• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    CEA迷你基因串聯(lián)體疫苗免疫小鼠脾細胞對CEA陽性腫瘤細胞的殺傷作用及疫苗的安全性評價①

    2017-02-27 06:02:15方艷秋魏海峰米旭光蘆小單李首慶
    中國免疫學雜志 2017年2期
    關鍵詞:小鼠

    方艷秋 魏海峰 李 丹 米旭光 蘆小單 李首慶 劉 磊 譚 巖

    (吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學診治實驗中心,長春 130021)

    ·生物治療·

    CEA迷你基因串聯(lián)體疫苗免疫小鼠脾細胞對CEA陽性腫瘤細胞的殺傷作用及疫苗的安全性評價①

    方艷秋 魏海峰 李 丹②米旭光 蘆小單 李首慶 劉 磊 譚 巖

    (吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學診治實驗中心,長春 130021)

    目的:觀察CEA迷你基因串聯(lián)體疫苗pcDNA-triCEA625-667免疫小鼠脾細胞對腫瘤細胞特異性殺傷作用并對疫苗免疫小鼠后的安全性進行評估。方法:BALB/c小鼠隨機分為空白載體組(pcDNA3.0)、單倍體疫苗實驗組(pcDNA-CEA625-667)、串聯(lián)體疫苗實驗組(pcDNA-triCEA625-667),肌肉注射法免疫動物,每隔10 d免疫1次,共免疫4次,記錄免疫小鼠的體重變化、存活情況以及檢測血清ALT、肌酐水平。以疫苗免疫小鼠的脾細胞為效應細胞,以 LDH 釋放法檢測其對CEA陽性的小鼠肝癌細胞株(H22-CEA+)、胃癌細胞株(MFC-CEA+)、結腸癌細胞株(CT26-CEA+)以及CEA陰性小鼠肝癌細胞株(H22-CEA-)的特異性CTL的殺傷活性。結果:兩種疫苗對CEA陽性的肝癌、胃癌及結腸癌細胞均具有較強的殺傷活性,與 PcDNA3.0空載體組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而對CEA陰性腫瘤細胞(H22-CEA-)則幾乎無影響。迷你串聯(lián)體基因疫苗pcDNA-triCEA625-667對肝癌細胞H22-CEA+及胃癌細胞MFC-CEA+的殺傷活性強于單倍體基因疫苗pcDNA-CEA625-667(P<0.05)。疫苗免疫對小鼠的存活狀態(tài)、體重變化及肝腎功能指標均無影響。結論:CEA迷你基因疫苗安全有效,能夠誘導腫瘤特異性CTL產(chǎn)生,且三倍體串聯(lián)體疫苗免疫效果優(yōu)于單倍體疫苗。

    癌胚抗原;迷你基因;基因疫苗;體外實驗;抗腫瘤

    目前,高居惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率之首的CEA陽性腫瘤的治療效果不能令人滿意。為了探索一種安全有效的免疫治療新方法,本研究前期利用PCR技術從人基因組中得到CEA625-667DNA片段并將其順次定向亞克隆到真核表達載體 pcDNA3.0中,成功地構建了含有CEA625-667基因三串聯(lián)體的DNA疫苗pcDNA-triCEA625-667[1]。本次實驗擬應用該疫苗免疫的小鼠脾細胞為效應細胞,以肝癌、胃癌、結腸癌為靶細胞,觀察疫苗免疫的小鼠脾細胞對CEA陽性腫瘤細胞的殺傷作用,探討CEA迷你基因串聯(lián)體疫苗應用于CEA陽性腫瘤治療的可能性,并對疫苗免疫小鼠后的安全性進行評估,為進一步的臨床研究奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗材料 CEA陽性的小鼠肝癌細胞株(H22-CEA+)、胃癌細胞株(MFC-CEA+)、結腸癌細胞株(CT26-CEA+)、CEA陰性小鼠肝癌細胞株(H22-CEA-)(本室制備并保存);重組真核表達質(zhì)粒pcDNA-CEA625-667及pcDNA-triCEA625-667(本室制備并保存);IMDM培養(yǎng)基(美國Sigma公司);胎牛血清(Gibcobrl公司)。

    1.1.2 實驗動物 BALB/c小鼠購自吉林大學基礎醫(yī)學院動物室,雄性,6~8周,體重18~22 g。

    1.2 方法

    1.2.1 動物免疫 小鼠隨機分成3組,每組6只。分別為空白載體組(pcDNA3.0)、單倍體疫苗實驗組(pcDNA-CEA625-667)、串聯(lián)體疫苗實驗組(pcDNA-triCEA625-667)。肌肉注射法免疫動物。濃度為0.95 μg/μl的質(zhì)粒與終濃度3%氫氧化鋁膠懸液1∶1(V∶V)混合,每只小鼠每次接種100 μg質(zhì)粒。分兩側注射與小鼠大腿內(nèi)側肌群,每隔10 d免疫1次,共免疫4次。記錄免疫小鼠的體重變化情況及存活情況。

    1.2.2 免疫小鼠脾細胞的收集 最后一次免疫后10 d,斷頸處死小鼠,眼球取血,分離血清檢測ALT水平和肌酐水平。無菌取脾,將脾浸入含10%小牛血清的IMDM細胞培養(yǎng)液中,輕輕研磨,紗布過濾后用玻璃試管收集脾細胞。離心、破紅、重懸、洗滌,1%臺盼藍染色測定細胞存活率,計數(shù)后調(diào)整細胞濃度為1×107ml-1。

    1.2.3 免疫小鼠脾細胞對CEA陽性腫瘤細胞的殺傷作用 以LDH 釋放法檢測特異性CTL的殺傷活性。用含5%小牛血清的IMDM培養(yǎng)液調(diào)整各腫瘤細胞株至1×105ml-1作為靶細胞,每孔加入100 μl。以疫苗免疫小鼠的脾細胞為效應細胞,按照不同的效靶比(E∶T) 100∶1、50∶1、25∶1、12.5∶1 加入效應細胞,每孔加入100 μl,并分別設置靶細胞和效應細胞對照孔,設置3個復孔。37℃,5%CO2環(huán)境下共同孵育4 h,轉(zhuǎn)移上清至新的96 孔板,加入LDH 底物,室溫避光靜置30 min 后,加入終止反應液,測定490nm 的各孔OD值,計算殺傷率。殺傷率(%)=(實驗孔OD值-效應細胞自然釋放孔OD值-靶細胞自然釋放OD值)/(靶細胞最大釋放孔OD值-靶細胞自然釋放孔OD值)×100%。

    2 結果

    2.1 免疫小鼠的體重變化情況 圖1為疫苗免疫小鼠3個月內(nèi)的體重變化曲線??梢钥闯觯瑢嶒灲M小鼠與正常對照組比較有相同的體重增長曲線。表明疫苗沒有誘發(fā)實驗小鼠局部或全身的炎癥反應,導致小鼠體重下降。實驗組小鼠及對照組小鼠均無死亡。

    2.2 疫苗接種后小鼠肝腎功能檢測 血清中ALT水平和肌酐水平檢測結果顯示各組無明顯差異(P>0.05),表明pcDNA-CEA625-667及pcDNA-triCEA625-667肌肉注射免疫均對小鼠肝功能和腎功能沒有明顯的影響,見表1。

    2.3 免疫小鼠脾細胞對CEA陽性腫瘤細胞的殺傷作用 兩種疫苗免疫組小鼠脾細胞的 CTL 特異性殺傷活性均明顯增強,兩種疫苗對CEA陽性的肝癌、胃癌及結腸癌細胞均具有較強的殺傷活性,與PcDNA3.0空載體組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而對CEA陰性腫瘤細胞(H22-CEA-)幾乎無影響。且串聯(lián)體基因疫苗pcDNA-triCEA625-667組對肝癌細胞H22-CEA+及胃癌細胞MFC-CEA+的殺傷活性強于單倍體基因疫苗pcDNA-CEA625-667組(P<0.05)。結果見圖2。

    圖1 疫苗免疫后小鼠的體重變化曲線Fig.1 Curve of changes of mice weight after transplantion

    GroupsnALT(U/ml)Creatinine(μmol/L)pcDNA306526±231246±71pcDNA?CEA625?6676537±211219±68pcDNA?triCEA625?6676516±191234±74

    圖2 免疫小鼠脾細胞誘導的CTL 特異性殺傷活性Fig.2 CTL specific cytotoxicity induced by spleen cells in miceNote: *.P<0.01 vs pcDNA-3.0 group;△.P<0.05 vs pcDNA-CEA625-667 group.Effect target ratio 12.5∶1,25∶1,50∶1 and 100∶1 were denoted respectively by A,B,C and D.

    3 討論

    應用CEA疫苗進行免疫治療,能產(chǎn)生較廣譜的抗腫瘤作用,可以克服一種疫苗僅對一種腫瘤起作用的局限性。但由于CEA的免疫原性很弱或提呈障礙,不能誘發(fā)機體產(chǎn)生有效的免疫應答(這可能也是CEA陽性腫瘤逃避機體免疫監(jiān)控的原因之一)[2]。因此,增強CTL識別抗原的敏感性,避免出現(xiàn)免疫抑制,誘導產(chǎn)生高效特異的抗腫瘤免疫反應是CEA疫苗治療的主要目的。本研究前期實驗選擇了包含兩個CEA HTL表位(CEA625-669和CEA625-667)的迷你基因CEA625-667來制作串聯(lián)體基因疫苗,結果表明該疫苗增強免疫效應的作用[3]。

    DNA疫苗是近幾年來研究的熱點之一,它的主要特點在于它們能引起保護性細胞毒T細胞反應[4]。Wolff等[5]不借助病毒載體,將含有編碼luciferase基因cDNA的真核表達質(zhì)粒DNA直接注射入小鼠肌纖維細胞中,可在該肌細胞中檢測到luciferase的表達,從而產(chǎn)生了不依賴病毒載體導入的核酸疫苗。Conry等[6]先后對CEA核酸疫苗進行了系列研究,用含有CEA cDNA全序列的真核表達質(zhì)粒肌注免疫C57小鼠,共免疫3次,取C57小鼠的血液及脾,獲得了CEA特異性的體液和細胞免疫,在小鼠體內(nèi)檢測到抗CEA抗體及CEA特異性T細胞增殖;含CEA cDNA全序列的真核表達質(zhì)粒可誘導產(chǎn)生抗腫瘤免疫應答,在首次免疫3周后,可防止腫瘤的植入再生,而且發(fā)現(xiàn)只有肌注才有效;目前該核酸疫苗的Ⅰ期臨床應用研究正在進行當中,將編碼CEA和HbsAg的cDNA插入真核表達載體pcDNA3中,采用肌注的方法對結腸癌患者進行免疫,通過對抗CEA及HbsAg抗體、T細胞的增生及活性測定,對毒副反應的觀察,來評價該核酸疫苗的臨床效果。國內(nèi)李道坤等[7]也證實了重組CEA和IL-2抗腫瘤基因疫苗具有抗腫瘤活性。Xiang等[8]給CEA轉(zhuǎn)基因鼠口服DNA疫苗,發(fā)現(xiàn)其具有明顯的誘導腫瘤保護性免疫作用,這種作用主要是通過MHCⅠ類限制性CD8+T細胞介導的。Song等[9]的研究發(fā)現(xiàn),若用攜帶人CEA-DNA及IFN-γ或IL-12基因的質(zhì)粒給小鼠肌肉注射,能產(chǎn)生IgG2a抗CEA抗體及CEA特異性CTL,符合Th1型反應,能抑制CEA陽性腫瘤細胞株p815的生長;若用攜帶人CEA-DNA與IL-4基因的質(zhì)粒給小鼠肌肉注射,則產(chǎn)生的是IgG1抗體,符合Th2型反應,CTL活性及抗腫瘤細胞活性均減低。

    本研究觀察了疫苗免疫后小鼠的狀態(tài)、體重變化、肝腎功能以及存活情況,未觀察到肌肉注射疫苗給實驗小鼠帶來任何負面作用。與其他疫苗相比,基因疫苗無疑是安全、有效的。雖然基因疫苗可能會給某些疾病的防治帶來一場根本性的變革,但仍可能存在一些潛在的危險因素,例如質(zhì)粒DNA可能誘導自身免疫反應;持續(xù)表達外源抗原可能產(chǎn)生一些不良后果;少量疫苗質(zhì)粒肌注后逸入血流;接種DNA疫苗后,DNA分子在肌肉細胞中可能整合到宿主基因組等。雖然很多研究結果證明了上述可能性微乎其微,甚至動物實驗和臨床Ⅰ期安全性試驗的結果都證明基因疫苗是安全的[10-12]。然而DNA疫苗進入臨床應用還需要一段時間。

    [1] 李 丹,譚 巖,劉力華,等.CEA迷你基因串聯(lián)體腫瘤疫苗的構建[J].吉林大學學報(醫(yī)學版),2007,33(2):377-380.

    [2] Turriziani M,Fantini M,Benvenuto M,etal.Carcinoembryonic antigen (CEA)-based cancer vaccines:recent patents and antitumor effects from experimental models to clinical trials[J].Recent Pat Anticancer Drug Discov,2012,7(3):265-296.

    [3] Li D,Hua S,Fan Y,etal.DNA vaccine expressing repeated carcinoembryonic antigen (CEA)(625-667) induces strong immunity in mice[J].Immunol Lett,2011,135(1-2):124-128.

    [4] Chu D,Moroda M,Piao L,etal.CTL induction by DNA vaccine with Toxoplasma gondii-HSP70 gene[J].Parasitol Int,2014,62(2):408-416.

    [5] Wolff JA,Malone RW,Williams P,etal.Direct gene transfer into mouse muscle in vivo[J].Science,1990,247(4949 Pt1):1465-1468.

    [6] Conry RM,Lobuglio AF,Curiel DT.Phase a trial of a po lynucle otide antitumor immunization to human carcinoembryonic antigen in patients with metastatic colorectal cancer[J].Hum Gene Ther,1996,7:755-764.

    [7] 李道坤,張 帆,孫維權,等.重組CEA和IL-2抗腫瘤基因疫苗的構建及其抗腫瘤作用研究[J].中國醫(yī)藥指南,2013,11(35):50-52.

    [8] Xiang R,Silletti S,Lode HN.etal.Protective immunity against human carcinoembr-yonic antigen (CEA) induced by an oral DNA vaccine in CEA-transgenic mice[J].Clin Cancer Res,2001,7(3):856-864.

    [9] Song K,Chang Y,Prud′homme GJ.Regulation of T-helper-1 versus T-helper-2 activity and enhancement of tumor immunity by combined DNA-based vaccination and nonviral cytokine gene transfer[J].Gene Ther,2000,7(6):481-492.

    [10] Balint JP,Gabitzsch ES,Rice A,etal.Extended evaluation of a phase 1/2 trial on dosing,safety,immunogenicity,and overall survival after immunizations with an advanced-generation Ad5 [E1-,E2b-]-CEA(6D) vaccine in late-stage colorectal cancer[J].Cancer Immunol Immunother,2015,64(8):977-987.

    [11] Bilusic M,Heery CR,Arlen PM,etal.Phase I trial of a recombinant yeast-CEA vaccine (GI-6207) in adults with metastatic CEA-expressing carcinoma[J].Cancer Immunol Immunother,2014,63(3):225-234.

    [12] Diaz-Montero CM,Chiappori A,Aurisicchio L,etal.Phase 1 studies of the safety and immunogenicity of electroporated HER2/CEA DNA vaccine followed by adenoviral boost immunization in patients with solid tumors[J].J Transl Med,2013,11:62.

    [收稿2016-12-09]

    (編輯 許四平)

    Tumor specific immune response induced by three tandem repeats of CEA mini gene DNA vaccine and safety evaluation

    FANGYan-Qiu,WEIHai-Feng,LIDan,MIXu-Guang,LUXiao-Dan,LIShou-Qing,LIULei,TANYan.

    CenterforMedicalTreatmentandDiagnosis,JilinProvincePeople′sHospital,Changchun130021,China

    Objective:To observe the specific killing effect on tumor cells of the spleen cells in mice immunized with three tandem repeats of CEA minigene DNA vaccine pcDNA-triCEA625-667and to evaluate the safety of the vaccine.Methods: The BALB/c mice were randomly divided into blank vector group (pcDNA3.0),haploid vaccine group (pcDNA-CEA625-667) and tandem repeats vaccine group (pcDNA-triCEA625-667).The mice received a total of 4 intramuscular immunization every 10 days once.The changes of body weight,survival state were recorded and the levels of serum ALT and serum creatinine were detected.The specific CTL killing activity of spleen cells in accinated mice on mouse hepatoma cells(H22-CEA+),gastric cancer cells(MFC-CEA+),colorectal cancer cells(CT26-CEA+) with high expression of CEA and mouse hepatoma cells(H22-CEA-) without expression of CEA was detected.Results: The two vaccines had strong killing activity on CEA positive liver cancer,gastric cancer and colon cancer cells,and the difference was statistically significant (P<0.01) compared with the PcDNA3.0 group.And they had almost no effect on CEA negative tumor cells (H22-CEA-).The killing activity on liver cancer cell(H22-CEA+) and gastric cancer cell(MFC-CEA+) induced by pcDNA-triCEA625-667was stronger than that induced by pcDNA-triCEA625-667(P<0.05).The survival status,change of body weight and function of liver and kidney of the mice were not affected by the vaccine.Conclusion: There was no adverse reaction in the course of vaccine immunization.The minigene DNA vaccine derived from CEA can induce tumor specific CTL effect and the immune response level elicited by three tandem repeats of minigene DNA vaccine was superior to that elicited by haploid vaccine.

    Carcinoembryonic antigen;Minigene;DNA vaccine;Vitro experiment;Anti tumor

    10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.011

    ①本文受吉林省科技廳國際合作項目(20140414043GH)、吉林省科技廳中青年科技創(chuàng)新領軍人才及團隊項目(20140519018JH)、吉林省人社廳省人才開發(fā)資金(2016年度)和吉林省科技廳重點實驗室項目(20122113)資助。

    及指導教師:譚 巖(1956年-),男,博士,教授,博士生導師,主要從事腫瘤生物治療及疫苗研發(fā)方面的研究,E-mail:tanyan49@hotmail.com。

    R392 R730.5

    A

    1000-484X(2017)02-0217-04

    ②吉林大學第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科,長春130021。作者簡介:方艷秋(1968年-),女,博士,教授,主任醫(yī)師,碩士生導師,主要從事腫瘤生物治療基礎與臨床方面的研究,E-mail:yq.fang@163.com。

    猜你喜歡
    小鼠
    晚安,大大鼠!
    萌小鼠,捍衛(wèi)人類健康的“大英雄”
    科學大眾(2021年6期)2021-07-20 07:42:44
    視神經(jīng)節(jié)細胞再生令小鼠復明
    科學(2020年3期)2020-11-26 08:18:30
    小鼠大腦中的“冬眠開關”
    今天不去幼兒園
    清肝二十七味丸對酒精性肝損傷小鼠的保護作用
    中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:19:34
    米小鼠和它的伙伴們
    高氟對C57BL/6J小鼠睪丸中AQP1、AQP4表達的影響
    Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
    加味四逆湯對Con A肝損傷小鼠細胞凋亡的保護作用
    男女床上黄色一级片免费看| 夫妻午夜视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 久久国产乱子伦精品免费另类| 免费高清视频大片| tocl精华| 欧美中文综合在线视频| 精品国产国语对白av| 在线观看免费视频日本深夜| 18禁国产床啪视频网站| 久久久久久久精品吃奶| 成熟少妇高潮喷水视频| 岛国在线观看网站| 国产亚洲精品第一综合不卡| 天堂中文最新版在线下载| 国产成人av教育| 欧美最黄视频在线播放免费 | 麻豆久久精品国产亚洲av | 日日夜夜操网爽| 一区二区三区激情视频| 亚洲av美国av| 一级作爱视频免费观看| 啦啦啦在线免费观看视频4| 妹子高潮喷水视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 午夜免费激情av| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美人与性动交α欧美软件| av在线播放免费不卡| 久久人妻熟女aⅴ| 免费不卡黄色视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 日日干狠狠操夜夜爽| www国产在线视频色| 欧美乱码精品一区二区三区| 在线观看一区二区三区激情| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 成熟少妇高潮喷水视频| 在线观看免费视频日本深夜| 免费高清视频大片| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| xxx96com| 国产精品综合久久久久久久免费 | 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 91麻豆av在线| 欧美国产精品va在线观看不卡| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲av电影在线进入| 99riav亚洲国产免费| 高清在线国产一区| 亚洲中文字幕日韩| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产成人精品久久二区二区免费| 波多野结衣av一区二区av| 国产av精品麻豆| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 日日干狠狠操夜夜爽| 中出人妻视频一区二区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 丰满的人妻完整版| 久久精品91无色码中文字幕| 高潮久久久久久久久久久不卡| 日本黄色视频三级网站网址| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 99热国产这里只有精品6| 国产精品野战在线观看 | 人妻久久中文字幕网| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 一区二区日韩欧美中文字幕| 男女下面插进去视频免费观看| 一级片'在线观看视频| 老司机亚洲免费影院| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 香蕉国产在线看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产免费现黄频在线看| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久亚洲精品不卡| 国产精品偷伦视频观看了| 人人澡人人妻人| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| av视频免费观看在线观看| 18美女黄网站色大片免费观看| 午夜成年电影在线免费观看| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲av美国av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 精品第一国产精品| 亚洲伊人色综图| 极品教师在线免费播放| 欧美黄色淫秽网站| 手机成人av网站| 一a级毛片在线观看| 一级片免费观看大全| 男女高潮啪啪啪动态图| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 精品久久久久久电影网| 美女国产高潮福利片在线看| 岛国视频午夜一区免费看| 欧美色视频一区免费| 国产精品电影一区二区三区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲国产欧美一区二区综合| 精品久久久久久久久久免费视频 | 日韩高清综合在线| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲 国产 在线| 嫩草影院精品99| 老司机午夜福利在线观看视频| 岛国在线观看网站| 国产精品二区激情视频| av福利片在线| 欧美乱色亚洲激情| 国产精品国产av在线观看| 日韩高清综合在线| 在线国产一区二区在线| 久久狼人影院| 久久午夜亚洲精品久久| 黑人操中国人逼视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 桃红色精品国产亚洲av| 在线国产一区二区在线| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 免费在线观看黄色视频的| 精品国产国语对白av| 波多野结衣av一区二区av| a级毛片在线看网站| 久久人妻av系列| 久久婷婷成人综合色麻豆| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲黑人精品在线| 亚洲 欧美一区二区三区| www.自偷自拍.com| 国产不卡一卡二| 精品国产乱码久久久久久男人| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产麻豆69| 国产人伦9x9x在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 高清欧美精品videossex| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 纯流量卡能插随身wifi吗| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 在线视频色国产色| 啦啦啦免费观看视频1| 国产精品二区激情视频| 日本 av在线| 午夜福利在线免费观看网站| 国产国语露脸激情在线看| 国产亚洲精品一区二区www| 国产xxxxx性猛交| 午夜免费激情av| 黄色毛片三级朝国网站| 成人特级黄色片久久久久久久| 日韩欧美一区视频在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产区一区二久久| 一级毛片精品| 国产精品国产高清国产av| 手机成人av网站| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| av在线播放免费不卡| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 岛国视频午夜一区免费看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 男女下面插进去视频免费观看| 丝袜人妻中文字幕| 99热国产这里只有精品6| 国产精品 欧美亚洲| 丁香六月欧美| 欧美成人午夜精品| 国产成年人精品一区二区 | 午夜福利欧美成人| 精品熟女少妇八av免费久了| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 九色亚洲精品在线播放| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲熟女毛片儿| 久久久国产精品麻豆| 91麻豆av在线| 国产精品影院久久| 91国产中文字幕| 亚洲欧美一区二区三区久久| 岛国视频午夜一区免费看| 老司机午夜十八禁免费视频| 动漫黄色视频在线观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 成人精品一区二区免费| 免费av毛片视频| 日本wwww免费看| 女性被躁到高潮视频| 99国产精品免费福利视频| 女人精品久久久久毛片| 久久久久久免费高清国产稀缺| av在线天堂中文字幕 | 美女大奶头视频| 99riav亚洲国产免费| 丝袜美足系列| 亚洲成人国产一区在线观看| 日本wwww免费看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久久水蜜桃国产精品网| 久久久国产成人精品二区 | 色婷婷av一区二区三区视频| 激情视频va一区二区三区| 国产av精品麻豆| 精品第一国产精品| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 精品久久久久久电影网| 在线观看www视频免费| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产精品日韩av在线免费观看 | 午夜激情av网站| 黄色视频不卡| 国产亚洲欧美精品永久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 夜夜爽天天搞| 无限看片的www在线观看| 99国产精品免费福利视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 久久香蕉精品热| av在线天堂中文字幕 | 午夜a级毛片| 欧美日韩视频精品一区| 精品福利观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 精品久久久久久久久久免费视频 | bbb黄色大片| 手机成人av网站| 色综合站精品国产| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 热99re8久久精品国产| 黄色成人免费大全| 男女之事视频高清在线观看| 在线国产一区二区在线| 亚洲av美国av| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲专区国产一区二区| 欧美在线一区亚洲| 无限看片的www在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 国产成人啪精品午夜网站| 午夜视频精品福利| 国产黄色免费在线视频| 国产免费男女视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久精品91蜜桃| 大型av网站在线播放| 窝窝影院91人妻| 日本 av在线| 国产区一区二久久| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日韩中文字幕欧美一区二区| 天堂中文最新版在线下载| 黄色毛片三级朝国网站| 男女床上黄色一级片免费看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲精品一区av在线观看| 超色免费av| 热99国产精品久久久久久7| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 一区二区三区激情视频| 中亚洲国语对白在线视频| 国产免费男女视频| 黑丝袜美女国产一区| 人人澡人人妻人| 国产三级在线视频| 久久九九热精品免费| 岛国在线观看网站| 免费观看人在逋| 免费观看精品视频网站| 国产精品久久久人人做人人爽| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 在线观看www视频免费| 久久久久久久久久久久大奶| 一本大道久久a久久精品| 国产精品二区激情视频| 国产精品 欧美亚洲| 涩涩av久久男人的天堂| 老司机午夜十八禁免费视频| 91字幕亚洲| 又大又爽又粗| 久久国产精品影院| 人成视频在线观看免费观看| 老司机亚洲免费影院| 91成年电影在线观看| xxx96com| 88av欧美| 制服人妻中文乱码| 国产欧美日韩一区二区三| 婷婷丁香在线五月| 国产精品久久久av美女十八| 首页视频小说图片口味搜索| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久久国产成人免费| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 中文字幕人妻熟女乱码| 久久精品91蜜桃| 视频在线观看一区二区三区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产成人精品久久二区二区免费| 美女高潮到喷水免费观看| 黄色a级毛片大全视频| 精品一品国产午夜福利视频| 久久草成人影院| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美色视频一区免费| 在线国产一区二区在线| 久久亚洲精品不卡| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲自拍偷在线| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 91字幕亚洲| 国产av又大| 动漫黄色视频在线观看| 久久性视频一级片| 久久婷婷成人综合色麻豆| a在线观看视频网站| 久久国产精品影院| 久久精品成人免费网站| 亚洲中文字幕日韩| 国产色视频综合| 久久国产精品影院| 桃红色精品国产亚洲av| 999久久久精品免费观看国产| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲成人免费电影在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 欧美大码av| 日韩欧美一区视频在线观看| 日韩欧美在线二视频| 一级a爱片免费观看的视频| 首页视频小说图片口味搜索| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲免费av在线视频| 日韩精品青青久久久久久| 欧美日韩视频精品一区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 又紧又爽又黄一区二区| 久久精品成人免费网站| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美精品一区二区免费开放| 999久久久精品免费观看国产| 高清毛片免费观看视频网站 | 亚洲av第一区精品v没综合| 91九色精品人成在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 黑人操中国人逼视频| 免费高清在线观看日韩| 91在线观看av| 日韩欧美免费精品| 不卡av一区二区三区| 日韩欧美免费精品| 不卡av一区二区三区| 国产亚洲精品久久久久5区| av电影中文网址| 大陆偷拍与自拍| 亚洲av片天天在线观看| 视频区欧美日本亚洲| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品九九99| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 日韩视频一区二区在线观看| 韩国av一区二区三区四区| 久久精品人人爽人人爽视色| 美国免费a级毛片| 国产av精品麻豆| 亚洲专区字幕在线| 天堂中文最新版在线下载| 香蕉久久夜色| 午夜亚洲福利在线播放| 日韩国内少妇激情av| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产有黄有色有爽视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 欧美人与性动交α欧美软件| 大型av网站在线播放| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久亚洲真实| 亚洲熟女毛片儿| 国产精品偷伦视频观看了| 国产一区二区三区视频了| 一区二区三区精品91| 身体一侧抽搐| 女警被强在线播放| 久久人人精品亚洲av| 操美女的视频在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产精品久久电影中文字幕| 午夜免费观看网址| 一级毛片女人18水好多| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 久久精品国产亚洲av高清一级| 成年版毛片免费区| 久久久久国内视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 91国产中文字幕| 色哟哟哟哟哟哟| 99热国产这里只有精品6| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲成国产人片在线观看| 丁香欧美五月| 伦理电影免费视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产1区2区3区精品| 露出奶头的视频| 国产熟女xx| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 激情在线观看视频在线高清| 十八禁人妻一区二区| 久久精品91蜜桃| 久99久视频精品免费| 18禁观看日本| 首页视频小说图片口味搜索| 在线观看免费视频网站a站| 欧美大码av| 亚洲av成人av| av电影中文网址| 满18在线观看网站| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 真人一进一出gif抽搐免费| 18禁观看日本| 女人被狂操c到高潮| 一区福利在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 很黄的视频免费| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 99久久精品国产亚洲精品| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 黑人猛操日本美女一级片| 在线免费观看的www视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产免费现黄频在线看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 最近最新免费中文字幕在线| 不卡一级毛片| av片东京热男人的天堂| 在线观看免费视频网站a站| 9色porny在线观看| 91精品三级在线观看| 久久 成人 亚洲| 成人亚洲精品一区在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 人成视频在线观看免费观看| 热re99久久精品国产66热6| 99香蕉大伊视频| av天堂在线播放| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 午夜免费观看网址| 一级毛片精品| 最近最新中文字幕大全免费视频| 动漫黄色视频在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 一区福利在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 天天添夜夜摸| 色老头精品视频在线观看| 亚洲人成电影观看| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲五月天丁香| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 免费在线观看亚洲国产| 久热这里只有精品99| 国产成人av激情在线播放| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲av五月六月丁香网| 一级作爱视频免费观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 制服人妻中文乱码| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 成年版毛片免费区| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产在线观看jvid| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产成人精品在线电影| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 两性夫妻黄色片| 新久久久久国产一级毛片| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲熟妇熟女久久| 午夜福利影视在线免费观看| 日韩大码丰满熟妇| 久久人人97超碰香蕉20202| 老司机福利观看| 精品一品国产午夜福利视频| 一级毛片精品| 日韩av在线大香蕉| 国产99白浆流出| 国产精品亚洲av一区麻豆| 丰满的人妻完整版| 亚洲国产欧美网| 69av精品久久久久久| 丝袜在线中文字幕| 国产亚洲欧美98| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 精品国产亚洲在线| 亚洲免费av在线视频| 宅男免费午夜| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 中国美女看黄片| 大型黄色视频在线免费观看| 日本三级黄在线观看| 免费高清视频大片| 岛国在线观看网站| 大香蕉久久成人网| 亚洲欧美日韩无卡精品| 两个人看的免费小视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 女人精品久久久久毛片| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 99国产精品一区二区蜜桃av| 身体一侧抽搐| 久久久国产一区二区| 久久精品影院6| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久午夜亚洲精品久久| 免费少妇av软件| 久久热在线av| 精品免费久久久久久久清纯| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲欧美精品综合久久99| 99在线人妻在线中文字幕| 免费日韩欧美在线观看| 麻豆国产av国片精品| 国产成人系列免费观看| 日韩大尺度精品在线看网址 | av网站在线播放免费| 深夜精品福利| 国产精品久久久久成人av| 视频在线观看一区二区三区| 久久久久亚洲av毛片大全| 级片在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 欧美黄色片欧美黄色片| 窝窝影院91人妻| 久久久久久久午夜电影 | 天天添夜夜摸| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 一级,二级,三级黄色视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产精品综合久久久久久久免费 | 一级,二级,三级黄色视频| 久久香蕉精品热| 99精品久久久久人妻精品| 波多野结衣高清无吗| 国产成人欧美在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜 | av在线天堂中文字幕 | av超薄肉色丝袜交足视频| 97碰自拍视频| 国产高清国产精品国产三级| 黄频高清免费视频| 免费在线观看影片大全网站| 日本三级黄在线观看| 午夜福利在线免费观看网站| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲成国产人片在线观看| 在线天堂中文资源库| 97人妻天天添夜夜摸| e午夜精品久久久久久久| 1024香蕉在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 男女之事视频高清在线观看| 国产乱人伦免费视频| 一级作爱视频免费观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 色综合欧美亚洲国产小说| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 两人在一起打扑克的视频| 啦啦啦免费观看视频1| 久久影院123| 国产欧美日韩精品亚洲av| 精品国产国语对白av| 免费搜索国产男女视频| 一区二区三区激情视频| 午夜老司机福利片| 91成人精品电影| 国产精品永久免费网站| 国产精品一区二区三区四区久久 | 国产午夜精品久久久久久| 黑人操中国人逼视频| 夜夜爽天天搞| 999精品在线视频|