GSK-3在電針抗急性缺血性腦損傷中的作用

黃荔，文國強

(海南省人民醫(yī)院神經內科，海南 海口 570311)

·綜 述·

GSK-3在電針抗急性缺血性腦損傷中的作用

黃荔，文國強

(海南省人民醫(yī)院神經內科，海南 ?？?570311)

糖原合成酶激酶-3是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞內多種信號轉導通路中的重要成分。GSK-3參與缺血缺氧性腦損傷的病理過程，并發(fā)揮著促凋亡的作用。電針刺激缺血腦組織可通過PI3K/Akt/GSK-3β信號通路，使GSK-3β磷酸化失活，抑制其活性，從而抑制細胞凋亡，發(fā)揮抗急性缺血性腦損傷作用。

糖原合成酶激酶-3；電針；急性缺血性腦損傷

糖原合成酶激酶-3(GSK-3，glyeogen synthase kinase-3)是細胞內多種信號轉導通路的重要蛋白和調節(jié)細胞凋亡的主要因子。大量研究表明電針對缺血性中風具有較好的治療作用，但其確切機制尚不明確。近來研究發(fā)現，電針可激活缺血腦組織PI3K/AKT通路，抑制GSK-3活性，發(fā)揮抑制細胞凋亡，產生腦保護作用[1]。現對此予以綜述。

1 糖原合成酶激酶-3概述

GSK-3是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以調節(jié)多種細胞的功能。在20世紀80年代，人們僅認為GSK-3是糖原代謝的一個重要的限速酶。隨著不斷深入的研究，越來越多的研究發(fā)現，GSK-3作為一個關鍵的酶，它對細胞的結構功能以及細胞存活方面起著關鍵性的作用，并且參與細胞的病理生理過程，如細胞的分化、凋亡以及增殖等[2]。

GSK-3主要有2種亞型，即GSK-3α和GSK-3β。在它們各自的催化區(qū)域中有98%的同源性，其中在N-和C-末端略微有差異。GSK-3β受雙位點磷酸化調節(jié)，可通過自身磷酸化和去磷酸化改變其活性。當GSK-3β氨基端的一個絲氨酸Ser9位點磷酸化失活后，其活性可明顯受抑制，這是GSK-3β發(fā)揮腦保護作用的關鍵因素[3]；而當GSK-3β的酪氨酸Tyr216位點去磷酸化后其活性受到激活；和普通激酶不一樣，GSK-3β在細胞內通常處于去磷酸化有活性狀態(tài)。當外界刺激時，可通過自身磷酸化失活，變?yōu)镚SK-3β(Set9)，即p-GSK-3β。

GSK-3β廣泛表達于人體的多種細胞和多個組織，它在中樞神經系統(tǒng)中高度表達且具有神經系統(tǒng)特異性；其在中樞神經系統(tǒng)含量極高，特別是在腦組織的海馬區(qū)；海馬CA1神經元對缺血高度敏感，被認為是研究缺血性腦血管病生理和病理變化的最佳模型。

GSK-3對細胞調節(jié)的影響力巨大。目前有報導，GSK-3可磷酸化40多種蛋白，包含10多種轉錄因子。如此眾多的可能底物可以發(fā)現體內GSK-3的活性一定存有精密的調控和它對細胞功能有強大的影響力[3]。

2 糖原合成酶激酶-3在抗急性缺血性腦損傷的作用

缺氧缺血性腦損傷可導致炎癥、興奮性氨基酸中毒、氧自由基損傷和細胞凋亡等多種病理生理機制。GSK-3β參與缺血對腦組織的損傷病理過程，影響缺血再灌注損傷[7]。缺血后的神經元特別容易受到GSK-3β異常活性的影響[4]。GSK-3β激活能夠促進大腦炎癥反應。有研究發(fā)現，抑制GSK-3可通過阻斷轉錄激活因子(STAT3)信號傳導減少促炎癥反應而發(fā)揮腦保護作用[5]。

GSK-3也可激活信號轉導通路導致細胞凋亡和壞死。有實驗證實，GSK-3β在內源性細胞凋亡途徑中扮演著重要的角色[6]。大量實驗表明，當神經系統(tǒng)損傷，GSK-3β活性會增加，當GSK-3β活性受到抑制，神經細胞凋亡將減少，這表明GSK-3β的過量表達會加重神經細胞凋亡，GSK-3β和缺血性腦細胞損傷有關[8]。

2.1 GSK-3的上游分子在缺血性腦損傷的調控作用 PI3K/Akt(磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶)信號是GSK-3主要的上游分子，其對細胞的內源性凋亡起重要的調控作用。PI3K/Akt是膜受體信號轉導進入細胞的主要途徑，通過影響其下游效應分子的激活，如凋亡蛋白和細胞周期調控蛋白，在維持細胞存活和抑制細胞凋亡中起關鍵作用[9]。PI3K活化后生成細胞內第二信使PIP3后可使Akt和PDK1(磷酸肌醇依賴性激酶-1)同時定位于細胞膜上，從而Akt的Ser473和Thr308可被PDK1磷酸化活化。當Akt活化后，它可與其下游分子GSK-3相互結合，使GSK-3轉位到細胞膜，磷酸化其N端的Ser9活性位點，抑制其活性，最終影響GSK-3的下游底物，抑制細胞凋亡。

整合素相關激酶(integrin-linked kinase，ILK)亦是GSK-3的上游分子，同樣參與調節(jié)GSK-3的活性。它也可磷酸化PKB/Akt的Ser473，從而磷酸化GSK-3 Ser9而抑制GSK-3的活性。此外，ILK還能直接磷酸化GSK-3使其活性受到抑制。

PI3K/Akt/GSK-3β信號通路是介導細胞存活的一條經典通路，其在腦、腎臟和心臟等缺血再灌注損傷中發(fā)揮著關鍵的作用，參與缺血再灌注損傷后的修復過程。經過此信號轉導通路，缺血再灌注細胞的凋亡能夠明顯受抑制，從而起到對抗缺血性腦損傷的作用。

2.2 GSK-3影響其下游分子而抗缺血性腦損傷作用 GSK-3在細胞凋亡的信號轉導通路中起基礎性的作用，其與凋亡聯(lián)系中最廣泛的研究是線粒體介導的凋亡信號級聯(lián)，可促進內源性凋亡信號通路。

GSK-3具有廣泛的下游底物，如P53蛋白、Bax、Bcl-2、核因子κB(NF-κB)、tau蛋白、β連環(huán)蛋白(β-catenin)、c-Jun轉錄子、caspase-3等。Bcl-2是細胞內調控凋亡的一類重要的蛋白家族，神經細胞凋亡主要由基因Bcl-2家族控制。Bcl-2家族成員中有抗細胞凋亡成員和促細胞凋亡成員，如Bcl-2、Bal-x等為抗細胞凋亡因子，Bax、Bak等為促細胞凋亡因子。Bcl-2作為Bcl-2蛋白家族中的一種負性調節(jié)因子，它在細胞受到外界刺激如缺血再灌注損傷時發(fā)揮抗缺血作用；Bax為促細胞凋亡成員，多數定位在細胞質。當細胞發(fā)生凋亡時，Bax從細胞質易位至線粒體內，此機制為Bax誘導細胞凋亡的重要環(huán)節(jié)。Bax能夠增加mPTP開放，可以使線粒體的促凋亡因子釋放增加。在線粒體膜上Bcl-2能夠和Bax相互作用，而抑制Bax的促細胞凋亡作用，進一步可抑制細胞色素C及Caspase蛋白激活[10]；已有研究證明，GSK-3和P53在細胞核中存有直接相互作用，發(fā)現GSK-3的活性增加，可促進p53的凋亡作用[11]；還有研究發(fā)現，非活性狀態(tài)的GSK-3β(p-GSK-3β)表達增加可抑制NF-κB的表達，從而參與缺血缺氧損傷的保護[6]；GSK-3β可抑制C反應元件結合蛋白(CREB)、熱休克因子1和熱休克蛋白70等這些促存活轉錄因子的表達而促細胞凋亡；可磷酸化eIF2B(真核起始因子2B)而抑制蛋白質合成促進細胞凋亡；越來越多的研究發(fā)現，特異性GSK-3β抑制劑鋰能夠保護神經細胞，抑制由多種原因導致的神經細胞凋亡[12～14]?？梢?，GSK-3β通過PI3K/Akt負性調節(jié)，其活性受到抑制，從而影響其下游底物而發(fā)揮抑制細胞凋亡抗缺血性腦損傷的作用。

3 GSK-3在電針抗缺血性腦損傷的作用

3.1 電針在缺血性腦損傷的作用 針刺療法作為中國傳統(tǒng)醫(yī)學的重要組成，有易于規(guī)范性操作、刺激參數反復性較好等特征，其在臨床上廣為選用。大量研究表明電針對缺血性腦卒中有較好的治療作用，但其確切機制尚不完全清楚。目前針刺的作用機理研究進入分子和細胞水平，很多研究發(fā)現，針刺可以調節(jié)鈣平衡、清除自由基、降低中樞興奮性氨基酸含量、糾正中樞單胺類神經遞質的代謝，使中樞興奮性氨基酸含量、腦組織一氧化氮含量及一氧化氮合酶活性的調節(jié)下降，從而保護缺血性腦損傷。在缺血性腦損傷的分子機制中針刺也有一定的療效，它可對抗缺血腦組織以及細胞凋亡，能夠促進內源性神經營養(yǎng)因子的表達等。

針刺能夠促進缺血性腦損傷后大腦皮層和海馬神經干細胞的增殖，能夠減輕缺血缺氧腦損傷對神經元尼氏體的損害，而且其不僅能有效減少幼鼠缺血缺氧腦損傷后的細胞凋亡，還通過促進NSCs的分化、增殖，使腦損傷得以修復發(fā)揮腦保護作用[15]。有研究表明，電針可以緩解卒中后神經功能缺損和減少梗死體積[16]。針刺也可激活缺血腦組織PI3K/Akt通路，上調Bcl-2/Bax比值，抑制神經細胞凋亡，實現神經保護作用[1]。

3.2 DOR在電針抗缺血性腦損傷的作用 關于缺血性腦損傷保護機制的研究，一個獨特的發(fā)現為δ-阿片受體(Delta-opioid receptors，DOR)在神經元保護中的重要作用。近來研究發(fā)現，DOR在缺血缺氧神經元的保護作用中扮演著重要的角色[17]，參與電針抗急性缺血性腦損傷的作用[18]。電針通過促進DOR的表達可以發(fā)揮減輕神經功能缺損和腦梗死體積的作用。

夏螢實驗室發(fā)現DOR在神經元的保護機制中和PKC-MAPK通路的調節(jié)相關聯(lián)[17]。另外腦源性神經生長因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)也可能參與這一通路的調控，BDNF主要在中樞神經系統(tǒng)的神經元內合成，當神經元缺血缺氧時可產生保護效應，并且促進腦缺血后室管膜下區(qū)和海馬顆粒細胞下區(qū)的神經發(fā)生，新生神經元遷徙到缺血紋狀體周邊區(qū)域，乃至到達缺血皮層。酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TRK)受體可和G蛋白偶聯(lián)受體DOR互相作用，活化的DOR經過BDNF阻斷由Bax誘導的細胞凋亡發(fā)揮介導神經保護作用。含SH2信號分子如磷酸酯酶Cγ，PI3K和信息傳遞蛋白SHC結合磷酸化的TrkB后，活化PKC，而且依次激活MAPK/ERK，引起磷酸化激酶瀑式反應達到頂點和激活轉錄因子，直接誘導神經保護作用和發(fā)生。這些研究表明，DOR的激活可能通過BDNF及其Trk依賴的酪氨酸激酶而介導神經保護和神經發(fā)生。

DOR參與腦缺血保護作用的機制是非常復雜的，并不僅僅只有一個機制在整個過程中發(fā)揮作用。DOR還參與了腦缺血的神經保護和神經再生，其機制與細胞膜和細胞內的多重調節(jié)有關，BDNF及其有關通路可能僅是其中的重要機制之一。有研究發(fā)現，GSK-3β抑制劑可以改變BDNF的表達，這表明BDNF轉錄間接依賴GSK-3β抑制劑。當GSK-3β活性受到抑制時，可能增加缺血組織中BDNF的轉錄[4]。因此，進一步的研究可探討電針是否借助DOR而激活糖原合成酶激酶-3信號，轉而對抗急性缺血性腦損傷。

3.3 GSK-3在電針抗缺血性腦損傷的作用 在電針抗缺血性腦損傷的機制中GSK-3與其上下游底物有密切的關聯(lián)。先前已有研究發(fā)現，電針預處理能夠通過內源性大麻素信號轉導機制介導而起到神經保護的作用[19]。目前研究表明，經過電針預處理，GSK-3β的磷酸化形式可通過大麻素CB1受體(CB1R)誘導神經保護的作用。對大鼠行大腦中動脈閉塞致局部短暫性腦缺血實驗。GSK-3β Ser9位點的磷酸化[p-GSK-3β(Ser9)]在缺血再灌注后的半暗帶組織中評估；在再灌注72 h后，予PI3K抑制劑或GSK-3β抑制劑，評估梗死體積和神經功能學評分；用TUNEL染色檢測細胞凋亡；測定Bax/Bcl-2比值在再灌注24 h后。實驗結果顯示電針預處理增加再灌注2 h后同側半暗帶中的p-GSK-3β(Ser9)。和電針預處理相同，增加GSK-3β的磷酸化能夠產生神經保護作用；相比之下，予PI3K抑制劑后抑制了p-GSK-3β(Ser9)的水平，從而不僅逆轉電針預處理后的神經保護作用，而且逆轉抗凋亡作用；在用CB1R拮抗劑和CB1R敲除治療后，電針預處理調節(jié)GSK-3β的作用將被終止，而兩種CB1R激動劑可增強GSK-3β磷酸化。因此，得出結論，電針預處理通過CB1R介導GSK-3β磷酸化而發(fā)揮抗腦缺血再灌注損傷作用[20-21]。

PI3K/AKT信號通路對GSK-3β在電針抗缺血性腦損傷的作用起重要的調控作用，它是一個經典的抗凋亡、促存活的信號轉導途徑。以往研究認為PI3K/AKT信號通路的激活可抑制缺氧缺血腦損傷和發(fā)揮腦保護作用[22]。目前有實驗證明，用隨機方法選取30只健康大鼠為正常組，對120只大鼠行缺血缺氧腦癱造模，造模組中隨機分為4組，每組30只，即模型組、電針刺激頭部運動區(qū)組(干預1組)、電針刺激頭部運動區(qū)+PI3K特異性抑制劑LY294002組(干預2組)、電針刺激頭部運動區(qū)+GSK3β特異性抑制劑LiCL組(干預3組)，對大鼠進行神經行為學評估以及Western Blot法檢測海馬組織p-PDK1、Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3 β(ser9)、MCL-1表達、組織病理。結果顯示，和模型組相比，運動功能評分在干預組1、3組各個時期均相對偏高，且海馬神經元凋亡減少，p-Akt、p-PDK1、p-GSK-3β(ser9)、MCL-1在海馬組織表達明顯；干預2組和模型組對比，差異沒有統(tǒng)計學意義。得出結論，即電針刺激頭部運動區(qū)經過PI3K/Akt/GSK-3β信號通路可有效降低腦癱大鼠腦損傷，促進神經功能恢復[23]。實驗也發(fā)現，當電針刺激和同時予GSK-3β抑制劑LiCL(氯化鋰)時，PI3K/Akt/GSK-3β信號轉導通路能夠被進一步激活，通路激活后GSK-3β的活性會受到抑制，從而抑制各種原因引起的神經細胞凋亡，對神經保護有疊加作用[23]。另也有實驗發(fā)現，在腦出血急性期，對“百會透曲鬢”穴位行針刺干預，其可使GSK-3β蛋白的表達下降，改善腦組織缺血缺氧狀態(tài)，保護神經細胞損傷，使腦出血后炎性反應致使的繼發(fā)性腦損傷程度減輕[24]。

綜上所述，GSK-3在電針抗缺血性腦損傷的機制中發(fā)揮著重要的作用。電針干預下，PI3K/Akt/GSK-3β通路可使缺血腦組織的GSK-3β磷酸化失活，抑制GSK-3β活性，進而抑制神經細胞凋亡，發(fā)揮腦保護作用。

4 展 望

缺血性腦卒中在臨床十分常見，可嚴重影響到人類的健康，對社會和家庭帶來繁重的負擔。GSK-3作為重要的靶點在缺血缺氧性腦損傷中起著重要的調控作用，其作為電針保護腦損傷的通路之一，可對電針抗缺血性腦損傷的分子機制提供可靠的實驗依據，為以后抗缺血性腦損傷新的治療靶點的開發(fā)應用提供有力的理論基礎。

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Role of glycogen synthase kinase-3 in electroacupuncture against acute ischemic brain injury.

HUANG Li,WEN Guo-qiang.Departments of Neurology,Hainan General Hospital,Haikou 570311,Hainan,CHINA

Glycogen synthase kinase-3(GSK3)is a multifunctional serine/threonine protein kinase,which is an important component in various intracellular signal transduction pathways.GSK-3 is involved in the pathological process of hypoxic-ischemic brain damage and plays a role in promoting apoptosis.The activity of GSK-3β is inhibited by electroacupuncture stimulating the ischemic brain tissue through phosphorylation of GSK-3β in phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)/Akt/GSK-3β signal pathway,thereby which can inhibit cell apoptosis and play a role in fighting against the acute ischemic brain injury.

Glycogen synthase kinase-3(GSK3);Electroacupuncture;Acute ischemic brain injury

R743

A

1003—6350（2017）20—3356—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.20.029

國家自然科學基金地區(qū)基金(編號：81260204)；海南省重點科技計劃項目(編號：ZDXM20120048)，?？谑兄攸c科技計劃項目(編號：2012-066)

文國強。E-mail：13907692078@126.com

2017-03-15)