嗜殺酵母的生物學(xué)特性及其應(yīng)用

王麟，譚春明,2，于剛，楊賢慶，戚勃，楊少玲，通信作者

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嗜殺酵母的生物學(xué)特性及其應(yīng)用

王麟1，譚春明1,2，于剛1，楊賢慶1，戚勃1，楊少玲1，通信作者

（1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所廣州 510300；2. 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003）

嗜殺酵母在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程當(dāng)中所產(chǎn)的嗜殺因子能夠抑制或殺死某些特定的微生物，而這種毒素對(duì)于酵母本身卻沒(méi)有嗜殺作用。將嗜殺酵母應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，可以抑制野生酵母的污染、凈化空氣、提高產(chǎn)品質(zhì)量，在發(fā)酵當(dāng)中對(duì)體系環(huán)境的凈化和生物穩(wěn)定性具有較好的效果；一些海洋嗜殺酵母因能殺滅某些海洋動(dòng)物的致病菌，而被應(yīng)用于海水養(yǎng)殖業(yè)；嗜殺酵母分泌的嗜殺因子可作為抑制某些病原酵母及類(lèi)酵母的抗真菌藥制劑；此外，嗜殺酵母在基因工程和轉(zhuǎn)基因植物當(dāng)中也有應(yīng)用，用作為研究酵母菌分子生物學(xué)的良好基因工程載體以及大量合成和分泌嗜殺因子以對(duì)抗病原真菌的侵染。本文就嗜殺酵母的種類(lèi)、生物特性及嗜殺因子作用機(jī)理進(jìn)行了綜合論述，概述了嗜殺酵母在不同領(lǐng)域的應(yīng)用，并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

嗜殺酵母；嗜殺因子；作用機(jī)理；應(yīng)用前景

嗜殺酵母在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程當(dāng)中所產(chǎn)的嗜殺毒素能夠抑制或殺死某些特定的微生物，這種嗜殺毒素對(duì)酵母本身卻沒(méi)有嗜殺作用，也就是說(shuō)具有免疫性。從已純化和表征的嗜殺毒素來(lái)看，嗜殺酵母所產(chǎn)的嗜殺毒素多為蛋白質(zhì)或糖蛋白，在生物學(xué)特性上不耐熱、對(duì)蛋白酶敏感，而且不少報(bào)道證實(shí)其嗜殺活力與NaCl有關(guān)。1963年，Bevan和Makower[1]首次在保存的釀酒酵母菌（）中發(fā)現(xiàn)酵母菌株間存在著相互殺死的現(xiàn)象，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)一種具有嗜殺活性的酵母菌，它分泌的外毒素能抑制或殺死野生酵母菌，針對(duì)嗜殺酵母的研究工作就此展開(kāi)。

嗜殺酵母分泌的嗜殺毒素稱(chēng)為嗜殺因子，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，常被用來(lái)控制動(dòng)植物、人類(lèi)病原菌以及發(fā)酵體系當(dāng)中的有害酵母。近年來(lái)，嗜殺酵母作為工業(yè)生產(chǎn)菌株而被廣泛使用，已應(yīng)用于發(fā)酵、食品、農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖、醫(yī)藥等領(lǐng)域[2]。嗜殺酵母在發(fā)酵生產(chǎn)中可以?xún)艋l(fā)酵體系和環(huán)境，提高發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量，提高生物穩(wěn)定性；在食品工業(yè)，可抑制野生酵母的污染[3]；在養(yǎng)殖業(yè)，一些海洋嗜殺酵母可以控制某些海洋酵母菌引起的海洋動(dòng)物疾病[4]；同時(shí)，嗜殺酵母分泌的嗜殺因子可作為抑制某些病原酵母及類(lèi)酵母的抗真菌藥制劑[5]。嗜殺因子通常作用于敏感微生物的DNA及細(xì)胞壁成分、質(zhì)膜、tRNA等[6]。一般情況下，嗜殺酵母的嗜殺特性是由細(xì)胞質(zhì)中的雙鏈線狀RNA決定的[7]。通過(guò)研究酵母菌的嗜殺現(xiàn)象，人們可以更深入的了解真核細(xì)胞生物學(xué)及不同真核生物的相互作用[8]。

1 嗜殺酵母的種類(lèi)和分布

1963年，Bevan等在培養(yǎng)啤酒酵母菌時(shí)從釀酒酵母（）中首次發(fā)現(xiàn)了嗜殺酵母[1]。迄今為止，嗜殺現(xiàn)象在大部分酵母屬中都存在，自然環(huán)境（如海洋、湖泊、河流、工廠、蔬菜、水果及食品等）中也有大量嗜殺酵母存在。目前已發(fā)現(xiàn)的能產(chǎn)嗜殺因子的酵母主要分布在以下幾個(gè)屬，分別為釀酒酵母屬（）[1]，隱球酵母屬（）[9]，漢遜酵母屬（）[10]，克魯維酵母屬（）[11]，畢赤酵母屬（）[12]，假絲酵母屬（）[13]，擬威爾酵母屬（）[14]，球擬酵母屬（）[15]和接合酵母屬（）[16]，還有德巴利氏酵母屬（）及短梗霉屬（）等[17]。在相關(guān)應(yīng)用中，釀酒酵母屬的菌株在酒類(lèi)和飲料的生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛也最為重要。1989年，Suzukit等[18]從各種發(fā)酵食品中分離出56株具有嗜殺活性的耐鹽酵母菌株。Hidalgo等[19]在馬德里的11個(gè)葡萄酒釀造廠分離出270個(gè)釀酒酵母菌株，其中具有嗜殺活性的占42.6 %。王貴雙等[20]從不同來(lái)源的果汁中分離的200株酵母菌中有14株具有嗜殺活性，其中有2株還表現(xiàn)出良好的蘋(píng)果汁發(fā)酵性能。Wang等[17]從不同海洋環(huán)境中分離得到17株海洋酵母能夠殺死梭子蟹致病菌。

2 嗜殺酵母的生物學(xué)特性

由于嗜殺酵母具有殺滅敏感菌株的特性，可利用加有美藍(lán)的培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行鑒別[17]。嗜殺酵母的生長(zhǎng)和繁殖受諸多因素的影響，如培養(yǎng)基組成、溫度及pH值等。其中，培養(yǎng)基的組成對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)與繁殖影響很大，只有在最適培養(yǎng)基組成和最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，才能生長(zhǎng)良好并且在最短的時(shí)間達(dá)到最大的生物量，此時(shí)產(chǎn)生的所需代謝產(chǎn)物也最多[21]。而培養(yǎng)基組成還影響酵母菌物質(zhì)代謝及代謝產(chǎn)物的活性，通常需要根據(jù)其特性選擇最適宜的培養(yǎng)基組成。

溫度對(duì)嗜殺酵母生長(zhǎng)繁殖的影響主要表現(xiàn)在酶活性、細(xì)胞膜流動(dòng)性及物質(zhì)的溶解度三方面。其一，改變溫度影響酶活性，進(jìn)而影響酶促反應(yīng)速率，致使細(xì)胞合成受阻；其二，溫度的改變導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性發(fā)生改變，而細(xì)胞膜流動(dòng)性與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌有直接的關(guān)系，一定范圍內(nèi)流動(dòng)性隨溫度的升高而變大，而利于物質(zhì)的運(yùn)輸、促進(jìn)吸收與代謝，反之，物質(zhì)運(yùn)輸受到阻礙；其三，物質(zhì)的溶解度受溫度影響，溫度高則有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶解，有益酵母生長(zhǎng)，反之亦然。

而環(huán)境pH這一重要因素對(duì)酵母菌的影響主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面[22]：其一，改變酶活性，進(jìn)而影響酶促反應(yīng)速率，還會(huì)影響物質(zhì)代謝途徑；其二，pH的變化影響細(xì)胞膜的通透性以及膜表面電荷的性質(zhì)，進(jìn)而影響細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌能力；其三，影響培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，從而影響細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，對(duì)所產(chǎn)毒素的活性及穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。從目前嗜殺酵母的研究來(lái)看，嗜殺酵母菌生長(zhǎng)繁殖的pH值范圍為3～8，其分泌的嗜殺因子的活性在偏酸性環(huán)境下較為穩(wěn)定。

嗜殺酵母分泌的嗜殺因子多為蛋白質(zhì)或糖蛋白，因此具有一個(gè)共同的特性，即在強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境、加熱、劇烈攪拌和蛋白酶存在時(shí)嗜殺因子便會(huì)失活。例如，K1型嗜殺毒素在26 ℃下激烈振蕩25 min或者加入蛋白酶反應(yīng)一段時(shí)間，便失去活性[23]。

3 嗜殺酵母的作用機(jī)理

Wickner[24]根據(jù)酵母菌間相互抑制或殺死作用以及嗜殺酵母自身的免疫作用，將嗜殺酵母分為11種類(lèi)型（K1-K11），其中K1，K2，K3主要存在于酵母屬（）中[25]。Magliani等[26]又將酵母嗜殺系統(tǒng)分為以下幾類(lèi)：釀酒酵母嗜殺系統(tǒng)、嗜殺系統(tǒng)、嗜殺系統(tǒng)、嗜殺系統(tǒng)、嗜殺系統(tǒng)及其他酵母嗜殺系統(tǒng)。

嗜殺酵母通過(guò)分泌嗜殺因子來(lái)抑制或殺死敏感菌株，進(jìn)而競(jìng)爭(zhēng)有限的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以生長(zhǎng)繁殖。這種嗜殺因子是一種蛋白質(zhì)或糖基化蛋白，具有β-1，6-D-葡聚糖酶活性而能有效作用于敏感菌的細(xì)胞壁相關(guān)位點(diǎn)，從而抑制敏感菌細(xì)胞壁β-葡聚糖的合成，從而破壞或者殺死敏感菌[27]。研究表明，敏感細(xì)胞有2個(gè)毒素結(jié)合位點(diǎn)。一是敏感菌細(xì)胞壁上的受體β-1，6-D-葡聚糖，二是細(xì)胞膜上的受體。某些種類(lèi)的嗜殺因子首先以低親和力、高速率形式與敏感菌的位點(diǎn)一相結(jié)合，在提供能量的前提下，再以高親和力、低速率形式與敏感菌的位點(diǎn)二相結(jié)合，并發(fā)生耗能反應(yīng)，最終殺死敏感菌[28]。

tRNA是嗜殺因子作用于敏感菌的另一個(gè)位點(diǎn)。Klassen的研究發(fā)現(xiàn)，tRNA是分泌的嗜殺因子的作用目標(biāo)[29]。由于嗜殺毒素使敏感菌細(xì)胞中的核酸損傷，進(jìn)而造成敏感菌死亡。也有報(bào)道證實(shí)，嗜殺毒素通過(guò)破壞敏感細(xì)胞分裂周期的G1相（DNA合成前期），受體進(jìn)入細(xì)胞后，毒素反向進(jìn)入隱秘通道（通過(guò)高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)），進(jìn)而阻礙細(xì)胞分裂，導(dǎo)致敏感細(xì)胞逐漸死亡。其毒素蛋白存在α、β、γ這3個(gè)亞基，γ亞基是破壞G1相、阻止敏感細(xì)胞分裂的主要物質(zhì)，它作用于敏感細(xì)胞的3種tRNA，從而破壞分裂周期導(dǎo)致細(xì)胞死亡；α亞基具有殼多糖酶的活性，毒素作用于敏感細(xì)胞時(shí)，能降解細(xì)胞壁上的糖類(lèi)物質(zhì)有利于嗜殺毒素的進(jìn)入，或與細(xì)胞壁上的糖類(lèi)受體如幾丁質(zhì)發(fā)生相互作用；β亞基可能同α亞基一起參與毒素與敏感細(xì)胞的結(jié)合和毒素分子的跨膜移位過(guò)程，使毒素蛋白進(jìn)入敏感細(xì)胞，然后由γ亞基發(fā)揮嗜殺作用[30]。

另外，有研究證明，嗜殺因子可能通過(guò)阻斷鈣調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂，使真菌細(xì)胞無(wú)法獲得外源性鈣的補(bǔ)充而死亡[31]。

4 嗜殺酵母的應(yīng)用

近年來(lái)，嗜殺酵母作為工業(yè)生產(chǎn)菌株而被廣泛使用于發(fā)酵、食品、農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖、醫(yī)藥等領(lǐng)域[2]。

4.1 嗜殺酵母在發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用

利用嗜殺酵母的嗜殺活性，可將其應(yīng)用于各類(lèi)發(fā)酵過(guò)程，防止野生酵母及有害雜菌對(duì)發(fā)酵體系的污染，提高發(fā)酵成品的質(zhì)量。酒類(lèi)發(fā)酵中，常因一些腐敗菌而產(chǎn)生不良風(fēng)味物質(zhì)，降低酒的品質(zhì)；或因污染了野生酵母菌將釀酒酵母殺死而導(dǎo)致發(fā)酵停滯。大量研究發(fā)現(xiàn)，葡萄酒發(fā)酵中嗜殺酵母能夠抑制或殺死腐敗菌，在不使用SO2的情況下可以抑制發(fā)酵中的有害微生物，加速果肉細(xì)胞自溶，增加風(fēng)味物質(zhì)的含量，提高產(chǎn)品質(zhì)量[32-34]。鮑曉明等[35]利用電融合技術(shù)構(gòu)建嗜殺啤酒酵母，能有效地防止野生酵母菌的污染，且能釀造出優(yōu)質(zhì)的啤酒。曾少敏等[36]利用嗜殺酵母生產(chǎn)芒果酒，研究發(fā)現(xiàn)嗜殺酵母除了可以?xún)艋l(fā)酵體系外，還可以提高原酒的酒精度，凝集性好，易于分離雜質(zhì)，穩(wěn)定酒質(zhì)。Sulo等[37]獲得的嗜殺酵母在啤酒釀造過(guò)程當(dāng)中能較好地抑制野生酵母的污染，利于啤酒的純種釀造，能有效提高成品酒生物穩(wěn)定性。曾鵬[38]從甜酒釀中分離選育的87-1嗜殺型生香酵母既具有清酒酵母的優(yōu)良特性，又能抑制野生酵母和其他雜菌的生長(zhǎng)，適用于固態(tài)和液態(tài)法工藝，所發(fā)酵的清酒品質(zhì)優(yōu)良、生物穩(wěn)定性強(qiáng)并可長(zhǎng)期保存。

嗜殺酵母和分泌的嗜殺因子能夠抑制用樹(shù)素果實(shí)發(fā)酵生產(chǎn)傳統(tǒng)飲料過(guò)程當(dāng)中的酵母菌群，并最終被嗜殺酵母取代[39]。能夠產(chǎn)生嗜殺因子抑制葡萄酒酸敗酵母的生長(zhǎng)，而釀酒酵母（）對(duì)該嗜殺因子不敏感[40]。此外，的嗜殺活性能有效對(duì)抗，防止酒香破壞而影響葡萄酒質(zhì)量[41]。

4.2 嗜殺酵母在食品領(lǐng)域的應(yīng)用

嗜殺酵母在食品行業(yè)的應(yīng)用主要表現(xiàn)在發(fā)酵食品當(dāng)中，常用來(lái)抑制野生酵母的污染，為發(fā)酵提供良好的體系環(huán)境及提高產(chǎn)品質(zhì)量[3]。另外，從水果、飲料、食品、橄欖鹵水及海洋動(dòng)物體內(nèi)等分離得到的嗜殺酵母具有廣泛的抗真菌和酵母菌作用，可用于蔬菜水果、食品及飼料的防腐[42]。和分泌的嗜殺因子可以抑制指狀青霉（）的生長(zhǎng)，從而防止水果腐爛[43]。

4.3 嗜殺酵母在農(nóng)業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)方面的應(yīng)用

在養(yǎng)殖業(yè)，一些海洋嗜殺酵母可以控制某些真菌引起的海洋動(dòng)物疾病[4]。Santos等[44]的研究發(fā)現(xiàn)，嗜殺酵母的嗜殺毒素可控制葡萄樹(shù)灰霉病。

研究發(fā)現(xiàn)，某些海洋酵母菌可以引起海洋動(dòng)物疾病，而這些酵母菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能和動(dòng)物的類(lèi)似，控制過(guò)程當(dāng)中常會(huì)出現(xiàn)一些難題，這就造成海水養(yǎng)殖業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失[45]。Wang等[17]從海洋環(huán)境中篩選出17株嗜殺酵母菌，它們?cè)诳刂扑笞有返娜榛〔≡湍傅纳L(zhǎng)上表現(xiàn)出明顯的效果。

4.4 嗜殺酵母在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

近年來(lái)真菌感染病例呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，特別是免疫缺陷的病人，因免疫力低下而極其容易被真菌感染。一些嗜殺酵母分泌的嗜殺毒素能夠選擇性的作用于真菌，引起了不少研究者的興趣而被廣泛關(guān)注。嗜殺酵母分泌的嗜殺因子能夠殺滅病原酵母及類(lèi)酵母等微生物，可作為潛在的抗真菌藥物，利用純化的嗜殺因子作為藥劑治療皮膚的真菌感染等疾病[5，46]。

4.5 嗜殺酵母在基因工程中的應(yīng)用

可以編碼嗜殺因子的線狀雙鏈DNA質(zhì)粒和雙鏈RNA是研究酵母菌分子生物學(xué)的良好基因工程載體[2]。因嗜殺毒素對(duì)許多病原真菌的嗜殺作用，可將有關(guān)編碼嗜殺毒素的基因克隆到植物細(xì)胞中，這樣，大量所需的嗜殺毒素便可以從這些轉(zhuǎn)基因植物當(dāng)中獲取，實(shí)現(xiàn)對(duì)抗病原真菌的感染，達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的目的。

5 嗜殺酵母的應(yīng)用前景

嗜殺酵母產(chǎn)生的嗜殺因子在發(fā)酵、食品、農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖、醫(yī)藥等領(lǐng)域都具有很好的應(yīng)用前景，尤其是在發(fā)酵及抗真菌藥物方面，應(yīng)用潛力極大?？衫眉兓氖葰⒁蜃又委熎つw感染等問(wèn)題，但是這些毒素蛋白存在性質(zhì)不穩(wěn)定等問(wèn)題，這還需要進(jìn)一步的研究。有研究發(fā)現(xiàn)，分泌的嗜殺因子可能對(duì)一些人類(lèi)病原菌有抑制作用，特別是體現(xiàn)在對(duì)免疫缺陷的病人有致病性傳染的和的作用上[47]，這能否為癌癥或艾滋病治療提供可能還需要進(jìn)一步的研究。

另外，某些編碼嗜殺因子的基因位于線粒體上[22]，如果能夠?qū)⑦@些基因轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)用的優(yōu)良菌株中去，不但能夠殺死雜菌、凈化發(fā)酵體系環(huán)境，還可以穩(wěn)定生物性質(zhì)、提升產(chǎn)品質(zhì)量，為工業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造更大的效益。1983年，日本寶酒釀造公司采用細(xì)胞融合技術(shù)成功地選育了一株適用于酒精生產(chǎn)的嗜殺酵母，提高了酒精生產(chǎn)效率[48]。而且，利用酵母菌對(duì)不同嗜殺毒素的免疫力不同可進(jìn)行特定酵母菌株的鑒定[49]。

嗜殺酵母由于其獨(dú)特的微生物學(xué)特性而應(yīng)用廣泛，但也具有一定的局限性，如有些嗜殺酵母所產(chǎn)的嗜殺因子只能作用于特定的微生物，如果能夠構(gòu)建殺菌譜廣而且具有穩(wěn)定性質(zhì)的嗜殺酵母，將為工業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)效益。

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另外，餐飲企業(yè)除了采購(gòu)飲食類(lèi)的原材料之外，涉及的其他采購(gòu)如固定資產(chǎn)采購(gòu)也應(yīng)充分利用稅收優(yōu)惠政策。根據(jù)財(cái)稅〔2018〕54號(hào)文：企業(yè)在2018年1月1日至2020年12月31日期間新購(gòu)進(jìn)的設(shè)備、器具，單位價(jià)值不超過(guò)500萬(wàn)元的，允許一次性計(jì)入當(dāng)期成本費(fèi)用在計(jì)算應(yīng)納稅所得額時(shí)扣除，不再分年度計(jì)算折舊。中小餐飲企業(yè)的固定資產(chǎn)基本適用500萬(wàn)元以下的情況。如需近兩年購(gòu)置固定資產(chǎn)的，建議在迎合政策的有利時(shí)機(jī)下，企業(yè)加大固定資產(chǎn)的投入，稅負(fù)將可能繼續(xù)下降，享受的政策紅利將有利于企業(yè)的發(fā)展。

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責(zé)任編輯：張愛(ài)婷

Biological Properties of Killer Yeasts and Their Applications

WANG Lin1,TAN Chun-ming1,2, YU Gang1,YANG Xian-qing1,QI Bo1,YANG Shao-ling1,Corresponding Author

（1. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China; 2. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, Shandong Province, China）

Killer yeast in the process of growth and reproduction of the killer toxin could inhibit or kill certain microorganisms, and the killer toxin of its yeast did not bloodthirsty. The killer yeast used in industrial production, can inhibit the wild yeast pollution and purify the air, improve the quality of products, in which fermentation purification and biological stability of system environment has good effect; Some marine killer yeast for pathogenic bacteria can kill certain marine animal, it is used in aquaculture; Killer yeast secretion of the killer factor can be used as antifungal drug preparations inhibiting certain pathogenic yeast and yeast; in addition, killer yeast in gene engineering and transgenic plants also have to use, as a study of yeast molecular biology good gene engineering vectors and large scale synthesis and secrete killer factor to fight the infection of pathogenic fungi. This paper discusses the killer yeast species, biological characteristics and toxicity mechanism, an overview of the killer yeast in different areas use and the application prospect.

killer yeast; killer toxin; mechanism of action; application prospect

1008-5394（2017）01-0083-05

TS201.3

A

2016-05-06

廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)“廣譜抗菌活性的海洋嗜殺因子篩選及制備關(guān)鍵技術(shù)研究”（A201501C13）

王麟（1980-），男，山東萊州人，工程師，博士，主要從事海洋酵母多樣性及生物活性物質(zhì)研究。E-mail：linwang@mail.sdu.edu.cn。

楊少玲（1979-），女，廣東廣州人，助理研究員，碩士，主要從事水產(chǎn)品加工及高值化利用研究。E-mail：shaoling278@163.com。