混合皮膚移植中自體角朊細胞表達B7-H1誘導免疫抑制的相關研究①

蔡偉棟 柏 瑩 祝先進 鄭培烝 曹穎平 周光炎

(福建醫(yī)科大學附屬協和醫(yī)院檢驗科,福州350001)

混合皮膚移植中自體角朊細胞表達B7-H1誘導免疫抑制的相關研究①

蔡偉棟 柏 瑩 祝先進 鄭培烝 曹穎平 周光炎②

(福建醫(yī)科大學附屬協和醫(yī)院檢驗科,福州350001)

目的：探討自體角朊細胞表達的B7-H1分子在混合皮膚移植中的作用和相關機制。方法：體外模擬混合皮膚移植模擬系統(tǒng)(MELC體系)，通過流式細胞術檢測角朊細胞B7-H1和淋巴細胞PD-1的表達。同時，實時熒光定量PCR檢測淋巴細胞IL-10、Foxp3、GATA-3 mRNA的表達。結果：流式細胞儀檢測結果顯示，在有自體角朊細胞參與的MELC體系中，隨著作用時間增加，角朊細胞上B7-H1的表達和淋巴細胞上PD-1的表達水平均明顯升高，且具有時間依賴性(P<0.01)；實時熒光定量PCR檢測結果顯示，隨著作用時間增加，與無自體角朊細胞參與的MELC體系相比，在自體角朊細胞參與的MELC體系中，淋巴細胞IL-10、GATA-3、Foxp3 mRNA的表達水平均明顯升高，且具有時間依賴性(P<0.01)。結論：在體外混合皮膚移植模擬系統(tǒng)中，自體角朊細胞通過表達共刺激分子B7-H1，上調淋巴細胞表面PD-1的表達，二者相結合，誘導Th2細胞和Foxp3+的Treg細胞分化，從而負向調節(jié)免疫反應。

角朊細胞； B7-H1；混合皮膚移植；免疫抑制

在上世紀七十年代初，我國外科醫(yī)生創(chuàng)新性地運用自體皮與異體皮鑲嵌的混合皮膚移植技術，抑制了免疫排斥反應，大幅度提高了燒傷治愈率[1,2]，但其免疫機制目前尚未明確。大量研究證實，構成皮膚主要細胞的角朊細胞在皮膚移植排斥反應中扮演重要的角色[1]。角朊細胞屬于兼職抗原提呈細胞(APC)，與通常意義上的APC不同，其并不表達B7-1/B7-2，而是表達B7-H1。B7-H1是新近發(fā)現的一個B7分子，其受體不是CD28和CTLA-4而是PD-1，B7-H1與PD-1結合具有下調免疫應答的活性[3,4]。有學者研究發(fā)現，自體角朊細胞的免疫抑制作用確實與B7-H1 及其受體PD-1 有關，但其具體機制還有待進一步的研究。因此，在本實驗中我們首先建立體外模擬混合皮膚移植模擬系統(tǒng)(MELC體系)，然后通過流式細胞術檢測在有無自體角朊細胞的MELC體系中角朊細胞B7-H1和淋巴細胞PD-1的表達，用實時熒光定量PCR檢測有無自體角朊細胞的MELC體系中淋巴細胞IL-10、Foxp3、GATA-3 mRNA的表達，從而探討B(tài)7-H1分子在自體角朊細胞誘導的混合皮膚移植免疫抑制中的作用和相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源 取新生KM乳鼠按照文獻[5]的方法分離皮塊中的角朊細胞和表皮細胞；分離脾臟中的淋巴細胞。

1.1.2 試劑與儀器 小鼠B7-H1、PD-1流式檢測抗體(Biolegend公司)，離心柱型總RNA提取試劑盒(Qiangen公司),逆轉錄試劑盒(Promaga公司)，實時熒光定量檢測試劑盒(TaKaRa公司),FACScan 流式細胞儀(美國BD公司)，Lightcycle480熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和實驗分組 將角朊細胞接種于完全K-SFM培養(yǎng)基中，置37℃ 5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。表皮細胞和淋巴細胞分別接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基中，置37℃ 5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，以備用。實驗時調整角朊細胞的細胞濃度至1×106ml-1，表皮細胞至2×106ml-1，淋巴細胞至1×106ml-1，按如下比例進行混合培養(yǎng)(表1所示)，建立實驗組和對照組。

1.2.2 流式細胞儀檢測淋巴細胞表面PD-1和角朊細胞表面B7-H1的表達 收集各組待測細胞,用PBS洗滌2次，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，用PBS 控制細胞懸液總體積為100 μl。向待測組中加入20 μl PE Anti-mouse PD-1或PE Anti-mouseCD274(B7-H1)，加入同體積同型對照抗體作為陰性對照管，混勻后置于4℃孵育30 min，用PBS洗2遍，再加入500 μl PBS 重懸細胞。上流式細胞儀分別對懸浮細胞的PD-1和貼壁細胞的B7-H1進行檢測。

1.2.3 RT-PCR檢測IL-10、Foxp3、GATA-3 mRNA的

表達 收集混合培養(yǎng)后12、24、36 h不同時間段的懸浮淋巴細胞，用離心柱法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA,用于定量PCR檢測目的基因的表達，并以β-actin作為內參對照。各基因引物序列由Primer express 2.0軟件設計，委托TaKaRa公司合成(引物序列詳見表2)。定量PCR體系總體積為20 μl，包括SYBE GREEN熒光Mix 10 μl,cDNA 2 μl，上、下游引物各0.5 μl，ddH2O 7 μl。每組設3個復孔，在Lightcycle480熒光定量PCR儀上擴增：95℃ 2 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s，68℃ 30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算IL-10、Foxp3、GATA-3的相對表達量。

2 結果

2.1 在MELC體系中，有自體角朊細胞參與的實驗組MELC中，角朊細胞B7-H1表達增高 在MELC體系中混合培養(yǎng)12、24、36 h后，通過流式細胞技術檢測角朊細胞B7-H1表達，結果如表3、圖1所示：在有自體角朊細胞參與的實驗組中，角朊細胞B7-H1的表達呈遞增趨勢，且具有時間依賴性(F=220，P<0.01)；而在無自體角朊細胞參與的MELC體系中(對照組1和對照組2)角朊細胞B7-H1的表達無增高趨勢(F值分別為1.25和3.55，P>0.05)。

2.2 在MELC體系中，有自體角朊細胞參與的實驗組MELC中，淋巴細胞PD-1表達增高 在MELC體系中混合培養(yǎng)12、24、36 h后，通過流式細胞技術檢測淋巴細胞PD-1的表達，結果如表4、圖2所示：在有自體角朊細胞參與的實驗組MELC 體系中，淋巴細胞PD-1的表達呈遞增趨勢，且具有時間依賴性(F=464，P<0.01)；而無自體角朊細胞參與的MELC體系中(對照組1、對照組2和對照組3)淋巴細胞PD-1的表達無明顯增高(F值分別為0.898、2.540、0.695,P>0.05)。

表1 混合皮膚移植細胞模型

Tab.1 Intermingled skin grafting model(MELC)

ItemExperiencegroupControlgroup123ComponentLa∶Eb∶KaLa∶Eb∶KbLa∶KaLaProportion1∶1∶051∶1∶051∶051

Note：La.auto-lymphocytes;Ka.auto-keratinocytes;Kb.allo-keratino-cytes;Eb.allo-epidermal cell.

表2 實時定量PCR引物序列

Tab.2 Real-time quantitative PCR primer sequence

NameForwardprimerReverseprimerβ?actin5′?CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC?3′5′?ATGGAGCCACCGATCCACA?3′IL?105′?ACCTGCTCCACTGCCTTGCT?3′5′?GGTTGCCAAGCCTTATCGGA?3′Foxp35′?ACAACCTGAGCCTGCACAAGT?3′5′?GCCCACCTTTTCTTGGTTTTG?3′GATA?35′?ACCGGGTTCGGATGTAAGTC?3′5′?GTTCACACACTCCCTGCCTTCT?3′

2.3 在MELC體系中，有自體角朊細胞參與的實驗組MELC中，淋巴細胞IL-10及GATA-3mRNA表達增高 如表5所示，在MELC 體系中混合培養(yǎng)12、24、36 h后，有自體角朊細胞參與的MELC體系與無自體角朊細胞參與的MELC體系相比，IL-10及GATA-3 mRNA的相對表達水平均明顯升高，且具有時間依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.4 在MELC體系中，有自體角朊細胞參與MELC體系中淋巴細胞Foxp3 mRNA表達增高 如表6所示，混合培養(yǎng)12、24、36 h后，有自體角朊細胞參與的MELC體系與無自體角朊細胞參與的MELC體系相比，Foxp3 mRNA的相對表達水平明顯升高，且具有時間依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表3 MELC體系中B7-H1的表達水平

Tab.3 Expressions of B7-H1 in MELC

TimeExperiencegroup(La+Eb+Ka)Controlgroup1(La+Eb+Kb)Controlgroup2(La+Ka)12h(2500±153)%(309±123)%(210±075)%24h(3950±182)%(439±161)%(473±166)%36h(5600±217)%(494±155)%(463±152)%F/Pvalue220/0001)

Note：1)Compare among 12，24，36 h experience group,F=220,P<0.01.

圖1 MELC體系中B7-H1表達水平的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of proportion of B7-H1 in MELC

圖2 MELC體系中PD-1表達水平的動態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of proportion of PD-1 in MELC

表4 MELC體系中PD-1的表達水平

Tab.4 Expressions of PD-1 in MELC

TimeExperiencegroupLa+Eb+KaControlgroup1La+Eb+KbControlgroup2La+KaControlgroup3La12h(515±106)%(225±104)%(328±093)%(389±127)%24h(2700±203)%(343±126)%(474±085)%(424±133)%36h(4770±188)%(248±112)%(317±102)%(314±084)%F/Pvalue464/0001)

Note：1) Compare among 12，24，36 h experience group,F=220,P<0.01.

TimeIL?10ABCGATA?3ABC12h087±007090±003085±035627±017655±003733±00224h1250±1441620±0042490±046718±013991±009794±00436h6020±0047560±0416050±0071050±0021060±003870±008F/Pvalue4269/0001)82160/0001)23932/0001)9657/0001)4239/0001)5048/0001)

Note：A.Expreience group compared with control group1;B.Experience group comared with control group 2;C.Experience groupcompared with control group 3.1)Compared among 12,24,36 h group,P<0.01.Experience group.La+Eb+Ka;Control group 1.La+Eb+Kb;Control group 2.La+Ka;Control group 3.La.

TimeABC12h1390±0062280±0773260±07724h1840±0513530±0208820±02336h11000±0319610±1908990±010F/Pvalue74099/0001)3264/0001)14618/0001)

Note：A.Experience group compared with control group 1;B.Experience group compared with control group 2;C.Experience group compared with control group 3.1)Compared among 12,24,36 h group,P<0.01.Experience group.La+Eb+Ka;Control group 1.La+Eb+Kb;Control group 2.La+Ka;Control group 3.La.

3 討論

我國外科醫(yī)生創(chuàng)造的混合皮膚移植(即在給受者移植入異體皮的同時嵌入受者的自體皮片)可以大大降低移植排斥反應。本課題組前期研究發(fā)現，在MELC體系中，自體角朊細胞可以誘導性表達B7-H1，且自體角朊細胞對混合皮膚移植排斥反應的抑制功能可以被抗B7-H1單抗完全遏止[5]。這一結果提示，B7-H1分子參與了自體角朊細胞對混合皮膚移植排斥反應的抑制過程。在本實驗中，發(fā)現有自體角朊細胞參與的混合培養(yǎng)體系中，自體角朊細胞B7-H1呈高表達趨勢，而未有自體角朊細胞參與的各對照組，角朊細胞B7-H1極低表達。這些實驗結果進一步顯示混合皮膚移植的免疫抑制作用與自體角朊細胞表達B7-H1分子有關。至于引起自體角朊細胞B7-H1表達升高的原因，目前尚不清楚。Ritprajak等[6]研究發(fā)現體外用IFN-γ刺激角朊細胞，其B7-H1表達上升，并抑制了浸潤皮膚處T細胞的增殖反應。而在我們前期的研究中也證實IFN-γ確實可以刺激細胞表達B7-H1[7,8]。因而自體角朊細胞B7-H1表達升高可能與炎癥因子的刺激有關：在生理狀態(tài)下，角朊細胞不表達B7-H1，當皮膚組織受到外來刺激，局部分泌炎癥因子IFN-γ，誘導其角朊細胞B7-H1的表達，從而反饋調節(jié)局部組織炎癥反應強度。

那么，B7-H1分子是如何參與自體角朊細胞抑制混合皮膚移植排斥反應的？

現階段研究認為B7-H1分子的受體并不與B7-1/B7-2相同，即不能通過與CTLA-4的相互作用而產生免疫抑制。PD-1是B7-H1的主要受體，有研究發(fā)現，PD-1與誘導移植耐受有關[9]。那么，混合皮膚移植是否也是通過PD-1分子的作用大大降低移植排斥反應呢？因而在本實驗中用流式細胞術檢測淋巴細胞PD-1的表達，結果顯示在未有自體角朊細胞參與的MELC體系中，淋巴細胞PD-1呈極低表達狀態(tài)，而在有自體角朊細胞參與的MELC體系中，淋巴細胞PD-1的表達明顯增高，且隨著作用時間的延長呈遞增趨勢。有國外學者研究發(fā)現，B7-H1與PD-1的結合，可抑制T細胞的活化，維持外周免疫耐受[3]。故在混合皮膚移植體系中，某種作用因素增加淋巴細胞表面PD-1的表達，上調B7-H1與PD-1的結合率，從而介導免疫抑制，最終對混合皮膚移植排斥反應產生抑制。

另外，本課題組前期研究發(fā)現，自體角朊細胞可行使非專業(yè)性抗原遞呈細胞的功能，由B7-H1提供共刺激信號，促進IL-10分泌的Th2型細胞分化，進而抑制Th1型細胞，誘導Th1型細胞向Th2型細胞極化[10,11]。GATA-3為Th2型細胞的標志性轉錄因子[12]。我們采用實時熒光定量PCR監(jiān)測GATA-3和IL-10mRNA的表達，發(fā)現在MELC體系中淋巴細胞GATA-3和IL-10mRNA均呈明顯的高表達趨勢，從另一角度驗證了先前的觀點：角朊細胞可能通過表達B7-H1誘導Th1型細胞向Th2型細胞極化，分泌Th2型細胞因子，最終對免疫反應產生抑制。

Treg細胞是一類具有負調節(jié)作用的T細胞亞群，其中Foxp3是其特異性調節(jié)因子[13,14]。近年研究發(fā)現，角朊細胞可誘導產生Treg細胞，負向調節(jié)免疫反應。那么，在MELC體系中角朊細胞是否能夠誘導產生Treg細胞，從而介導免疫抑制呢？本實驗采用實時熒光定量PCR動態(tài)檢測MELC體系中淋巴細胞Foxp3基因的表達。我們發(fā)現在有自體角朊細胞參與的MELC體系與無自體角朊細胞參與的MELC體系相比，Foxp3呈高表達趨勢。鑒于有報道認為B7-H1能夠促進Treg細胞的分化，并能維持Foxp3的表達及成熟Treg細胞的抑制功能[15,16]，故我們推測在MELC體系中淋巴細胞Foxp3基因表達增高的原因可能與自體角朊細胞表達B7-H1有關，這可能也是混合皮膚移植中自體角朊細胞誘導局部免疫耐受的機制之一。但這種Treg細胞與之前MELC體系中檢測出的可分泌IL-10的淋巴細胞是否為同一群細胞，本實驗由于細胞分離技術的限制并未探討，尚需更深入的研究。

本研究通過建立體外混合皮膚移植模擬系統(tǒng)(MELC體系)，研究發(fā)現，自體角朊細胞通過表達共刺激分子B7-H1，上調淋巴細胞表面PD-1的表達，二者相結合，誘導Th2細胞和Foxp3+的Treg細胞分化，從而負向調節(jié)免疫反應。這些研究闡明了混合皮膚移植中角朊細胞誘導局部耐受的機制，為燒傷移植的治療提供了新的實驗室監(jiān)測指標和思路。

[1] 史濟湘.自異體皮混合移植的臨床意義與排異機制[J].中華燒傷雜志,2006,22(1):76-78.

[2] Domres B,Kistler D,Rutczynska J.Intermingled skin grafting:a valid transplantion method at low cost[J].Annals Burns Fire Disa Sters,2007,20(3):149-154.

[3] Yao S,Zhu Y,Chen L.Advances in targeting cell surface signalling molecules for immune modulation[J].Nat Rev Drug Discov,2013,12(2):130-146.

[4] Sui X,Ma J,Han W,etal.The anticancer immune response of anti-PD-1/PD-L1 and the genetic determinants of response to anti-PD-1/PD-L1 antibodies in cancer patients[J].Oncotarget,2015,6(23):19393-19404.

[5] 張敬喜,曹穎平,王梅華,等.B7-H1分子在混合皮膚移植中自體角朊細胞誘導的抑制作用[J].福建醫(yī)科大學學報,2006,40(2):105-107.

[6] Ritprajak P,hashiguchi M,Tsushima F.Keratinocyte-associated B7-H1 directly regulats cutaneous effector CD8+T cell responses[J].J Immunol,2010,184(9):4918-4925.

[7] Kryczek I, Wei S, Gong W.Cutting edge:IFN-{gamma} enables APC to promote memory Th17 and abate Th1 cell development[J].Immunology,2008,181:5842-5846.

[8] Yamamoto R,Nishikori M,Tashima M.B7-H1 expression is regulated by MEK/ERK signaling pathway in anaplastic large cell lymphoma and Hodgkin lymphoma[J].Cancer Sci,2009,100(11):2093-2100.

[9] 郭國寧,謝諄怡,陳永文.共抑制分子PD-1的研究進展[J].免疫學雜志, 2010, 26(7):639-642.

[10] 曹穎平,陳衛(wèi)閩,羅心綺,等.混合皮膚移植中IL-10在自體角朊細胞誘導局部免疫耐受中的作用[J].中國免疫學雜志,2005,21(3):184-189.

[11] Cao Y,Zhou H,Tao J.Keratinocytes induce local tolerance to skingraft by activating IL-10-secreting T cells in the context of costimulation molecule B7-H1 [J].Transplantation,2003,75(8):1390.

[12] Yagi R,Zhu J,Paul W.An updated view on transcription factor GATA3-mediated regulation of Th1 and Th2 cell differentiation[J].Int Immunol,2011,23(7):415-420.

[13] Ohkuran N,Kitagawa Y,Sakaguchi S.Development and maintenance of regulatory T cells[J].Immunity,2013,38(3):414-423.

[14] Lan Q,Fan H,Quesniaux V.Induced Foxp3(+) regulatory T cells:a potential new weapon to treat autoimmune and inflammatory diseases?[J].Mol Cell Biol,2012,4(1):22-28.

[15] Francisco LM,Salinas VH,Brown KE,etal.PD-L1 regulates the development,maintenance,and function of induced regulatory T cells[J].J Exp Med,2009,206(13):3015-3029.

[16] Hua D,Sun J,Mao Y,etal.B7-H1 expression is associated with expansion of regulatory T cells in colorectal carcinoma[J].World J Gastroenterol,2012,18(9):971-978.

[收稿2016-04-06 修回2016-06-24]

(編輯 許四平)

Related research of immunosuppression in intermingled skin transplantation induced by B7-H1 expressed on auto-keratinocytes

CAIWei-Dong,BAIYing,ZHUXian-Jin,ZHENGPei-Zheng,CAOYing-Ping,ZHOUGuang-Yan.

DepartmentofClinicalLaboratory，FujianMedicalUniversityUnionHospital，Fuzhou350001,China

Objective:To explore the role and mechanism of the B7-H1 expressed by auto-keratinocytes in the intermingled skin grafting model in vitro(MELC).Methods: The intermingled skin grafting model(MELC) was established in vitro.Flow cytometry was performed to detect the expressions of B7-H1 in keratinocytes.The expressions of PD-1 in lymphocytes were measured at the same time.The levels of IL-10,Foxp3 and GATA-3 mRNA in lymphocytes were detected by Real-time quantitative PCR.Results: Through flow eytometry,in the MELC with auto-keratinocytes,the expression of B7-H1 in auto-keratinocytes and the PD-1 in lymphocytes were rising trend and the rising rate was in time-dependent manners(P<0.01).RT-PCR assay indicated that the relative levels of IL-10,Foxp3,GATA-3mRNA expression were significant raised and the rising rate was in time-dependent manners (P<0.01).Conclusion: In the intermingled skin grafting model,the auto-keratinocytes could express B7-H1 to enhance the expression of PD-1 in T cells.When B7-H1 combined with PD-1,the Th2 cells and Foxp3+Tregs were induced and suppressed the immune response in the intermingled skin grafting model.

Keratinocytes;B7-H1;Intermingled skin transplantation；Immunosuppression

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.003

①本文為國家自然科學基金項目(81171656)。

蔡偉棟(1990 年-)，男，在讀碩士，主要從事免疫調節(jié)和移植免疫的研究。

及指導教師：曹穎平(1970 年-)，男，博士，主任檢驗師，教授，碩士生導師，主要從事免疫調節(jié)和移植免疫的研究，E-mail:caoyingping@ailyun.com。

R392.4

A

1000-484X(2017)02-0174-05

②上海市免疫學研究所，上海200025。