CEA迷你基因串聯(lián)體疫苗免疫小鼠脾細胞對CEA陽性腫瘤細胞的殺傷作用及疫苗的安全性評價①

方艷秋 魏海峰 李 丹 米旭光 蘆小單 李首慶 劉 磊 譚 巖

(吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學診治實驗中心，長春 130021)

·生物治療·

CEA迷你基因串聯(lián)體疫苗免疫小鼠脾細胞對CEA陽性腫瘤細胞的殺傷作用及疫苗的安全性評價①

方艷秋 魏海峰 李 丹②米旭光 蘆小單 李首慶 劉 磊 譚 巖

(吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學診治實驗中心，長春 130021)

目的：觀察CEA迷你基因串聯(lián)體疫苗pcDNA-triCEA625-667免疫小鼠脾細胞對腫瘤細胞特異性殺傷作用并對疫苗免疫小鼠后的安全性進行評估。方法：BALB/c小鼠隨機分為空白載體組(pcDNA3.0)、單倍體疫苗實驗組(pcDNA-CEA625-667)、串聯(lián)體疫苗實驗組(pcDNA-triCEA625-667)，肌肉注射法免疫動物，每隔10 d免疫1次，共免疫4次，記錄免疫小鼠的體重變化、存活情況以及檢測血清ALT、肌酐水平。以疫苗免疫小鼠的脾細胞為效應細胞，以 LDH 釋放法檢測其對CEA陽性的小鼠肝癌細胞株(H22-CEA+)、胃癌細胞株(MFC-CEA+)、結腸癌細胞株(CT26-CEA+)以及CEA陰性小鼠肝癌細胞株(H22-CEA-)的特異性CTL的殺傷活性。結果：兩種疫苗對CEA陽性的肝癌、胃癌及結腸癌細胞均具有較強的殺傷活性，與 PcDNA3.0空載體組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而對CEA陰性腫瘤細胞(H22-CEA-)則幾乎無影響。迷你串聯(lián)體基因疫苗pcDNA-triCEA625-667對肝癌細胞H22-CEA+及胃癌細胞MFC-CEA+的殺傷活性強于單倍體基因疫苗pcDNA-CEA625-667(P<0.05)。疫苗免疫對小鼠的存活狀態(tài)、體重變化及肝腎功能指標均無影響。結論：CEA迷你基因疫苗安全有效，能夠誘導腫瘤特異性CTL產(chǎn)生，且三倍體串聯(lián)體疫苗免疫效果優(yōu)于單倍體疫苗。

癌胚抗原；迷你基因；基因疫苗；體外實驗；抗腫瘤

目前，高居惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率之首的CEA陽性腫瘤的治療效果不能令人滿意。為了探索一種安全有效的免疫治療新方法，本研究前期利用PCR技術從人基因組中得到CEA625-667DNA片段并將其順次定向亞克隆到真核表達載體 pcDNA3.0中，成功地構建了含有CEA625-667基因三串聯(lián)體的DNA疫苗pcDNA-triCEA625-667[1]。本次實驗擬應用該疫苗免疫的小鼠脾細胞為效應細胞，以肝癌、胃癌、結腸癌為靶細胞，觀察疫苗免疫的小鼠脾細胞對CEA陽性腫瘤細胞的殺傷作用，探討CEA迷你基因串聯(lián)體疫苗應用于CEA陽性腫瘤治療的可能性，并對疫苗免疫小鼠后的安全性進行評估，為進一步的臨床研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 CEA陽性的小鼠肝癌細胞株(H22-CEA+)、胃癌細胞株(MFC-CEA+)、結腸癌細胞株(CT26-CEA+)、CEA陰性小鼠肝癌細胞株(H22-CEA-)(本室制備并保存)；重組真核表達質(zhì)粒pcDNA-CEA625-667及pcDNA-triCEA625-667(本室制備并保存)；IMDM培養(yǎng)基(美國Sigma公司)；胎牛血清(Gibcobrl公司)。

1.1.2 實驗動物 BALB/c小鼠購自吉林大學基礎醫(yī)學院動物室，雄性，6～8周，體重18～22 g。

1.2 方法

1.2.1 動物免疫 小鼠隨機分成3組，每組6只。分別為空白載體組(pcDNA3.0)、單倍體疫苗實驗組(pcDNA-CEA625-667)、串聯(lián)體疫苗實驗組(pcDNA-triCEA625-667)。肌肉注射法免疫動物。濃度為0.95 μg/μl的質(zhì)粒與終濃度3%氫氧化鋁膠懸液1∶1(V∶V)混合，每只小鼠每次接種100 μg質(zhì)粒。分兩側注射與小鼠大腿內(nèi)側肌群，每隔10 d免疫1次，共免疫4次。記錄免疫小鼠的體重變化情況及存活情況。

1.2.2 免疫小鼠脾細胞的收集 最后一次免疫后10 d，斷頸處死小鼠，眼球取血，分離血清檢測ALT水平和肌酐水平。無菌取脾，將脾浸入含10%小牛血清的IMDM細胞培養(yǎng)液中，輕輕研磨，紗布過濾后用玻璃試管收集脾細胞。離心、破紅、重懸、洗滌，1%臺盼藍染色測定細胞存活率，計數(shù)后調(diào)整細胞濃度為1×107ml-1。

1.2.3 免疫小鼠脾細胞對CEA陽性腫瘤細胞的殺傷作用 以LDH 釋放法檢測特異性CTL的殺傷活性。用含5%小牛血清的IMDM培養(yǎng)液調(diào)整各腫瘤細胞株至1×105ml-1作為靶細胞，每孔加入100 μl。以疫苗免疫小鼠的脾細胞為效應細胞，按照不同的效靶比(E∶T) 100∶1、50∶1、25∶1、12.5∶1 加入效應細胞，每孔加入100 μl，并分別設置靶細胞和效應細胞對照孔，設置3個復孔。37℃，5%CO2環(huán)境下共同孵育4 h，轉(zhuǎn)移上清至新的96 孔板，加入LDH 底物，室溫避光靜置30 min 后，加入終止反應液，測定490nm 的各孔OD值，計算殺傷率。殺傷率(%)=(實驗孔OD值-效應細胞自然釋放孔OD值-靶細胞自然釋放OD值)/(靶細胞最大釋放孔OD值-靶細胞自然釋放孔OD值)×100%。

2 結果

2.1 免疫小鼠的體重變化情況 圖1為疫苗免疫小鼠3個月內(nèi)的體重變化曲線?？梢钥闯觯瑢嶒灲M小鼠與正常對照組比較有相同的體重增長曲線。表明疫苗沒有誘發(fā)實驗小鼠局部或全身的炎癥反應，導致小鼠體重下降。實驗組小鼠及對照組小鼠均無死亡。

2.2 疫苗接種后小鼠肝腎功能檢測 血清中ALT水平和肌酐水平檢測結果顯示各組無明顯差異(P>0.05)，表明pcDNA-CEA625-667及pcDNA-triCEA625-667肌肉注射免疫均對小鼠肝功能和腎功能沒有明顯的影響，見表1。

2.3 免疫小鼠脾細胞對CEA陽性腫瘤細胞的殺傷作用 兩種疫苗免疫組小鼠脾細胞的 CTL 特異性殺傷活性均明顯增強，兩種疫苗對CEA陽性的肝癌、胃癌及結腸癌細胞均具有較強的殺傷活性，與PcDNA3.0空載體組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而對CEA陰性腫瘤細胞(H22-CEA-)幾乎無影響。且串聯(lián)體基因疫苗pcDNA-triCEA625-667組對肝癌細胞H22-CEA+及胃癌細胞MFC-CEA+的殺傷活性強于單倍體基因疫苗pcDNA-CEA625-667組(P<0.05)。結果見圖2。

圖1 疫苗免疫后小鼠的體重變化曲線Fig.1 Curve of changes of mice weight after transplantion

GroupsnALT(U/ml)Creatinine(μmol/L)pcDNA306526±231246±71pcDNA?CEA625?6676537±211219±68pcDNA?triCEA625?6676516±191234±74

圖2 免疫小鼠脾細胞誘導的CTL 特異性殺傷活性Fig.2 CTL specific cytotoxicity induced by spleen cells in miceNote: *.P<0.01 vs pcDNA-3.0 group；△.P<0.05 vs pcDNA-CEA625-667 group.Effect target ratio 12.5∶1,25∶1,50∶1 and 100∶1 were denoted respectively by A,B,C and D.

3 討論

應用CEA疫苗進行免疫治療，能產(chǎn)生較廣譜的抗腫瘤作用，可以克服一種疫苗僅對一種腫瘤起作用的局限性。但由于CEA的免疫原性很弱或提呈障礙，不能誘發(fā)機體產(chǎn)生有效的免疫應答(這可能也是CEA陽性腫瘤逃避機體免疫監(jiān)控的原因之一)[2]。因此，增強CTL識別抗原的敏感性，避免出現(xiàn)免疫抑制，誘導產(chǎn)生高效特異的抗腫瘤免疫反應是CEA疫苗治療的主要目的。本研究前期實驗選擇了包含兩個CEA HTL表位(CEA625-669和CEA625-667)的迷你基因CEA625-667來制作串聯(lián)體基因疫苗，結果表明該疫苗增強免疫效應的作用[3]。

DNA疫苗是近幾年來研究的熱點之一，它的主要特點在于它們能引起保護性細胞毒T細胞反應[4]。Wolff等[5]不借助病毒載體,將含有編碼luciferase基因cDNA的真核表達質(zhì)粒DNA直接注射入小鼠肌纖維細胞中，可在該肌細胞中檢測到luciferase的表達，從而產(chǎn)生了不依賴病毒載體導入的核酸疫苗。Conry等[6]先后對CEA核酸疫苗進行了系列研究，用含有CEA cDNA全序列的真核表達質(zhì)粒肌注免疫C57小鼠，共免疫3次，取C57小鼠的血液及脾，獲得了CEA特異性的體液和細胞免疫，在小鼠體內(nèi)檢測到抗CEA抗體及CEA特異性T細胞增殖；含CEA cDNA全序列的真核表達質(zhì)粒可誘導產(chǎn)生抗腫瘤免疫應答，在首次免疫3周后，可防止腫瘤的植入再生，而且發(fā)現(xiàn)只有肌注才有效；目前該核酸疫苗的Ⅰ期臨床應用研究正在進行當中，將編碼CEA和HbsAg的cDNA插入真核表達載體pcDNA3中，采用肌注的方法對結腸癌患者進行免疫，通過對抗CEA及HbsAg抗體、T細胞的增生及活性測定，對毒副反應的觀察，來評價該核酸疫苗的臨床效果。國內(nèi)李道坤等[7]也證實了重組CEA和IL-2抗腫瘤基因疫苗具有抗腫瘤活性。Xiang等[8]給CEA轉(zhuǎn)基因鼠口服DNA疫苗，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的誘導腫瘤保護性免疫作用，這種作用主要是通過MHCⅠ類限制性CD8+T細胞介導的。Song等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，若用攜帶人CEA-DNA及IFN-γ或IL-12基因的質(zhì)粒給小鼠肌肉注射，能產(chǎn)生IgG2a抗CEA抗體及CEA特異性CTL，符合Th1型反應，能抑制CEA陽性腫瘤細胞株p815的生長；若用攜帶人CEA-DNA與IL-4基因的質(zhì)粒給小鼠肌肉注射，則產(chǎn)生的是IgG1抗體，符合Th2型反應，CTL活性及抗腫瘤細胞活性均減低。

本研究觀察了疫苗免疫后小鼠的狀態(tài)、體重變化、肝腎功能以及存活情況，未觀察到肌肉注射疫苗給實驗小鼠帶來任何負面作用。與其他疫苗相比，基因疫苗無疑是安全、有效的。雖然基因疫苗可能會給某些疾病的防治帶來一場根本性的變革，但仍可能存在一些潛在的危險因素，例如質(zhì)粒DNA可能誘導自身免疫反應；持續(xù)表達外源抗原可能產(chǎn)生一些不良后果；少量疫苗質(zhì)粒肌注后逸入血流；接種DNA疫苗后，DNA分子在肌肉細胞中可能整合到宿主基因組等。雖然很多研究結果證明了上述可能性微乎其微，甚至動物實驗和臨床Ⅰ期安全性試驗的結果都證明基因疫苗是安全的[10-12]。然而DNA疫苗進入臨床應用還需要一段時間。

[1] 李 丹,譚 巖,劉力華,等.CEA迷你基因串聯(lián)體腫瘤疫苗的構建[J].吉林大學學報(醫(yī)學版),2007,33(2):377-380.

[2] Turriziani M,Fantini M,Benvenuto M,etal.Carcinoembryonic antigen (CEA)-based cancer vaccines:recent patents and antitumor effects from experimental models to clinical trials[J].Recent Pat Anticancer Drug Discov,2012,7(3):265-296.

[3] Li D,Hua S,Fan Y,etal.DNA vaccine expressing repeated carcinoembryonic antigen (CEA)(625-667) induces strong immunity in mice[J].Immunol Lett,2011,135(1-2):124-128.

[4] Chu D,Moroda M,Piao L,etal.CTL induction by DNA vaccine with Toxoplasma gondii-HSP70 gene[J].Parasitol Int,2014,62(2):408-416.

[5] Wolff JA,Malone RW,Williams P,etal.Direct gene transfer into mouse muscle in vivo[J].Science,1990,247(4949 Pt1):1465-1468.

[6] Conry RM,Lobuglio AF,Curiel DT.Phase a trial of a po lynucle otide antitumor immunization to human carcinoembryonic antigen in patients with metastatic colorectal cancer[J].Hum Gene Ther,1996,7:755-764.

[7] 李道坤,張 帆,孫維權,等.重組CEA和IL-2抗腫瘤基因疫苗的構建及其抗腫瘤作用研究[J].中國醫(yī)藥指南,2013,11(35):50-52.

[8] Xiang R,Silletti S,Lode HN.etal.Protective immunity against human carcinoembr-yonic antigen (CEA) induced by an oral DNA vaccine in CEA-transgenic mice[J].Clin Cancer Res,2001,7(3):856-864.

[9] Song K,Chang Y,Prud′homme GJ.Regulation of T-helper-1 versus T-helper-2 activity and enhancement of tumor immunity by combined DNA-based vaccination and nonviral cytokine gene transfer[J].Gene Ther,2000,7(6):481-492.

[10] Balint JP,Gabitzsch ES,Rice A,etal.Extended evaluation of a phase 1/2 trial on dosing,safety,immunogenicity,and overall survival after immunizations with an advanced-generation Ad5 [E1-,E2b-]-CEA(6D) vaccine in late-stage colorectal cancer[J].Cancer Immunol Immunother,2015,64(8):977-987.

[11] Bilusic M,Heery CR,Arlen PM,etal.Phase I trial of a recombinant yeast-CEA vaccine (GI-6207) in adults with metastatic CEA-expressing carcinoma[J].Cancer Immunol Immunother,2014,63(3):225-234.

[12] Diaz-Montero CM,Chiappori A,Aurisicchio L,etal.Phase 1 studies of the safety and immunogenicity of electroporated HER2/CEA DNA vaccine followed by adenoviral boost immunization in patients with solid tumors[J].J Transl Med,2013,11:62.

[收稿2016-12-09]

(編輯 許四平)

Tumor specific immune response induced by three tandem repeats of CEA mini gene DNA vaccine and safety evaluation

FANGYan-Qiu,WEIHai-Feng,LIDan,MIXu-Guang,LUXiao-Dan,LIShou-Qing,LIULei,TANYan.

CenterforMedicalTreatmentandDiagnosis,JilinProvincePeople′sHospital,Changchun130021,China

Objective:To observe the specific killing effect on tumor cells of the spleen cells in mice immunized with three tandem repeats of CEA minigene DNA vaccine pcDNA-triCEA625-667and to evaluate the safety of the vaccine.Methods: The BALB/c mice were randomly divided into blank vector group (pcDNA3.0),haploid vaccine group (pcDNA-CEA625-667) and tandem repeats vaccine group (pcDNA-triCEA625-667).The mice received a total of 4 intramuscular immunization every 10 days once.The changes of body weight,survival state were recorded and the levels of serum ALT and serum creatinine were detected.The specific CTL killing activity of spleen cells in accinated mice on mouse hepatoma cells(H22-CEA+),gastric cancer cells(MFC-CEA+),colorectal cancer cells(CT26-CEA+) with high expression of CEA and mouse hepatoma cells(H22-CEA-) without expression of CEA was detected.Results: The two vaccines had strong killing activity on CEA positive liver cancer,gastric cancer and colon cancer cells,and the difference was statistically significant (P<0.01) compared with the PcDNA3.0 group.And they had almost no effect on CEA negative tumor cells (H22-CEA-).The killing activity on liver cancer cell(H22-CEA+) and gastric cancer cell(MFC-CEA+) induced by pcDNA-triCEA625-667was stronger than that induced by pcDNA-triCEA625-667(P<0.05).The survival status,change of body weight and function of liver and kidney of the mice were not affected by the vaccine.Conclusion: There was no adverse reaction in the course of vaccine immunization.The minigene DNA vaccine derived from CEA can induce tumor specific CTL effect and the immune response level elicited by three tandem repeats of minigene DNA vaccine was superior to that elicited by haploid vaccine.

Carcinoembryonic antigen;Minigene;DNA vaccine;Vitro experiment；Anti tumor

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.011

①本文受吉林省科技廳國際合作項目(20140414043GH)、吉林省科技廳中青年科技創(chuàng)新領軍人才及團隊項目(20140519018JH)、吉林省人社廳省人才開發(fā)資金(2016年度)和吉林省科技廳重點實驗室項目(20122113)資助。

及指導教師：譚 巖(1956年-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事腫瘤生物治療及疫苗研發(fā)方面的研究，E-mail：tanyan49@hotmail.com。

R392 R730.5

A

1000-484X(2017)02-0217-04

②吉林大學第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，長春130021。作者簡介：方艷秋(1968年-)，女，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事腫瘤生物治療基礎與臨床方面的研究，E-mail：yq.fang@163.com。