CEA迷你基因串聯(lián)體疫苗免疫小鼠脾細(xì)胞對CEA陽性腫瘤細(xì)胞的殺傷作用及疫苗的安全性評價(jià)①

方艷秋 魏海峰 李 丹 米旭光 蘆小單 李首慶 劉 磊 譚 巖

(吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心，長春 130021)

·生物治療·

CEA迷你基因串聯(lián)體疫苗免疫小鼠脾細(xì)胞對CEA陽性腫瘤細(xì)胞的殺傷作用及疫苗的安全性評價(jià)①

方艷秋 魏海峰 李 丹②米旭光 蘆小單 李首慶 劉 磊 譚 巖

(吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心，長春 130021)

目的：觀察CEA迷你基因串聯(lián)體疫苗pcDNA-triCEA625-667免疫小鼠脾細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞特異性殺傷作用并對疫苗免疫小鼠后的安全性進(jìn)行評估。方法：BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白載體組(pcDNA3.0)、單倍體疫苗實(shí)驗(yàn)組(pcDNA-CEA625-667)、串聯(lián)體疫苗實(shí)驗(yàn)組(pcDNA-triCEA625-667)，肌肉注射法免疫動(dòng)物，每隔10 d免疫1次，共免疫4次，記錄免疫小鼠的體重變化、存活情況以及檢測血清ALT、肌酐水平。以疫苗免疫小鼠的脾細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以 LDH 釋放法檢測其對CEA陽性的小鼠肝癌細(xì)胞株(H22-CEA+)、胃癌細(xì)胞株(MFC-CEA+)、結(jié)腸癌細(xì)胞株(CT26-CEA+)以及CEA陰性小鼠肝癌細(xì)胞株(H22-CEA-)的特異性CTL的殺傷活性。結(jié)果：兩種疫苗對CEA陽性的肝癌、胃癌及結(jié)腸癌細(xì)胞均具有較強(qiáng)的殺傷活性，與 PcDNA3.0空載體組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而對CEA陰性腫瘤細(xì)胞(H22-CEA-)則幾乎無影響。迷你串聯(lián)體基因疫苗pcDNA-triCEA625-667對肝癌細(xì)胞H22-CEA+及胃癌細(xì)胞MFC-CEA+的殺傷活性強(qiáng)于單倍體基因疫苗pcDNA-CEA625-667(P<0.05)。疫苗免疫對小鼠的存活狀態(tài)、體重變化及肝腎功能指標(biāo)均無影響。結(jié)論：CEA迷你基因疫苗安全有效，能夠誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL產(chǎn)生，且三倍體串聯(lián)體疫苗免疫效果優(yōu)于單倍體疫苗。

癌胚抗原；迷你基因；基因疫苗；體外實(shí)驗(yàn)；抗腫瘤

目前，高居惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率之首的CEA陽性腫瘤的治療效果不能令人滿意。為了探索一種安全有效的免疫治療新方法，本研究前期利用PCR技術(shù)從人基因組中得到CEA625-667DNA片段并將其順次定向亞克隆到真核表達(dá)載體 pcDNA3.0中，成功地構(gòu)建了含有CEA625-667基因三串聯(lián)體的DNA疫苗pcDNA-triCEA625-667[1]。本次實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用該疫苗免疫的小鼠脾細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以肝癌、胃癌、結(jié)腸癌為靶細(xì)胞，觀察疫苗免疫的小鼠脾細(xì)胞對CEA陽性腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，探討CEA迷你基因串聯(lián)體疫苗應(yīng)用于CEA陽性腫瘤治療的可能性，并對疫苗免疫小鼠后的安全性進(jìn)行評估，為進(jìn)一步的臨床研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 CEA陽性的小鼠肝癌細(xì)胞株(H22-CEA+)、胃癌細(xì)胞株(MFC-CEA+)、結(jié)腸癌細(xì)胞株(CT26-CEA+)、CEA陰性小鼠肝癌細(xì)胞株(H22-CEA-)(本室制備并保存)；重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-CEA625-667及pcDNA-triCEA625-667(本室制備并保存)；IMDM培養(yǎng)基(美國Sigma公司)；胎牛血清(Gibcobrl公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物室，雄性，6～8周，體重18～22 g。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物免疫 小鼠隨機(jī)分成3組，每組6只。分別為空白載體組(pcDNA3.0)、單倍體疫苗實(shí)驗(yàn)組(pcDNA-CEA625-667)、串聯(lián)體疫苗實(shí)驗(yàn)組(pcDNA-triCEA625-667)。肌肉注射法免疫動(dòng)物。濃度為0.95 μg/μl的質(zhì)粒與終濃度3%氫氧化鋁膠懸液1∶1(V∶V)混合，每只小鼠每次接種100 μg質(zhì)粒。分兩側(cè)注射與小鼠大腿內(nèi)側(cè)肌群，每隔10 d免疫1次，共免疫4次。記錄免疫小鼠的體重變化情況及存活情況。

1.2.2 免疫小鼠脾細(xì)胞的收集 最后一次免疫后10 d，斷頸處死小鼠，眼球取血，分離血清檢測ALT水平和肌酐水平。無菌取脾，將脾浸入含10%小牛血清的IMDM細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕研磨，紗布過濾后用玻璃試管收集脾細(xì)胞。離心、破紅、重懸、洗滌，1%臺(tái)盼藍(lán)染色測定細(xì)胞存活率，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107ml-1。

1.2.3 免疫小鼠脾細(xì)胞對CEA陽性腫瘤細(xì)胞的殺傷作用 以LDH 釋放法檢測特異性CTL的殺傷活性。用含5%小牛血清的IMDM培養(yǎng)液調(diào)整各腫瘤細(xì)胞株至1×105ml-1作為靶細(xì)胞，每孔加入100 μl。以疫苗免疫小鼠的脾細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，按照不同的效靶比(E∶T) 100∶1、50∶1、25∶1、12.5∶1 加入效應(yīng)細(xì)胞，每孔加入100 μl，并分別設(shè)置靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞對照孔，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。37℃，5%CO2環(huán)境下共同孵育4 h，轉(zhuǎn)移上清至新的96 孔板，加入LDH 底物，室溫避光靜置30 min 后，加入終止反應(yīng)液，測定490nm 的各孔OD值，計(jì)算殺傷率。殺傷率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放孔OD值-靶細(xì)胞自然釋放OD值)/(靶細(xì)胞最大釋放孔OD值-靶細(xì)胞自然釋放孔OD值)×100%。

2 結(jié)果

2.1 免疫小鼠的體重變化情況 圖1為疫苗免疫小鼠3個(gè)月內(nèi)的體重變化曲線。可以看出，實(shí)驗(yàn)組小鼠與正常對照組比較有相同的體重增長曲線。表明疫苗沒有誘發(fā)實(shí)驗(yàn)小鼠局部或全身的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致小鼠體重下降。實(shí)驗(yàn)組小鼠及對照組小鼠均無死亡。

2.2 疫苗接種后小鼠肝腎功能檢測 血清中ALT水平和肌酐水平檢測結(jié)果顯示各組無明顯差異(P>0.05)，表明pcDNA-CEA625-667及pcDNA-triCEA625-667肌肉注射免疫均對小鼠肝功能和腎功能沒有明顯的影響，見表1。

2.3 免疫小鼠脾細(xì)胞對CEA陽性腫瘤細(xì)胞的殺傷作用 兩種疫苗免疫組小鼠脾細(xì)胞的 CTL 特異性殺傷活性均明顯增強(qiáng)，兩種疫苗對CEA陽性的肝癌、胃癌及結(jié)腸癌細(xì)胞均具有較強(qiáng)的殺傷活性，與PcDNA3.0空載體組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而對CEA陰性腫瘤細(xì)胞(H22-CEA-)幾乎無影響。且串聯(lián)體基因疫苗pcDNA-triCEA625-667組對肝癌細(xì)胞H22-CEA+及胃癌細(xì)胞MFC-CEA+的殺傷活性強(qiáng)于單倍體基因疫苗pcDNA-CEA625-667組(P<0.05)。結(jié)果見圖2。

圖1 疫苗免疫后小鼠的體重變化曲線Fig.1 Curve of changes of mice weight after transplantion

GroupsnALT(U/ml)Creatinine(μmol/L)pcDNA306526±231246±71pcDNA?CEA625?6676537±211219±68pcDNA?triCEA625?6676516±191234±74

圖2 免疫小鼠脾細(xì)胞誘導(dǎo)的CTL 特異性殺傷活性Fig.2 CTL specific cytotoxicity induced by spleen cells in miceNote: *.P<0.01 vs pcDNA-3.0 group；△.P<0.05 vs pcDNA-CEA625-667 group.Effect target ratio 12.5∶1,25∶1,50∶1 and 100∶1 were denoted respectively by A,B,C and D.

3 討論

應(yīng)用CEA疫苗進(jìn)行免疫治療，能產(chǎn)生較廣譜的抗腫瘤作用，可以克服一種疫苗僅對一種腫瘤起作用的局限性。但由于CEA的免疫原性很弱或提呈障礙，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答(這可能也是CEA陽性腫瘤逃避機(jī)體免疫監(jiān)控的原因之一)[2]。因此，增強(qiáng)CTL識(shí)別抗原的敏感性，避免出現(xiàn)免疫抑制，誘導(dǎo)產(chǎn)生高效特異的抗腫瘤免疫反應(yīng)是CEA疫苗治療的主要目的。本研究前期實(shí)驗(yàn)選擇了包含兩個(gè)CEA HTL表位(CEA625-669和CEA625-667)的迷你基因CEA625-667來制作串聯(lián)體基因疫苗，結(jié)果表明該疫苗增強(qiáng)免疫效應(yīng)的作用[3]。

DNA疫苗是近幾年來研究的熱點(diǎn)之一，它的主要特點(diǎn)在于它們能引起保護(hù)性細(xì)胞毒T細(xì)胞反應(yīng)[4]。Wolff等[5]不借助病毒載體,將含有編碼luciferase基因cDNA的真核表達(dá)質(zhì)粒DNA直接注射入小鼠肌纖維細(xì)胞中，可在該肌細(xì)胞中檢測到luciferase的表達(dá)，從而產(chǎn)生了不依賴病毒載體導(dǎo)入的核酸疫苗。Conry等[6]先后對CEA核酸疫苗進(jìn)行了系列研究，用含有CEA cDNA全序列的真核表達(dá)質(zhì)粒肌注免疫C57小鼠，共免疫3次，取C57小鼠的血液及脾，獲得了CEA特異性的體液和細(xì)胞免疫，在小鼠體內(nèi)檢測到抗CEA抗體及CEA特異性T細(xì)胞增殖；含CEA cDNA全序列的真核表達(dá)質(zhì)?？烧T導(dǎo)產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答，在首次免疫3周后，可防止腫瘤的植入再生，而且發(fā)現(xiàn)只有肌注才有效；目前該核酸疫苗的Ⅰ期臨床應(yīng)用研究正在進(jìn)行當(dāng)中，將編碼CEA和HbsAg的cDNA插入真核表達(dá)載體pcDNA3中，采用肌注的方法對結(jié)腸癌患者進(jìn)行免疫，通過對抗CEA及HbsAg抗體、T細(xì)胞的增生及活性測定，對毒副反應(yīng)的觀察，來評價(jià)該核酸疫苗的臨床效果。國內(nèi)李道坤等[7]也證實(shí)了重組CEA和IL-2抗腫瘤基因疫苗具有抗腫瘤活性。Xiang等[8]給CEA轉(zhuǎn)基因鼠口服DNA疫苗，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的誘導(dǎo)腫瘤保護(hù)性免疫作用，這種作用主要是通過MHCⅠ類限制性CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的。Song等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，若用攜帶人CEA-DNA及IFN-γ或IL-12基因的質(zhì)粒給小鼠肌肉注射，能產(chǎn)生IgG2a抗CEA抗體及CEA特異性CTL，符合Th1型反應(yīng)，能抑制CEA陽性腫瘤細(xì)胞株p815的生長；若用攜帶人CEA-DNA與IL-4基因的質(zhì)粒給小鼠肌肉注射，則產(chǎn)生的是IgG1抗體，符合Th2型反應(yīng)，CTL活性及抗腫瘤細(xì)胞活性均減低。

本研究觀察了疫苗免疫后小鼠的狀態(tài)、體重變化、肝腎功能以及存活情況，未觀察到肌肉注射疫苗給實(shí)驗(yàn)小鼠帶來任何負(fù)面作用。與其他疫苗相比，基因疫苗無疑是安全、有效的。雖然基因疫苗可能會(huì)給某些疾病的防治帶來一場根本性的變革，但仍可能存在一些潛在的危險(xiǎn)因素，例如質(zhì)粒DNA可能誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)；持續(xù)表達(dá)外源抗原可能產(chǎn)生一些不良后果；少量疫苗質(zhì)粒肌注后逸入血流；接種DNA疫苗后，DNA分子在肌肉細(xì)胞中可能整合到宿主基因組等。雖然很多研究結(jié)果證明了上述可能性微乎其微，甚至動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床Ⅰ期安全性試驗(yàn)的結(jié)果都證明基因疫苗是安全的[10-12]。然而DNA疫苗進(jìn)入臨床應(yīng)用還需要一段時(shí)間。

[1] 李 丹,譚 巖,劉力華,等.CEA迷你基因串聯(lián)體腫瘤疫苗的構(gòu)建[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2007,33(2):377-380.

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[收稿2016-12-09]

(編輯 許四平)

Tumor specific immune response induced by three tandem repeats of CEA mini gene DNA vaccine and safety evaluation

FANGYan-Qiu,WEIHai-Feng,LIDan,MIXu-Guang,LUXiao-Dan,LIShou-Qing,LIULei,TANYan.

CenterforMedicalTreatmentandDiagnosis,JilinProvincePeople′sHospital,Changchun130021,China

Objective:To observe the specific killing effect on tumor cells of the spleen cells in mice immunized with three tandem repeats of CEA minigene DNA vaccine pcDNA-triCEA625-667and to evaluate the safety of the vaccine.Methods: The BALB/c mice were randomly divided into blank vector group (pcDNA3.0),haploid vaccine group (pcDNA-CEA625-667) and tandem repeats vaccine group (pcDNA-triCEA625-667).The mice received a total of 4 intramuscular immunization every 10 days once.The changes of body weight,survival state were recorded and the levels of serum ALT and serum creatinine were detected.The specific CTL killing activity of spleen cells in accinated mice on mouse hepatoma cells(H22-CEA+),gastric cancer cells(MFC-CEA+),colorectal cancer cells(CT26-CEA+) with high expression of CEA and mouse hepatoma cells(H22-CEA-) without expression of CEA was detected.Results: The two vaccines had strong killing activity on CEA positive liver cancer,gastric cancer and colon cancer cells,and the difference was statistically significant (P<0.01) compared with the PcDNA3.0 group.And they had almost no effect on CEA negative tumor cells (H22-CEA-).The killing activity on liver cancer cell(H22-CEA+) and gastric cancer cell(MFC-CEA+) induced by pcDNA-triCEA625-667was stronger than that induced by pcDNA-triCEA625-667(P<0.05).The survival status,change of body weight and function of liver and kidney of the mice were not affected by the vaccine.Conclusion: There was no adverse reaction in the course of vaccine immunization.The minigene DNA vaccine derived from CEA can induce tumor specific CTL effect and the immune response level elicited by three tandem repeats of minigene DNA vaccine was superior to that elicited by haploid vaccine.

Carcinoembryonic antigen;Minigene;DNA vaccine;Vitro experiment；Anti tumor

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.011

①本文受吉林省科技廳國際合作項(xiàng)目(20140414043GH)、吉林省科技廳中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才及團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(20140519018JH)、吉林省人社廳省人才開發(fā)資金(2016年度)和吉林省科技廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(20122113)資助。

及指導(dǎo)教師：譚 巖(1956年-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤生物治療及疫苗研發(fā)方面的研究，E-mail：tanyan49@hotmail.com。

R392 R730.5

A

1000-484X(2017)02-0217-04

②吉林大學(xué)第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，長春130021。作者簡介：方艷秋(1968年-)，女，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤生物治療基礎(chǔ)與臨床方面的研究，E-mail：yq.fang@163.com。