式測(cè)定CD4+CD25+細(xì)胞比例變化 臍血CD4+T細(xì)胞經(jīng)PHA活化后,CD4+CD25+/CD4+比率比活化前明顯升高,而經(jīng)過(guò)與UCMSCs共培養(yǎng)3 d后,雙陽(yáng)性比率提高更為顯著,效應(yīng)與UCMSCs數(shù)量呈正相關(guān),Transwell共培養(yǎng)組也呈現(xiàn)出相同趨勢(shì),但效應(yīng)較接觸共培養(yǎng)組弱。雙標(biāo)流式圖以一組實(shí)驗(yàn)為例見(jiàn)圖4,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)圖5。

    圖1 UCMSCs表型流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果Fig.1 UCMSCs surface marker detected by flow cytometryNote: Cells were labeled with antibodies against human antigens CD73,CD90,CD105,CD29,CD44,CD31,CD34,CD45,as analyzed by FACS.

    圖2 共培養(yǎng)后各組CD4+細(xì)胞形態(tài)(×40)Fig.2 Morphology of CD4+ cells in each group after coculture(×40)

    圖3 共培養(yǎng)3 d后細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果Fig.3 Results of cell count after coculture for 3 daysNote: Group C2,Group D1 vs Group A,Group C2 vs Group C1,*.P<0.05;Group C1 vs Group A,Group D1 vs Group C1,**.P<0.01.

    2.4 Real-time PCR測(cè)定Foxp3表達(dá)量的變化 通過(guò)Real-time PCR發(fā)現(xiàn),各實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)基因Foxp3相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組A(P<0.01),且UCMSCs的數(shù)量越多Foxp3基因的相對(duì)表達(dá)量越高(P<0.01)。在較高濃度MSCs組中,接觸共培養(yǎng)與Transwell共培養(yǎng)也表現(xiàn)出了一定差異(P<0.05),PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)及各組Foxp3基因相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖6。

    2.5 UCMSCs對(duì)DXM作用下臍血CD4+T細(xì)胞凋亡的影響 UCMSCs對(duì)臍血CD4+T細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡均有明顯抑制作用(P<0.01),在早期凋亡組中接觸共培養(yǎng)比Transwell共培養(yǎng)具有更為明顯的抑制能力(P<0.01)。凋亡流式圖以一組實(shí)驗(yàn)為例見(jiàn)圖7,凋亡率統(tǒng)計(jì)及分析見(jiàn)圖8。

    圖4 共培養(yǎng)3 d后各組CD4CD25雙標(biāo)流式檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Results of flow cytometry double marked assay in each group after coculture for 3 days

    圖5 共培養(yǎng)3 d后各組細(xì)胞CD4+CD25+/CD4+比率(%)Fig.5 Rate of CD4+CD25+/CD4+ in each group after coculture for 3 days(%)Note: Group C2 vs Group A,Group D2 vs Group D1,*.P<0.05;Group C1 vs Group A,Group D1 vs Group A,Group C2 vs Group C1,Group D1 vs Group C1,**.P<0.01.

    圖6 目標(biāo)基因Foxp3的PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)及2-ΔΔCT法計(jì)算的各組相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.6 PCR amplification curve of target gene Foxp3 and 2-ΔΔCT method to calculate change of relative expression of each groupNote: Group D1 vs Group C1,*.P<0.05;All groups vs Group A,Group C2 vs Group C1,Group D2 vs Group D1,**.P<0.01.

    圖7 共培養(yǎng)7 d后各組流式凋亡檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Results of apoptosis by flow cytometry assay in each group after coculture for 7 days

    圖8 共培養(yǎng)7 d后各組凋亡率分析Fig.8 Apoptosis rate analysis in each group after coculture for 7 daysNote: Early apoptosis Group B2,Group C2 vs Group A2,Group C2 vs Group B2;Late apoptosis Group B2,Group C2 vs Group A2,**.P<0.01.

    3 討論

    調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是T細(xì)胞中的一個(gè)特殊亞群,它們能夠抑制免疫系統(tǒng)的激活,對(duì)維持自身抗原的耐受和免疫細(xì)胞群體的穩(wěn)態(tài)具有重要意義。CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞來(lái)源于胸腺,對(duì)自身反應(yīng)性T細(xì)胞具有抑制作用,在GVHD的預(yù)防和治療中起到了至關(guān)重要的作用,因此,我們?cè)谘芯縐CMSCs對(duì)臍血淋巴細(xì)胞免疫調(diào)控的研究中,重點(diǎn)關(guān)注對(duì)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的調(diào)控。為了避免其他亞群淋巴細(xì)胞的干擾,我們選用經(jīng)免疫磁珠分選純化過(guò)的CD4+T淋巴細(xì)胞用于本次研究。

    有研究發(fā)現(xiàn),T細(xì)胞的增殖可被MSCs抑制,這種作用與多種趨化因子如CXCR3、VCAM-1和ICAM-1等的高表達(dá)相關(guān)[12],另外,抑制性分子PD-1及其配體在MSCs抑制T淋巴細(xì)胞增殖的過(guò)程中也發(fā)揮了一定作用[13]。還有報(bào)道表明,MSCs可促進(jìn)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的產(chǎn)生[14]。MSCs表達(dá)Notch1配體Delta-like ligand(DLL)1、3、4及Jagged1、2,Notch1信號(hào)活化可誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞向Treg分化[15]。另一研究證實(shí),MSCs能夠分泌血紅素氧合酶(Hemeoxygenaes-1,HO-1),對(duì)高表達(dá)IL-10的Treg(Tr1)產(chǎn)生重要的誘導(dǎo)作用,但目前尚不清楚這一作用的明確機(jī)制[16]。

    本研究顯示,與UCMSCs的共培養(yǎng)后由PHA刺激的臍血CD4+T淋巴細(xì)胞增殖受到了明顯抑制,且UCMSCs數(shù)量越多,這種抑制作用越強(qiáng),呈正相關(guān)。同時(shí),通過(guò)Transwell培養(yǎng)板將UCMSCs和臍血CD4+T淋巴細(xì)胞分隔共培養(yǎng),這種抑制增殖趨勢(shì)相似,但大大減弱了抑制增殖的效果,在高濃度UCMSCs存在時(shí)與接觸培養(yǎng)組呈顯著差異(P<0.01),提示細(xì)胞間的直接接觸,抑制了CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖,并且起到了主要作用。通過(guò)凋亡實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn),UCMSCs對(duì)臍血CD4+T細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡均有明顯的抑制作用,其中兩種細(xì)胞接觸共培養(yǎng)比Transwell共培養(yǎng)具有更為明顯的抑制能力。另外,經(jīng)PHA活化的臍血CD4+T細(xì)胞與UCMSCs共培養(yǎng)3 d后,CD4+CD25+雙陽(yáng)性細(xì)胞比率顯著提高,與UCMSCs數(shù)量呈正相關(guān)。同時(shí),在較高濃度MSCs組中,Transwell共培養(yǎng)組雙陽(yáng)性比率低于接觸培養(yǎng)組(P<0.01),但也顯著高于對(duì)照組A(P<0.01),提示可溶性細(xì)胞因子也促進(jìn)了CD4+CD25+雙陽(yáng)性細(xì)胞的產(chǎn)生。通過(guò)對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的標(biāo)志性分子叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的Real-time PCR檢測(cè),顯示各實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組A,F(xiàn)oxp3基因的表達(dá)量顯著上升(P<0.01),趨勢(shì)與流式CD4+CD25+雙陽(yáng)性細(xì)胞比率的升高基本一致。說(shuō)明UCMSCs的存在,確實(shí)提高了CD4+T細(xì)胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比率。

    UCMSCs對(duì)臍血CD4+T細(xì)胞存在免疫抑制效應(yīng),這種效應(yīng)一方面表現(xiàn)在顯著抑制臍血CD4+T細(xì)胞的增殖,從而減少免疫應(yīng)答的產(chǎn)生;另一方面,UCMSCs誘導(dǎo)了CD4+T細(xì)胞向CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化,而CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞也具有負(fù)免疫調(diào)控的作用。這兩種調(diào)控效應(yīng)均與UCMSCs數(shù)量呈正相關(guān),并且通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞接觸及釋放可溶性細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)。另外,UCMSCs對(duì)臍血CD4+T細(xì)胞的抑凋亡作用,也說(shuō)明了免疫抑制效應(yīng)主要集中在對(duì)細(xì)胞功能和分化的調(diào)控而不是促進(jìn)凋亡。UCMSCs對(duì)臍血CD4+T細(xì)胞存在的免疫抑制效應(yīng),為新生兒和兒童自身免疫性疾病及GVHD的臨床研究,提供了新的思路。

    [1] Friedenstein AJ,Chailakhjan RK,Lalykina KS.The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells[J].Cell Proliferation,1970,3(4):393-403.

    [2] Di Nicola M,Carlo-Stella C,Magni M,etal.Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli[J].Blood,2002,99(10):3838-3843.

    [3] Bernardo ME,Pagliara D,Locatelli F.Mesenchymal stromal cell therapy:a revolution in regenerative medicine?[J].Bone Marrow Transplant,2012,47(2):164-171.

    [4] Newell LF,Deans RJ,Maziarz RT.Adult adherent stromal cells in the management of graft-versus-host disease[J].Exp Opinion Biol Therapy,2014,14(2):231-246.

    [5] Nagamura-Inoue T,He H.Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells:Their advantages and potential clinical utility[J].World J Stem Cells,2014,6(2):195-202.

    [6] El Omar R,Beroud J,Stoltz J F,etal.Umbilical cord mesenchymal stem cells:the new gold standard for mesenchymal stem cell-based therapies?[J].Tissue Eng Part B,Rev,2014,20(5):523-544.

    [7] Wood KJ,Bushell A,Hester J.Regulatory immune cells in transplantation[J].Nat Rev Immunol,2012,12(6):417-430.

    [8] Wu KH,Chan CK,Tsai C,etal.Effective treatment of severe steroid-resistant acute graft-versus-host disease with umbilical cord-derived mesenchymal stem cells[J].Transplantation,2011,91(12):412-1416.

    [9] Can A,Balei D.Isolation,culture,and characterization of human umbilical cord stroma-derived mesenchymal stem cells[J].Methods Mol Biol,2011,698(1):51-62.

    [10] English K.Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation[J].Immunol Cell Biol,2013,91(1):19-26.

    [11] Cuerquis J,Romieu-Mourez R,Francois M,etal.Human mesenchymal stromal cells transiently increase cytokine production by activated T cells before suppressing T-cell proliferation:effect of interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha stimulation[J].Cytotherapy,2014,16(2):191-202.

    [12] Ren G,Zhao X,Zhang L,etal.Inflammatory cytokine-induced intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 in mesenchymal stem cells are critical for immunosuppression[J].J Immunol,2010,184(5):2321-2328.

    [13] Chinnadurai R,Copland IB,Patel SR,etal.IDO-independent suppression of T cell effector function by IFN-γ-licensed human mesenchymal stromal cells[J].J Immunol,2014,192(4):1491-1501.

    [14] Di Ianni M,Del Papa B,De Ioanni M,etal.Mesenchymal cells recruit and regulate T regulatory cells[J].Exp Hematol,2008,36(3):309-318.

    [15] Del Papa B,Sportoletti P,Cecchini D,etal.Notchl modulates mesenchymal stem cells mediated regulatory T-cell induction[J].Eur J Immunol,2013,43(1):182-187.

    [16] Li JG,Zhuan-sun YX,Wen B,etal.Human mesenchymal stem cells elevate CD4+CD25+CD127low/-regulatory T cells of asthmatic patients via heme oxygenase-1[J].Iran J Allergy Asthma Immunol,2013,12(3):228-235.

    [收稿2016-08-04]

    (編輯 倪 鵬)

    Immunoregulation study of UCMSCs on UCB CD4+T lymphocytes in vitro

    GONGBo,XUZhi-Guo,WANGShao-Hong,CHENGHong-Ling,LIUChao,YANMing-Jie.

    ZhejiangProvinceUmbilicalCordBloodStemCellBank,EasternUnionStemCellGeneEngineeringCo.Ltd.,Huzhou313000,China

    Objective:Immunoregulation study of umbilical mesenchymal stem cell (UCMSCs) on allogeneic umbilical cord blood(UCB) CD4+T lymphocytes,which proliferation,apoptosis and the differentiation to CD4+CD25+regulatory T cell (Treg) in vitro.Methods: Establishing on direct contact or transwell co-culture system,adopt in different proportion of UCMCs with phytohaemagglutinin (PHA)-activated UCB CD4+T lymphocytes were co-cultured.The proliferation of lymphocyte,percent of CD4+CD25+/CD4+and Foxp3 expression,regulatory T cell marker gene were measured.Apoptosis of CD4+T lymphocytes were observed in the direct contact or transwell coculture system of UCMSCs with desamethason(DXM)-stimulated UCB CD4+T lymphocytes.Results: The UCB CD4+T lymphocytes cocultured with UCMSCs with PHA-activating for 3 days,compared with the UCMSCs free control group,the amount of cells was reduced noticeably(P<0.05) and the percent of CD4+CD25+in CD4+T lymphocytes and Foxp3 expression significantly increased(P<0.01) in a dose dependent way(P<0.05).The UCB CD4+T lymphocytes cocultured with UCMSCs with DXM-inducing for 7 days,the apoptosis rate was significantly lower than that of the control group without UCMSCs (P<0.01).These effects were partially attenuated in transwell coculture but could not be eliminated.Conclusion: UCMSCs are negative effect on UCB CD4+T lymphocytes-mediated immunity effects,and mainly manifested in the regulation on cell proliferate ability and differentiation rather than promoting apoptosis.

    Umbilical cord mesenchymal stem cells (UCMSCs);Umbilical cord blood CD4+T lymphocytes;CD4+CD25+regulatory T cell;Proliferation;Differentiation;Apoptosis

    10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.012

    貢 波(1985年-),男,碩士,中級(jí)工程師,主要從事臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)、生物學(xué)特性及免疫調(diào)控功能的研究,E-mail:gongbo-1019@163.com。

    及指導(dǎo)教師:徐志國(guó)(1979年-),男,碩士,副高級(jí)工程師,主要從事臍帶血造血干細(xì)胞庫(kù)的建設(shè)和質(zhì)量運(yùn)行、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床研究, E-mail:huadongstemcell@163.com。

    R392.12

    A

    1000-484X(2017)02-0220-06

    ①中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所,天津300020。

    猜你喜歡
    臍帶血臍血調(diào)節(jié)性
    臍血白細(xì)胞介素6水平對(duì)早產(chǎn)兒腦損傷程度及后期神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的影響研究
    調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在急性白血病中的作用
    臍帶血是否值得花錢(qián)保存?
    臍帶血要保存嗎
    臍帶血對(duì)別人有用,對(duì)于自體的作用并不大
    家庭用藥(2016年10期)2016-11-23 14:14:14
    人及小鼠胰腺癌組織介導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞聚集的趨化因子通路
    部分調(diào)節(jié)性?xún)?nèi)斜視遠(yuǎn)期療效分析
    臍血IgE及母血IgE與嬰兒過(guò)敏性疾病的相關(guān)性研究
    白細(xì)胞介素-6對(duì)臍血單個(gè)核細(xì)胞分化為樹(shù)突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)作用
    自體臍帶血臨床應(yīng)用局限多
    内地一区二区视频在线| 麻豆成人午夜福利视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 观看免费一级毛片| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 色综合色国产| 国产在线男女| 成人一区二区视频在线观看| 国产高清三级在线| 如何舔出高潮| 午夜激情福利司机影院| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产亚洲91精品色在线| 久久久久久久久大av| 国产乱人视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产淫片久久久久久久久| 一级毛片我不卡| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 久久97久久精品| 国产成人福利小说| 赤兔流量卡办理| 欧美变态另类bdsm刘玥| 免费观看性生交大片5| 美女黄网站色视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲av二区三区四区| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 中文天堂在线官网| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产真实伦视频高清在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久久成人免费电影| 亚洲18禁久久av| 国产精品精品国产色婷婷| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久精品人妻少妇| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 欧美丝袜亚洲另类| 日韩成人av中文字幕在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 亚洲av福利一区| 淫秽高清视频在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲国产最新在线播放| 国产淫片久久久久久久久| a级毛色黄片| 精品久久久久久成人av| 亚洲在线自拍视频| 久久久久久久久中文| 日本熟妇午夜| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产黄频视频在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲精品,欧美精品| 女人久久www免费人成看片| 观看美女的网站| 成人特级av手机在线观看| 亚洲av成人av| xxx大片免费视频| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲精品国产成人久久av| 日日摸夜夜添夜夜爱| 在线 av 中文字幕| 国产视频内射| 午夜久久久久精精品| 少妇的逼水好多| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 一级黄片播放器| 日本色播在线视频| 国产午夜福利久久久久久| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲最大成人中文| 免费看光身美女| 欧美区成人在线视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 深夜a级毛片| 国产精品人妻久久久影院| 久久精品综合一区二区三区| 久久久久久国产a免费观看| 我要看日韩黄色一级片| 哪个播放器可以免费观看大片| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 观看免费一级毛片| 最近手机中文字幕大全| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美潮喷喷水| 黄色一级大片看看| 永久免费av网站大全| 免费观看a级毛片全部| 黄片无遮挡物在线观看| 日本wwww免费看| 久久热精品热| 亚洲精品成人av观看孕妇| 插阴视频在线观看视频| 日韩av在线大香蕉| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 精品一区二区免费观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 国产男人的电影天堂91| 一级片'在线观看视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 欧美成人一区二区免费高清观看| 午夜福利视频1000在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 国产精品一区www在线观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产精品伦人一区二区| av在线老鸭窝| 亚洲不卡免费看| 亚洲在线自拍视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲经典国产精华液单| 日韩人妻高清精品专区| 久久精品国产自在天天线| 亚洲欧洲日产国产| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产高清有码在线观看视频| 久久国产乱子免费精品| 久久人人爽人人爽人人片va| 色播亚洲综合网| 日韩 亚洲 欧美在线| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 一个人看视频在线观看www免费| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产精品无大码| 天堂√8在线中文| 视频中文字幕在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 久久精品久久久久久久性| 欧美日韩亚洲高清精品| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 午夜激情久久久久久久| 亚洲国产欧美人成| 国产高清有码在线观看视频| 大香蕉97超碰在线| 韩国高清视频一区二区三区| 高清在线视频一区二区三区| 18+在线观看网站| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 成人毛片60女人毛片免费| 久久久久精品久久久久真实原创| 久久久久久久久大av| 搡老乐熟女国产| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 在线播放无遮挡| 你懂的网址亚洲精品在线观看| freevideosex欧美| 蜜臀久久99精品久久宅男| 欧美精品国产亚洲| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久韩国三级中文字幕| 国产麻豆成人av免费视频| 国产精品伦人一区二区| 午夜久久久久精精品| 特级一级黄色大片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 免费看日本二区| 国产在视频线在精品| 亚洲在久久综合| 国产高潮美女av| 别揉我奶头 嗯啊视频| 伊人久久国产一区二区| 中文资源天堂在线| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 伦精品一区二区三区| 国产有黄有色有爽视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲国产精品专区欧美| 精品午夜福利在线看| 日本爱情动作片www.在线观看| 一本久久精品| 国产一级毛片在线| 日韩电影二区| 久久久久国产网址| 在线观看av片永久免费下载| 热99在线观看视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲综合精品二区| 国产v大片淫在线免费观看| 联通29元200g的流量卡| 伦理电影大哥的女人| 欧美激情久久久久久爽电影| 1000部很黄的大片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 有码 亚洲区| 插阴视频在线观看视频| 亚洲图色成人| 久久久久免费精品人妻一区二区| 永久网站在线| 草草在线视频免费看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲国产精品成人综合色| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 神马国产精品三级电影在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 91久久精品国产一区二区三区| 国产精品嫩草影院av在线观看| av线在线观看网站| 亚洲性久久影院| 我的老师免费观看完整版| 日韩制服骚丝袜av| 久久久精品94久久精品| 国内精品宾馆在线| 久久精品国产亚洲av天美| 国产在线男女| 99久久九九国产精品国产免费| 欧美精品一区二区大全| 搡女人真爽免费视频火全软件| 日本免费a在线| 一本一本综合久久| 高清在线视频一区二区三区| 国产成人freesex在线| 日韩欧美精品v在线| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 久久99热6这里只有精品| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲最大成人中文| 国产精品福利在线免费观看| 一边亲一边摸免费视频| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 久久久久国产网址| 精品一区二区免费观看| 国产精品熟女久久久久浪| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产毛片a区久久久久| 国产极品天堂在线| 男女边吃奶边做爰视频| 高清欧美精品videossex| 国产精品一二三区在线看| 欧美成人午夜免费资源| 国产又色又爽无遮挡免| 国产免费福利视频在线观看| 精品一区二区免费观看| 国产成人a∨麻豆精品| 久久久久久久国产电影| 国产精品不卡视频一区二区| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲怡红院男人天堂| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久久色成人| 天堂影院成人在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看 | 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲美女视频黄频| 嫩草影院新地址| 女人被狂操c到高潮| 欧美激情国产日韩精品一区| 午夜福利在线在线| 亚洲精品国产成人久久av| 亚州av有码| av国产久精品久网站免费入址| 三级国产精品片| 国产午夜精品一二区理论片| 一区二区三区高清视频在线| 精品久久久久久久久av| 禁无遮挡网站| 午夜久久久久精精品| 国产一区有黄有色的免费视频 | 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产精品人妻久久久影院| 精品久久久精品久久久| 高清在线视频一区二区三区| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 嫩草影院新地址| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产亚洲91精品色在线| 69av精品久久久久久| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 精品一区二区三区视频在线| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 永久免费av网站大全| 日韩av免费高清视频| 简卡轻食公司| 成人综合一区亚洲| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 99re6热这里在线精品视频| 午夜福利在线在线| 成人漫画全彩无遮挡| 免费黄色在线免费观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲美女视频黄频| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久人人爽人人片av| 麻豆成人av视频| 深夜a级毛片| 久久6这里有精品| 亚洲久久久久久中文字幕| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 91精品国产九色| 少妇高潮的动态图| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 男女视频在线观看网站免费| 午夜精品国产一区二区电影 | 久热久热在线精品观看| 色5月婷婷丁香| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 一级毛片电影观看| 韩国av在线不卡| 亚洲无线观看免费| 五月伊人婷婷丁香| 色播亚洲综合网| 精品久久久久久久久久久久久| 九九在线视频观看精品| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 国产三级在线视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲成人av在线免费| 美女国产视频在线观看| 日本一二三区视频观看| 天堂网av新在线| 国产有黄有色有爽视频| 国产三级在线视频| 综合色av麻豆| 韩国av在线不卡| 男人狂女人下面高潮的视频| 日本黄色片子视频| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 51国产日韩欧美| 欧美最新免费一区二区三区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产精品一及| 三级国产精品片| 成年版毛片免费区| 色吧在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 国产精品av视频在线免费观看| 一级毛片久久久久久久久女| 成人二区视频| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 一本久久精品| 成年女人在线观看亚洲视频 | 大香蕉久久网| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产成人午夜福利电影在线观看| 只有这里有精品99| 毛片一级片免费看久久久久| 国产久久久一区二区三区| 身体一侧抽搐| 久久久精品欧美日韩精品| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产精品.久久久| 黑人高潮一二区| 一级黄片播放器| 九草在线视频观看| 亚洲18禁久久av| 嘟嘟电影网在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 一级毛片电影观看| 亚洲av不卡在线观看| 大陆偷拍与自拍| 天堂√8在线中文| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲最大成人中文| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 少妇熟女欧美另类| 国产黄片美女视频| 少妇的逼好多水| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产伦一二天堂av在线观看| 老司机影院毛片| 日韩av免费高清视频| 特大巨黑吊av在线直播| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 日韩亚洲欧美综合| 日韩成人伦理影院| 热99在线观看视频| 国产在视频线精品| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲自拍偷在线| 能在线免费看毛片的网站| 久久久精品免费免费高清| 黄片wwwwww| 一本一本综合久久| 尾随美女入室| www.色视频.com| 在线免费十八禁| 亚洲av二区三区四区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 日韩,欧美,国产一区二区三区| 一区二区三区高清视频在线| 少妇的逼好多水| 精品午夜福利在线看| 五月天丁香电影| 内射极品少妇av片p| 久久这里只有精品中国| 在线免费十八禁| 内射极品少妇av片p| 久久久久久久久大av| 久久精品夜色国产| 亚洲av二区三区四区| 夫妻午夜视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产永久视频网站| 亚洲高清免费不卡视频| 国产激情偷乱视频一区二区| 日韩伦理黄色片| 亚洲最大成人手机在线| 国产成人午夜福利电影在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 日本欧美国产在线视频| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 午夜激情欧美在线| 少妇的逼水好多| 美女黄网站色视频| 人妻系列 视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美一区二区亚洲| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲自拍偷在线| 国产片特级美女逼逼视频| 在线播放无遮挡| 国产成人精品婷婷| 亚洲人成网站在线播| 日本黄大片高清| 国精品久久久久久国模美| 日韩视频在线欧美| 一级毛片我不卡| 日本一本二区三区精品| 国产一区二区三区av在线| 麻豆成人午夜福利视频| 大香蕉久久网| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产高清三级在线| eeuss影院久久| 久99久视频精品免费| 国产精品1区2区在线观看.| 观看美女的网站| 赤兔流量卡办理| 五月玫瑰六月丁香| 成年av动漫网址| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 一区二区三区乱码不卡18| 特级一级黄色大片| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲图色成人| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久久久九九精品影院| 黄色配什么色好看| 久久久精品欧美日韩精品| 国产高清三级在线| 热99在线观看视频| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲美女视频黄频| 青春草国产在线视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 色播亚洲综合网| 亚洲无线观看免费| 久久久久久久午夜电影| 亚洲在线自拍视频| 亚洲美女视频黄频| 亚洲成人一二三区av| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲国产最新在线播放| 日本熟妇午夜| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美+日韩+精品| 国产黄a三级三级三级人| 日日啪夜夜爽| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲成人一二三区av| 中文字幕av成人在线电影| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲av二区三区四区| 日日干狠狠操夜夜爽| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产成人精品婷婷| 国产综合懂色| 日本wwww免费看| 啦啦啦啦在线视频资源| 两个人的视频大全免费| 婷婷色综合www| 国产精品1区2区在线观看.| 一夜夜www| 色5月婷婷丁香| 淫秽高清视频在线观看| 中文字幕久久专区| 我的女老师完整版在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 美女主播在线视频| 久久精品久久久久久久性| 国产精品国产三级专区第一集| 麻豆成人午夜福利视频| av.在线天堂| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 黄色配什么色好看| 69人妻影院| 不卡视频在线观看欧美| 欧美一区二区亚洲| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产成人aa在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 麻豆成人午夜福利视频| 国产永久视频网站| 一级黄片播放器| 久久99蜜桃精品久久| 女人被狂操c到高潮| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产亚洲一区二区精品| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产精品蜜桃在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 欧美3d第一页| 欧美日韩精品成人综合77777| 午夜福利成人在线免费观看| 精品国产三级普通话版| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 精品久久久噜噜| 国产av不卡久久| 99久久精品一区二区三区| 最近视频中文字幕2019在线8| 看黄色毛片网站| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | av播播在线观看一区| 五月天丁香电影| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲经典国产精华液单| 嫩草影院入口| 成人亚洲精品一区在线观看 | 免费看日本二区| 亚洲精品成人久久久久久| 中文字幕制服av| 精品久久久久久电影网| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 美女黄网站色视频| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲精品乱久久久久久| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲图色成人| 精品一区二区免费观看| 亚洲不卡免费看| 久久久成人免费电影| 日韩欧美国产在线观看| 一级毛片 在线播放| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲国产av新网站| 亚洲国产精品国产精品| 久久久久久久久大av| 亚洲在线观看片| 一级毛片电影观看| 尾随美女入室| 欧美zozozo另类| 免费av不卡在线播放| 高清欧美精品videossex| 欧美三级亚洲精品| 成人av在线播放网站| 久久久久久九九精品二区国产| 人妻系列 视频| 久久国产乱子免费精品| 99久国产av精品| 热99在线观看视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 高清日韩中文字幕在线| 欧美一级a爱片免费观看看| 男女边吃奶边做爰视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲在久久综合| 69av精品久久久久久| 大陆偷拍与自拍| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 亚洲无线观看免费| 丝袜美腿在线中文| 精品国产露脸久久av麻豆 | 亚洲在线自拍视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 色5月婷婷丁香| 免费观看性生交大片5| 成人亚洲欧美一区二区av|