LL-37抑制結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞炎性因子分泌的研究①

鄧 燕 杜先智

(重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶400010)

LL-37抑制結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞炎性因子分泌的研究①

鄧 燕 杜先智

(重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶400010)

目的：探討LL-37在感染結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)的巨噬細(xì)胞(Macrophage,Mφ)中對(duì)炎性因子分泌的影響及其抗炎作用。方法：(1)使用豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)將THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)分化為具有吞噬作用的巨噬細(xì)胞(Mφ)，用Mtb感染Mφ，構(gòu)建細(xì)胞模型，用不同濃度的LL-37處理感染Mtb的巨噬細(xì)胞，并設(shè)置對(duì)照組。(2)實(shí)驗(yàn)分組：①正常對(duì)照組：THP-1+生理鹽水;②Mtb組：THP-1+Mtb；③Mtb+LL-37 5 μg/ml組:THP-1+Mtb+5 μg/ml LL-37；④ Mtb+ LL-37 10 μg/ml組：THP-1+ Mtb+10 μg/ml LL-37；⑤ Mtb+ LL-37 20 μg/ml組：THP-1+Mtb+20 μg/ml LL-37。(3)各組培養(yǎng)6、12、24、48 h后用RT-PCR檢測(cè)促炎因子IL-12p40、TNF-α及抗炎因子IL-4、IL-10 mRNA的表達(dá)；ELISA測(cè)定上清中細(xì)胞因子IL-12p40、TNF-α、IL-4、IL-10的分泌量。結(jié)果：與正常對(duì)照組相比較，Mtb感染組各時(shí)間段IL-12p40、TNF-α、IL-4及IL-10 的mRNA表達(dá)上調(diào)，并且其分泌量顯著增加(P<0.05)；LL-37刺激組與Mtb組相比較，各時(shí)間段外源性LL-37降低促炎因子IL-12p40、TNF-α mRNA的表達(dá)，IL-12p40、TNF-α分泌下降(P<0.05)；而IL-4、IL-10 mRNA的表達(dá)升高，抗炎因子IL-4、IL-10分泌增加(P<0.05)。結(jié)論：外源性LL-37可抑制Mtb感染的巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子分泌，其效應(yīng)與LL-37的濃度、感染Mtb的時(shí)間相關(guān)。本研究為結(jié)核病的治療提供了新的見解。

LL-37；結(jié)核分枝桿菌；細(xì)胞因子

結(jié)核病(Tuberculosis)是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的慢性傳染性疾病，也是單一感染導(dǎo)致死亡率僅次于艾滋病的世界性傳染病。2013年WHO數(shù)據(jù)顯示，有 900萬新發(fā)病例，有 150萬死于結(jié)核[1]。我國是僅次于印度的第二大高結(jié)核病負(fù)擔(dān)國，據(jù)估計(jì)僅肺結(jié)核就使國民生產(chǎn)總值每年直接損失90億元以上，結(jié)核病仍然是影響國民健康、制約經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大傳染病。近年來由于多重耐藥結(jié)核(MDR)和廣泛耐藥結(jié)核(XDB)[2]、艾滋病患者的增多，結(jié)核病的治療面臨著巨大挑戰(zhàn)。

人抗菌肽(The human cathelicidin microbial peptide，CAMP)在人的細(xì)胞核糖體合成，為12～60個(gè)氨基酸組成的小分子堿性多肽，具有較強(qiáng)的陽離子特征和兩親性結(jié)構(gòu)。唯一明確的人類抗菌肽被稱為人類陽離子抗微生物蛋白(hCAP-18),LL-37是作為有活性的C-末端肽從hCAP-18裂解所得的[3]，具有廣泛的免疫活性，發(fā)揮既促炎又抗炎的效應(yīng)[4]。研究證明，在生理水平1,25(OH)2D3的情況下，感染Mtb的Mφ內(nèi)產(chǎn)生人抗菌肽顯著增多，并誘發(fā)巨噬細(xì)胞自噬[5]。內(nèi)源性人抗菌肽調(diào)節(jié)Mφ內(nèi)IL-12p40、TNF-α等細(xì)胞因子的產(chǎn)生[6]。目前，國內(nèi)外對(duì)于外源性LL-37在結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞中抗炎作用研究較少，因此本實(shí)驗(yàn)探究外源性LL-37在結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系和菌株 人單核巨噬細(xì)胞系THP-1細(xì)胞系購自第三軍醫(yī)大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室。Mtb標(biāo)準(zhǔn)人型毒力株H37Rv(ATCC93009)由重慶市肺科醫(yī)院惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 LL-37購自上海吉爾生化公司；豆蔻酰佛波醇酯(PMA)購自Santa Cruz 公司；Trizol RNA提取試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR等PCR試劑購自TaKaRa公司；PCR引物由Invitrogen公司合成；ELISA試劑盒購自北京四正柏公司；RPMI1640、胎牛血清購自Gibco BRL公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的培養(yǎng) 在生物安全柜中，按照法國梅里埃公司米氏M7H9液體培養(yǎng)基說明，將H37Rv(ATCC93009)菌株接種于M7H9液體培養(yǎng)基中，接種后的培養(yǎng)瓶置于法國梅里埃公司BacT/ALERT MP處理系統(tǒng)進(jìn)行快速液體培養(yǎng)，取21 d培養(yǎng)物以吐溫80/PBS液稀釋成菌液，用生物梅里埃細(xì)菌濃度比濁儀測(cè)定其濁度，配制成2×108ml-1的菌懸液，備用。

1.2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)、誘導(dǎo)及分化 人單核巨噬細(xì)胞系 THP-1細(xì)胞在含10%胎牛血清、100 U/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長期的THP-1接種于6孔板中，用不含抗生素的10%RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞生長至濃度為2×106ml-1時(shí)，分別加入100 ng/ml PMA孵育24 h，誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化使之具有吞噬能力。

1.2.3 細(xì)胞的分組、感染 在生物安全柜中，將上述6孔板中已分化的THP-1細(xì)胞隨機(jī)分為5組，向各組加入濃度為2×107ml-1的Mtb懸液，感染2 h后，未被吞噬的Mtb用PBS洗滌3次除去，添加不含抗生素的10%RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以此時(shí)間點(diǎn)計(jì)時(shí)感染6、12、24、48 h后收集上清液和細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)的IL-12p40、TNF-α、IL-4、IL-10 mRNA表達(dá) 提取RNA,將1×107ml-1細(xì)胞加入Trizol 裂解細(xì)胞，移液槍反復(fù)吹打，室溫靜置5 min,然后加入200 μl氯仿，混勻，快速震蕩30 s,4℃12 000 r/min 離心15 min；將上清液移至 1.5 ml離心管中，加入500 μl預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置 15 min后 12 000 r/min 4℃ 離心 10 min,棄去上清，在離心管中加入預(yù)冷的75%的乙醇 1 ml，震蕩片刻，12 000 r/min 4℃離心5 min,棄上清，室溫靜置干燥2～5 min,去RNase水溶解沉淀。用紫外光分光光度計(jì)測(cè)總RNA含量和純度，以1 μg總RNA為模板，用Oligo為引物，按照說明書介紹的方法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。IL-12p40、TNF-α、IL-4、IL-10、β-Actin 引物由Invitrogen合成(表1)。將制取的cDNA照條件擴(kuò)增：SYBR 12.5 μl、Forward Primer (10 μmol/L) 1 μl、Reverse Primer (10 μmol/L) 1 μl、模板DNA 2 μl、無核酸酶水調(diào)整總量至25 μl。然后設(shè)置96℃預(yù)變性3 min、96℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s、35個(gè)循環(huán)。RT-PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法(Ct為熒光達(dá)到閾值時(shí)所需要PCR的循環(huán)數(shù))分析樣本IL-12p40、TNF-α、IL-4、IL-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR引物

Tab.1 Primer sequences of assayed genes

GeneSequencesLengthIL?12p40Forward5′?GACATTCTGCGTTCAGGTCCAG?3′98bpReverse5′?CATTTTTGCGGCAGATGACCGTG?3TNF?αForward5′?CTCTTCTGCCTGCTGCACTTTG?3′135bpReverse5′?ATGGGCTACAGGCTTGTCACTC?3′IL?4Forward5′?AGGTGTCGATTTGCAGTGAC?3′145bpReverse5′?ACTAGGCCTCACCTGATACG?3′IL?10Forward5′?TGCCTTCAGCAGAGTGAAGA?3′169bpReverse5′?GTCTTGGTTCTCAGCTTGGG?3′β?ActinForward5′?CACCATTGGCAATGAGCGGTTC?3′135bpReverse5′?AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT?3′

1.2.5 ELISA檢測(cè)IL-12p40、TNF-α、IL-4、IL-10 按照試劑盒說明加樣，置于37℃溫育60 min，加入稀釋30倍的洗滌液洗板5次，加顯色劑，37℃避光顯色5～15 min 后加入終止液，終止反應(yīng)。450 nm 波長檢測(cè)吸光度(OD)值并測(cè)各細(xì)胞因子濃度。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)IL-12p40、TNF-α、IL-4、IL-10 mRNA水平

2.1.1 各組不同時(shí)段IL-12p40 mRNA水平 各時(shí)間段Mtb感染組與正常對(duì)照組相比較，Mtb感染組IL-12p40 mRNA表達(dá)增加。在相同作用時(shí)間下,LL-37刺激組與未刺激比較，IL-12p40 mRNA的表達(dá)與LL-37的濃度和LL-37作用于巨噬細(xì)胞的時(shí)間有關(guān)。在相同作用時(shí)間下，濃度越大，抑制作用越明顯(P<0.05)。見圖1。

2.1.2 各組不同時(shí)段TNF-α mRNA水平 各時(shí)間段Mtb感染組與正常對(duì)照組相比較，Mtb感染組TNF-α mRNA表達(dá)增加。在相同作用時(shí)間下,LL-37刺激組與未刺激組比較，TNF-α mRNA的表達(dá)與LL-37的濃度和LL-37作用于巨噬細(xì)胞的時(shí)間有關(guān)。在相同作用時(shí)間下，濃度越大，抑制作用越明顯(P<0.05)。見圖2。

2.1.3 各組不同時(shí)段 IL-4 mRNA水平 各時(shí)間段Mtb感染組與正常對(duì)照組相比較，Mtb感染組 IL-4 mRNA表達(dá)增加。在相同作用時(shí)間下,LL-37刺激組與未刺激組比較，IL-4 mRNA的表達(dá)與LL-37的濃度和LL-37作用于巨噬細(xì)胞的時(shí)間有關(guān)。在相同作用時(shí)間下，濃度越小，IL-4 mRNA表達(dá)水平越高(P<0.05)。見圖3。

圖1 各組不同時(shí)段IL-12p40 mRNA水平Fig.1 mRNA of IL-12p40 in various groups at 6 h,12 h,24 h and 48 hNote: *.P<0.05 Mtb group vs control group；# .P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 5 μg/ml group；**.P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 10 μg/ml group；△.P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 20 μg/ml group .n=3 .

圖2 各組不同時(shí)段TNF-α mRNA水平Fig.2 mRNA of TNF-α in various groups at 6 h,12 h,24 h and 48 hNote: * .P<0.05 Mtb group vs control group；# .P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 5 μg/ml group；**.P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 10 μg/ml group；△.P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 20 μg/ml group .n=3 .

圖3 各組不同時(shí)間段IL-4 mRNA水平Fig.3 mRNA of IL-4 in various groups at 6 h,12 h,24 h and 48 hNote: * .P<0.05 Mtb group vs control group；# .P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 5 μg/ml group；**.P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 10 μg/ml group；△.P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 20 μg/ml group.n=3 .

2.1.4 各組不同時(shí)段IL-10 mRNA水平 各時(shí)間段Mtb感染組與正常對(duì)照組相比較，Mtb感染組IL-10 mRNA表達(dá)增加。在相同作用時(shí)間下,LL-37刺激組與未刺激組比較，IL-10 mRNA的表達(dá)與LL-37的濃度和LL-37作用于巨噬細(xì)胞的時(shí)間有關(guān)。在相同作用時(shí)間下，濃度越小，IL-10 mRNA表達(dá)水平越高(P<0.05)。見圖4。

2.2 ELISA檢測(cè)IL-12p40、TNF-α、IL-4、IL-10的分泌

2.2.1 各組不同時(shí)段IL-12p40分泌 各時(shí)間段Mtb感染組與正常對(duì)照組相比較，Mtb感染組IL-12p40分泌增加。在相同作用時(shí)間下,LL-37刺激組與未刺激組比較，IL-12p40分泌與LL-37的濃度和LL-37作用于巨噬細(xì)胞的時(shí)間有關(guān)。在相同作用時(shí)間下，濃度越大，IL-12p40分泌越少(P<0.05)。見表2。

2.2.2 各組不同時(shí)段TNF-α分泌 各時(shí)間段Mtb感染組與正常對(duì)照組相比較，Mtb感染組TNF-α分泌增加。在相同作用時(shí)間下,LL-37刺激組與未刺激組比較，TNF-α分泌與LL-37的濃度和LL-37作用于巨噬細(xì)胞的時(shí)間有關(guān)。在相同作用時(shí)間下，濃度越大，TNF-α分泌越少(P<0.05)。見表3。

2.2.3 各組不同時(shí)段IL-4分泌 各時(shí)間段Mtb感染組與正常對(duì)照組相比較，Mtb感染組IL-4分泌增加。在相同作用時(shí)間下,LL-37刺激組與未刺激組比較，IL-4分泌與LL-37的濃度和LL-37作用于巨噬細(xì)胞的時(shí)間有關(guān)。在相同作用時(shí)間下，濃度越小，IL-4分泌越多(P<0.05)。見表4。

2.2.4 各組不同時(shí)段IL-10分泌 各時(shí)間段Mtb感染組與正常對(duì)照組相比較,Mtb感染組IL-10分泌增加。在相同作用時(shí)間下,LL-37刺激組與未刺激組比較，IL-10分泌與LL-37的濃度和LL-37作用于巨噬細(xì)胞的時(shí)間有關(guān)。在相同作用時(shí)間下，濃度越小，IL-10分泌越多(P<0.05)。見表5。

圖4 各組不同時(shí)段IL-10 mRNA水平Fig.4 mRNA of IL-10 in various groups at 6 h,12 h,24 h and 48 hNote: *.P<0.05 Mtb group vs control group；# .P<0.05 Mtb group vs Mtb+5 μg/ml LL-37 group；**.P<0.05 Mtb group vs Mtb+10 μg/ml LL-37 group；△.P<0.05 Mtb group vs Mtb+20 μg/ml LL-37 group.n=3.

Groups0h6h12h24h48hControlgroup10158±106511138±128711153±126911136±123611145±1248Mtbgroup10208±105521362±21791)67984±70231)126354±126561)101338±108851)Mtb+LL?375μg/mlgroup10176±108817933±27832)50554±52652)100605±100752)91843±93782)Mtb+LL?3710μg/mlgroup10168±104514093±15943)40098±41143)85129±90193)65836±66063)Mtb+LL?3720μg/mlgroup10136±103712196±12284)29825±29794)70588±71344)52050±53814)

Note：1)P<0.05 Mtb group vs control group；2)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 5 μg/ml group；3)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 10 μg/ml group；4)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 20 μg/ml group.n=3 .

Groups0h6h12h24h48hControlgroup6676±6706687±6706650±6686707±6736788±682Mtbgroup6696±67110341±11521)176162±180051)119590±120661)161240±162241)Mtb+LL?375μg/mlgroup6796±6698139±8202)155978±170522)108105±108482)138969±140792)Mtb+LL?3710μg/mlgroup6796±6737062±7173)135450±155503)96967±97333)108979±110773)Mtb+LL?3720μg/mlgroup6796±6715068±5084)113825±114564)76738±87044)90064±900824)

Note：1)P<0.05 Mtb group vs control group；2)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 5 μg/ml group；3)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 10 μg/ml group；4)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 20 μg/ml group.n=3 .

Groups0h6h12h24h48hControlgroup9662±9609663±9679694±9729696±9799656±1763Mtbgroup9663±963 38827±38851) 47867±48021) 60568±61391) 40807±40901)Mtb+LL?375μg/mlgroup9668±957 45366±45452) 92367±93052) 150768±152642) 73637±74632)Mtb+LL?3710μg/mlgroup9657±967 43168±44103) 52935±53283) 69819±70033) 47473±47523)Mtb+LL?3720μg/mlgroup9661±966 30346±30374) 40852±40824) 53855±54084) 32829±33054)

Note：1)P<0.05 Mtb group vs control group；2)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 5 μg/ml group；3)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 10 μg/ml group；4)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 20 μg/ml group.n=3 .

Groups0h6h12h24h48hControlgroup11637±116011847±119111798±119111785±118811757±1179Mtbgroup11707±114015941±16051)19371±21321)32052±32051)21885±22091)Mtb+LL?375μg/mlgroup11647±115218429±18502)24529±25122)37851±38232)27059±27872)Mtb+LL?3710μg/mlgroup11628±117117050±17363)23089±23443)35064±35243)26210±26313)Mtb+LL?3720μg/mlgroup11827±114016394±16484)22817±22384)33516±33094)24071±24354)

Note：1)P<0.05 Mtb group vs control group；2)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 5 μg/ml group；3)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 10 μg/ml group；4)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 20 μg/ml group.n=3 .

3 討論

我國是世界三大結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，結(jié)核病是影響我國國民健康和制約我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大傳染病。機(jī)體抗結(jié)核主要通過細(xì)胞免疫，巨噬細(xì)胞是人體抗結(jié)核的第一道防線，主要通過產(chǎn)生和分泌細(xì)胞因子參與機(jī)體抗結(jié)核反應(yīng)。LL-37是從人類陽離子抗微生物蛋白裂解所得、有活性的C-末端肽，由37個(gè)氨基酸組成,呈螺旋狀的,包含親水和疏水部分；LL-37表達(dá)于胃腸道、呼吸道上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞及B細(xì)胞。LL-37主要是中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生，生理情況下，機(jī)體可分泌2～5 μg的LL-37，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥和病原體入侵時(shí)，LL-37的分泌量增加[7]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，LL-37是具有多種活性作用且唯一存在于人體內(nèi)的防御素，其活性包括調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),趨化免疫細(xì)胞至損傷或感染部位，結(jié)合并中和LPS，促進(jìn)再上皮化及損傷修復(fù)等。

人抗菌肽主要通過細(xì)胞膜形成通道而破壞細(xì)胞膜，從而殺傷病原微生物?？咕闹饕ㄟ^其直接的抗菌活性參與清除機(jī)體的結(jié)核分枝桿菌。研究表明，肺泡巨噬細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞在結(jié)核感染時(shí)通過產(chǎn)生抗菌肽而清除結(jié)核分枝桿菌[8-10]。IL-12p40是活化的單核/巨噬細(xì)胞合成的細(xì)胞因子，其功能是促進(jìn)T細(xì)胞分化，增加Th1應(yīng)答，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫。Emi等[6]的研究結(jié)果表明，內(nèi)源性的LL-37抑制IL-12p40的生成。TNF-α是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，對(duì)白細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及結(jié)締組織中的細(xì)胞因子具有免疫調(diào)節(jié)作用。TNF-α 不僅能夠刺激細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素和蛋白酶，還可增強(qiáng)血管通透性，具有促炎作用[11]。有研究表明，內(nèi)源性的LL-37可以減少LPS和LTA刺激的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α[12，13]，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中使用外源性LL-37同樣可抑制IL-12p40及TNF-α的生成。

為探討抗菌肽在結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞中免疫抑制功能，我們檢測(cè)了抗炎因子IL-4和IL-10 mRNA的水平和分泌。IL-4和IL-10是Th2細(xì)胞分泌的抗炎因子，參與機(jī)體的抗結(jié)核反應(yīng)。研究表明，正常人可以分泌一定量的LL-37，當(dāng)機(jī)體分泌抗菌肽不足時(shí)，結(jié)核的易感性增加[10,12]，在活動(dòng)性結(jié)核患者體內(nèi)IL-4和IL-10均升高[14]。我們的實(shí)驗(yàn)表明，5 μg/ml和10 μg/ml的LL-37增加IL-4 mRNA水平，IL-4的分泌量增加，而20 μg/ml的LL-37抑制了IL-4 mRNA水平，IL-4的分泌量減少，這提示外源性LL-37對(duì)IL-4的生物學(xué)作用與LL-37的濃度相關(guān)；同時(shí)另一抗炎因子IL-10 mRNA水平， IL-10的分泌量在外源性LL-37的作用下，其表達(dá)和分泌是升高的。LL-37對(duì)抗炎因子IL-4和IL-10 mRNA水平和分泌的影響，提示LL-37增加抗炎因子的生成。綜上，LL-37具有免疫調(diào)節(jié)功能，既可以通過抑制促炎因子的生成避免過度的炎癥反應(yīng)，又可以增加抗炎因子的生成避免過度的炎癥反應(yīng)，從而使機(jī)體在結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)維持動(dòng)態(tài)平衡。

既往研究表明內(nèi)源性LL-37具有抗細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲的作用[15-19]。本研究是首次致力于外源性LL-37在結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。LL-37對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌影響為我們臨床治療結(jié)核提供了新的視野和見解，然而，LL-37在結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞中炎癥因子分泌的機(jī)制不清，有待進(jìn)一步研究。

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[收稿2016-06-03 修回2016-09-05]

(編輯 張曉舟)

LL-37 inhibited secretion of inflammatory cytokines in mycobacterium tuber-culosis infected macrophages

DENGYan，DUXian-Zhi.

DepartmentofRespiratoryMedicine,theSecondAffiliatedHospitalChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China

Objective:To research the anti-inflammatory effect of LL-37 in mycobacterium tuberculosis (Mtb) infected-macrophages,as well as its influence on the secretion of inflammatory cytokines.Methods:(1) THP-1 cells were cultured and incubated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to transform into an adherent macrophage-like state (macrophage,Mφ).Then the THP-1 cell derived macrophages were infected with mycobacterium tuberculosis,and then stimulated with different concentrations of LL-37.(2)The experiment was divided into following groups： ① Control group:THP-1+normal saline (NS);② Mtb group:THP-1+Mtb;③Mtb+LL-37 5 μg/ml group:THP-1+Mtb+5 μg/ml LL-37;④Mtb+LL-37 10 μg/ml group:THP-1+Mtb+10 μg/ml LL-37;⑤Mtb+LL-37 20 μg/ml group:THP-1+Mtb+20 μg/ml LL-37.(3)The mRNA expression levels of IL-12p40,TNF-α,IL-4,and IL-10 will be determined by Real-time PCR respectively at 6,12,24 and 48 hours.The secreted levels of IL-12p40,TNF-α,IL-4,and IL-10 will be determined by ELISA analysis respectively at 6,12,24 and 48 hours.Results:The mRNA expression levels and secreted levels of IL-12p40,TNF-α,IL-4 and IL-10 were increased in Mtb group than those in control group.The mRNA expression levels and secreted levels of pro-inflammatory cytokines IL-12p40 and TNF-α were decreased in the LL-37 groups than those in Mtb group.However,anti-inflammatory cytokines IL-4 and IL-10 mRNA expression levels and secreted levels were increased in the LL-37 groups than those in Mtb group.Conclusion: Exogenous LL-37 inhibited the secretion of inflammatory cytokines in macrophages during mycobacterium tuberculosis infection.The effect is related to the concentrations of LL-37 and the stimulated time of macrophages which were infected with mycobacterium tuberculosis.The results will provide new insights into the treatment of Mtb infection.

LL-37;Mycobacterium tuberculosis(Mtb);Cytokines

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.006

鄧 燕(1989年-)，女，碩士，主要從事肺部感染性疾病與免疫的研究。

及指導(dǎo)教師：杜先智(1964年-)男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事肺部感染性疾病與免疫的研究，E-mail:dxzdjy868@sina.com。

R392.12

A

1000-484X(2017)02-0190-06

①本文為重慶市衛(wèi)計(jì)委重點(diǎn)項(xiàng)目(No.2015ZDXM013)。