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    構(gòu)建組織工程血管的支架材料和種子細胞研究進展

    2017-02-26 06:16:40潘興納蒲磊李亞雄侯宗柳蔣立虹
    海南醫(yī)學 2017年3期
    關鍵詞:支架生物工程

    潘興納,蒲磊,李亞雄,侯宗柳,蔣立虹

    (1.昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院心臟大血管外科,云南 昆明 650051;2.昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院科研部,云南 昆明 650051;3.云南省第一人民醫(yī)院,云南 昆明 650032)

    構(gòu)建組織工程血管的支架材料和種子細胞研究進展

    潘興納1,蒲磊1,李亞雄1,侯宗柳2,蔣立虹3

    (1.昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院心臟大血管外科,云南 昆明 650051;2.昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院科研部,云南 昆明 650051;3.云南省第一人民醫(yī)院,云南 昆明 650032)

    國內(nèi)外學者已對用于構(gòu)建組織工程血管的支架材料和種子細胞進行了較多的研究,以期研制出能代替自體血管用于臨床的血管移植物,它應具備良好的生物相容性、適應性重塑和生長的潛能。雖然組織工程研究已開展30多年并取得一定成果,但是仍有許多問題亟待解決。如何研制出理想的支架材料和選擇合適的種子細胞有待進一步研究。綜述近年用于構(gòu)建組織工程血管的支架材料和種子細胞的研究進展。

    組織工程;血管;支架;種子細胞;間充質(zhì)干細胞

    動脈粥樣硬化嚴重影響人類健康和生活質(zhì)量,居全球死亡原因的首位。目前,該病的治療包括:球囊血管成形、支架植入、血管旁路移植和藥物治療。先天性心臟病嚴重影響患者的健康,藥物治療僅能緩解部分臨床癥狀,部分復雜先天性心臟病的治療尤為棘手。隨著基礎研究和外科治療技術的快速發(fā)展,戊二醛固定的異種血管和應用高分子聚合物(滌綸、聚四氟乙烯乙烯)人工構(gòu)建的心外管道用于重建血液循環(huán)已成為復雜先天性心臟病的有效治療方法,如:改良Fonton術、Rastelli術,然而,血管直徑不匹配、內(nèi)膜增生、血栓形成、鈣鹽沉積、順應性差、缺乏生長和重塑潛能等多種因素限制他們的臨床應用[1-3],且多需要再次手術干預[4]。自體動脈或靜脈是小直徑血管移植的“金標準”,然而,30%~40%的患者因外傷史、手術史、血管病變等導致自體血管不能滿足旁路移植手術需求[5-6]。理想血管移植物的缺乏嚴重影響了患者的治療,加重家庭和社會負擔,尋求和制備理想的血管替代物(尤其是小直徑血管替代物)已經(jīng)成為臨床研究的熱點。

    組織工程血管(tissue engineering blood vessel,TEBV)是指運用工程學和生命科學的原理、方法和技術,模擬目標血管的結(jié)構(gòu)和功能來開發(fā)具備一定生物活性的組織替換物以重建、維持、提高受累血管的生理功能[5,7]。應用組織工程理念構(gòu)建的大直徑血管作為心外管道應用于復雜先心病患者獲得理想的效果,移植物呈現(xiàn)出適應性重塑和生長的潛能[8-9],而組織工程小直徑血管研究尚未取得較大突破,本文就用于構(gòu)建組織工程血管的支架材料和種子細胞的研究進展進行綜述。

    1 支架材料

    支架材料為種子細胞的生長和血管新生提供必要支撐,是細胞粘著、生長和新陳代謝的平臺,是制備組織工程血管的先決條件。理想的組織工程血管支架應具備以下特點:(1)良好的生物組織相容性;(2)適宜的三維立體結(jié)構(gòu)、長度、容積;(3)可控的生物降解性和降解率,降解產(chǎn)物對機體無毒副作用、不引起強烈的免疫排斥反應和炎癥反應;(4)良好的多孔結(jié)構(gòu),易于種子細胞種植、遷移,細胞彼此之間相互接觸,易于生物信號分子的傳遞;(5)具備一定的生物表面活性,能促進種子細胞黏附,并為種子細胞增殖、分化、分泌細胞因子和合成細胞外基質(zhì)提供良好的生物微環(huán)境;(6)一定的可塑性和良好的生物機械力學強度,不抑制生物信息的傳遞;(7)方便消毒、保存、運輸;(8)支架在重塑過程中具備一定的耐久性[10-11]。在過去近30年的時間里,組織工程血管支架材料由簡單的不可降解聚合物材料發(fā)展到高分子可降解材料、生物材料和雜交復合材料,其設計和加工的方式已發(fā)展到具有巨大潛力的快速成型技術、靜電紡絲技術和3D打印技術等,取得了令人矚目的成績?,F(xiàn)階段,按其來源和性能,主要將組織工程血管支架分為不可降解材料、可降解高分子合成材料、可降解天然生物材料、復合材料四大類[12-13]。

    1.1 不可降解血管支架材料 人工支架材料(如滌綸、聚四氟乙烯等)已被用于構(gòu)建組織工程血管。目前,滌綸管道主要用于主動脈,理論上認為,滌綸移植物卷曲長軸能增加靈活性、彈性和扭結(jié)阻力,然而這些屬性因移植后組織再生而喪失[14]。聚四氟乙烯是一類具多孔結(jié)構(gòu)的不可降解性聚合物,應用于中、大直徑血管取得相對較好的中遠期結(jié)果,然而,它的血液相容性和細胞相容性欠佳,易于血栓形成和內(nèi)膜增生,在小直徑血管(<6 mm)中應用受到明顯限制。有學者試圖用肝素、水蛭素、一氧化氮、葡糖氨基聚糖類、磷酰膽堿、白蛋白、聚合物等改良支架結(jié)合原位內(nèi)皮形成理念來克服血栓形成;同時有學者通過支架表面種植血管內(nèi)皮細胞和間充質(zhì)干細胞以形成抗血栓的內(nèi)膜表面,雖然取得一定成效,但均未取得十分理想的效果[2,15]。更何況,臨床上需求較多的是小直徑血管移植物,因其血流速度和血壓隨血管直徑減小呈進行性下降,血流易于停滯,對血管移植物的要求更高。滌綸和聚四氟乙烯構(gòu)建直徑小于6 mm的小血管均未獲得滿意的效果[16],目前,這類支架材料已逐漸被淘汰。

    1.2 可降解高分子合成支架材料 基于可降解的聚合物支架材料體外種植細胞一直是組織工程血管研究的重點,隨著支架材料的降解,種植的細胞合成并分泌細胞外基質(zhì)以重塑形成新的血管。目前,國內(nèi)外研究較多的可降解聚合物有聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)以及兩者的混合物聚乳酸羥基乙酸(PLGA)、聚已酸內(nèi)酯(PCL)、聚乙二醇(PEG)、聚左旋乳酸(PLLA)、聚羥基丁酯(P4HB)、聚羥基辛酯(PHO)、聚氨酯(PU)等。這些材料可標準化生產(chǎn),通過水解作用降解,易于塑形為目標結(jié)構(gòu),具有可控的機械性能和降解率,已成為組織工程領域研究的熱門材料。但這些高分子合成材料仍各有弊端,如PGA材料在醫(yī)用材料方面有著一定用途,但是在體內(nèi)降解過快,降解產(chǎn)物很容易引起炎癥反應;PLA在體內(nèi)降解產(chǎn)物是乳酸,雖然無毒害作用,但它的細胞親和力較差;PHB具有良好的可控制降解性能,且降解產(chǎn)物對機體無毒害作用,但它的細胞相容性欠佳[17]。這些聚合物材料缺乏種子細胞增殖、粘附和調(diào)節(jié)體內(nèi)重塑相關的生物信息,缺乏生物相容性[18]等不利因素使其應用于血管支架受到了限制。近年將多個聚合物混合共聚構(gòu)建支架,若把不同高分子聚合物按一定的比例進行共聚,可讓相應聚合物的優(yōu)勢最大化,可顯著改善其物理及生物學性能。Andukuri等[19]應用靜電紡絲技術構(gòu)建聚乙酸內(nèi)酯支架,支架裝載兩親水脂分子,顯著增加了內(nèi)皮細胞粘附,減少血小板聚結(jié),但其降低平滑肌細胞的增殖。Naito等[20]聯(lián)合聚乙醇酸/聚乙醇酸/聚乳酸等三種聚合物構(gòu)建支架材料,種植骨髓來源的單核細胞獲得組織工程血管,建立C57BL/6 mice下腔靜脈間位植入模型,隨著移植物的降解,細胞逐漸合成膠原、彈性蛋白、糖氨聚糖類等細胞外基質(zhì),移植物通暢。Williamson等[21]聯(lián)合靜電紡絲技術,將多孔的聚氨酯織于聚已酸內(nèi)酯構(gòu)建支架,種植臍靜脈內(nèi)皮細胞,結(jié)果顯示該支架能顯著增強內(nèi)皮細胞粘附、分泌相應細胞因子和傳遞細胞因子。隨著納米科技、靜電紡絲技術[22-23]和3D打印技術[24]的發(fā)展,為組織工程血管支架材料研究提供了一個嶄新的平臺,也解決了現(xiàn)存的一些問題。聯(lián)合先進高科技技術構(gòu)建的組織工程血管支架材料能為種子細胞增殖、粘附和分泌細胞外基質(zhì)提供微環(huán)境,能夠可控地使干細胞表達自身的生物學功能和分化。聯(lián)合納米材料可在組織工程血管支架內(nèi)膜面固化一些具有抗血栓形成功能的分子,形成非細胞性的納米抗血栓表層,這些分子實現(xiàn)抗凝目的的同時明顯提高內(nèi)皮表面形成[25-26]。隨著材料科學和高科技技術的快速發(fā)展,可降解高分子材料被眾多學者寄予厚望,但其真正成為組織工程血管理想的支架材料還需進一步研發(fā)。

    1.3 生物支架材料 常用的可降解生物支架包括脫細胞血管基質(zhì)、纖維蛋白凝膠、膠原、透明質(zhì)酸等。他們能為細胞粘附及生長提供生物信號,特別是脫細胞的細胞外基質(zhì)作為支架,其充分利用細胞外基質(zhì)獨有的三維立體結(jié)構(gòu)和生物活性,通過體外細胞種植,內(nèi)膜面形成內(nèi)皮細胞層可有效預防血栓的形成。生物支架材料的優(yōu)點:(1)良好的細胞相容性;(2)組織相容性好,免疫原性低,很少引起機體的免疫排斥反應;(3)具有生物降解性,其降解產(chǎn)物無毒副作用;(4)理想的生物機械力學性能,能滿足機體血流動力學要求;(5)來源廣泛,可作為“off-the-shelf”支架;(6)柔韌性良好,易于手術操作[27-28]。脫細胞的血管基質(zhì)是最常用的天然生物材料,它具有天然的血管的細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)。Schaner等[29]應用十二烷基硫酸鈉(SDS)對人大隱靜脈進行脫細胞,內(nèi)皮細胞完全去除,靜脈壁間細胞清除率達94%,膠原、彈性蛋白和基底膜結(jié)構(gòu)保留完整,生物機械力學性能良好。隨后該團隊用相同的方法對犬頸外靜脈進行脫細胞,隨后將同種脫細胞的移植物間位植入頸動脈,術后兩周移植物未見擴張、狹窄及吻合口并發(fā)癥。Gui等[30]聯(lián)合表面活性劑CHAPS、EDTA和SDS對臍動脈脫細胞,亦獲得有應用潛能的小直徑血管支架。此外,亦有學者應用相近的方法對牛頸靜脈[31-32]、馬頸動脈[33]、豬頸動脈[34]、犬頸動脈[35]進行脫細胞處理,對脫細胞支架進行初步評估,體外實驗及短期體內(nèi)實驗結(jié)果理想,但其應用前景尚缺乏中長期的大動物實驗數(shù)據(jù)支持,有待進一步研究。聯(lián)合聚合物支架的降解特性、種子細胞能合成細胞外基質(zhì)的生物學特點,應用生物反應器動態(tài)培養(yǎng),隨著支架降解和細胞合成細胞外基質(zhì),隨后對其進行脫細胞處理,通過該理念可獲得同種血管支架材料[36],該理念值得進一步深入研究。

    纖維蛋白是細胞外基質(zhì)中重要的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白,具有彈性、自我組裝、長期穩(wěn)定性和生物學活性,這類天然的生物高分子具有較好的生物相容性,參與組織損傷修復后血管生成,具有可控的生物降解性[37],其可以作為細胞和生長因子傳遞的良好平臺,纖維蛋白有希望模擬活體微環(huán)境支持細胞粘附、分化、增殖,能促進細胞存活和細胞外基質(zhì)成分合成。黃程程等[38]用人臍靜脈內(nèi)皮細胞種植在纖維蛋白凝膠上,觀察其形成血管樣管腔結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示當細胞密度為1.5×104個/孔,纖維蛋白原的濃度為0.5 mg/mL,凝血酶的濃度為0.1 mg/mL,血清的濃度為10%時,內(nèi)皮細胞在纖維蛋白凝膠上面生長良好,得到比較規(guī)則理想完整的血管樣管腔結(jié)構(gòu)。纖維蛋白可聯(lián)合各種生長因子和其他成分,體外塑性獲得支架,可作為理想支架材料的添加劑[39]。

    膠原蛋白和彈性蛋白是血管細胞外基質(zhì)的主要成分,能提供適宜的機械應力和張力,具有低抗原性和生物降解性。通過調(diào)控冷凍溫度、冰結(jié)晶形成、溶液酸堿度和膠原的濃度可獲得多孔的膠原蛋白支架[37],然而,膠原纖維和膠原凝膠臨床應用的主要缺陷在于其過于僵硬且血小板易于粘附于其表面而形成血栓[17]。透明質(zhì)酸是具有良好彈性的聚糖成分,具有低免疫原性和低血栓形成特性,能促進細胞粘附,其可能的分子機制在于透明質(zhì)酸中包含促細胞粘附的分子亦適用于其他支架材料構(gòu)建支架的佐劑。

    1.4 復合支架材料 復合支架集各組分的優(yōu)點于一體,能獲得生物材料細胞親和力強和包含細胞因子的優(yōu)勢,兼?zhèn)渚酆衔锊牧峡煽氐慕到饴省⑺苄?、機械性能和結(jié)構(gòu)等優(yōu)點,具有支架涂層抗血栓、促進細胞粘附和再植等特性。這樣獲得的復合材料,繼承了多種材料的優(yōu)點,發(fā)揮各自優(yōu)勢,相輔相成,它具有天然血管的特質(zhì),更好地滿足組織工程血管的要求,是組織工程血管支架材料研究的重要方向。有學者通過靜電紡絲技術制備“膠原-殼聚糖-聚左旋乳酸聚己內(nèi)酯”支架,得到纖維平均直徑為224 nm、血管支架長度為0.9 cm的多層復合血管組織工程支架,其具有良好的力學性能和生物相容性,適用于組織工程血管移植[40]。莫秀梅等[41]將乳酸己內(nèi)酯共聚物紡絲液和膠原蛋白紡絲液進行單噴頭靜電紡絲,或分別進行雙噴頭靜電紡絲,成功發(fā)明了具有良好力學性能和生物相容性的血管支架,其特殊的雙層結(jié)構(gòu)能夠仿生天然血管結(jié)構(gòu)。復合材料制備的小口徑管狀支架,既能克服天然生物高分子材料力學性能的不足,又能避免合成材料在生物相容性和安全性的缺陷,成為制備小口徑血管組織工程支架的必然趨勢。盡管這類支架采用了各種手段避免血栓、炎癥等不良反應,其生物相容性仍舊無法與天然材料相比。因此,在天然材料與合成材料之間找到一個最佳比例,使復合材料的力學性能和血管相容性等達到一個平衡,將會顯著提高支架在小口徑血管組織再生中的應用。同時制備多層血管,進行功能化修飾,模擬天然細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能,將成為用于心血管組織修復及組織工程小口徑血管研究的新方向。

    2 種子細胞的選擇

    種子細胞在血管支架上體外種植,模擬構(gòu)建天然血管結(jié)構(gòu),血管移植后以便其能行使正常的血管功能,形成抗血栓表面。多種細胞已運用于組織工程血管的研究,但何種細胞是組織工程血管最佳的種子細胞尚無定論,所以獲得理想的種子細胞有待進一步研究,而作為種子細胞應具備以下的特點:(1)體外增殖能力強,短期內(nèi)能達到預想的細胞數(shù)目;(2)形成完整的細胞表面,具備抗血栓性能;(3)易于獲取,實用性強;(4)有一定的合成、分泌功能;(5)低免疫原性或無免疫原性,臨床運用安全可靠;(6)移植后體內(nèi)存活時間長。目前研究較多的有以下幾種:

    2.1 成熟體細胞 自體血管來源的內(nèi)皮細胞和成纖維細胞[42]早年即被用于構(gòu)建組織工程血管。血管內(nèi)膜完整的血管內(nèi)皮細胞表面是血液與血小板粘附基質(zhì)的障礙,同時內(nèi)皮細胞合成多個抗凝血分子、調(diào)節(jié)血小板粘附和激活、調(diào)節(jié)纖維蛋白溶解,此特有的抗血栓性能曾經(jīng)被認為是最理想的組織工程細胞,然而其多取自大隱靜脈且體外增殖能力有限,來源于成人血管的內(nèi)皮細胞在體外很快進入增殖期,研究顯示隨培養(yǎng)周期的延長,細胞及其基質(zhì)形成呈現(xiàn)增加的趨勢,但傳代4~6代后其增殖活性逐漸下降,隨著時間延長就會出現(xiàn)細胞“去分化”和“老化”等問題,逐漸喪失特有功能[43]。成纖維細胞作為結(jié)締組織最主要的細胞成分,在分泌細胞外基質(zhì)成分、構(gòu)建細胞外基質(zhì)和創(chuàng)傷修復過程中發(fā)揮重要的作用,且具有較強的分裂增殖能力,適應性強,用其來模擬血管中膜的平滑肌細胞及充當細胞外基質(zhì)成分。獲取自體血管會增加患者額外創(chuàng)傷,犧牲供體血管完整性,實驗研究具可行性,但這種方案的臨床運用有一定的局限性,因此尋找一種創(chuàng)傷小的種子細胞獲取方法非常必要。

    2.2 干細胞 干細胞因其來源廣泛、易于獲得、體外增殖能力強、具有多向分化潛能和旁分泌功能等優(yōu)勢受到眾多研究者的青睞。干細胞來源大致可分為三類:成體干細胞、胎兒附屬物來源的干細胞、誘導多潛能干細胞。骨髓來源的間充質(zhì)干細胞與血細胞和血小板具備一定的相容性,其表現(xiàn)出類似血管內(nèi)皮細胞的抗血栓性能和良好的血液相容性[2],且具備多向分化的潛能,其旁分泌功能有易于循環(huán)血液中的干細胞、前體細胞參與組織工程血管在體內(nèi)的重塑。胚胎干細胞的應用受到倫理學的限制且具惡性分化潛能,誘導多潛能干細胞雖能克服倫理學限制和跨越免疫排斥,但其體外誘導分化率低,惡性分化的風險使臨床運用受到一定限制。胎兒附屬物來源的間充質(zhì)干細胞(臍帶、羊膜、羊水)與骨髓間充質(zhì)干細胞具有相似的細胞生物學性能和表面標記[44-46],有研究顯示隨年齡增長,骨髓間充質(zhì)干細胞增殖、分化能力下降[43],且胎兒附屬物來源間充質(zhì)干細胞的增殖、分化能力優(yōu)于成人骨髓間充質(zhì)干細胞,臍帶作為分娩后的丟棄物,來源廣泛、易于獲取,無疑可成為組織工程血管理想的種子細胞。通過基因修飾將0ct3/4、Sox2、Klf4、和c-myc等外源基因轉(zhuǎn)入體細胞,可獲得誘導多潛能干細胞,它的分化潛能接近胚胎干細胞,可跨越倫理限制和異體免疫排斥,Hibino等[47]將誘導多潛能干細胞種植于聚合物共聚支架構(gòu)建小直徑血管,間位植入免疫缺陷小鼠的下腔靜脈,10周后對移植物進行評估,結(jié)果顯示移植物通暢,未見血栓、鈣化、動脈瘤形成和移植物破裂。理論上能成為組織工程血管適宜的種子細胞,但是,誘導多潛能干細胞有惡性分化潛能,外源基因的安全性有待研究。

    3 小 結(jié)

    組織工程血管研發(fā)至今,雖已取得令人矚目的成績,仍存在很多問題亟待解決,還未達到滿足臨床需求的效果。限制組織工程血管研究的關鍵因素仍是支架材料和種子細胞的選擇,隨著各方面研究的進一步深入,相信組織工程血管將讓患者從中獲益,解決實質(zhì)性的臨床問題。

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    Research progress of scaffold materials and seed cells in construction of tissue engineered blood vessel.

    PAN Xing-na1,PU Lei1,LI Ya-xiong1,HOU Zong-liu2,JIANG Li-hong3.1.Department of Cardiovascular Surgery,Yanan Hospital Affiliated to Kunming Medical University,Kunming 650051,Yunnan,CHINA;2.Department of Scientific Research, Yanan Hospital Affiliated to Kunming Medical University,Kunming 650051,Yunnan,CHINA;3.The First People's Hospital of Yunnan Province,Kunming 650032,Yunnan,CHINA

    In order to develop vascular grafts which can substitute for autologous blood vessels and be used for clinical practice,scholars at home and abroad have conducted much research on the scaffold materials and seed cells in construction of tissue engineered blood vessel.These vascular grafts should have good biocompatibility,adaptive remodeling and growth potential.Tissue engineering research has been carried out for more than 30 years and some achievements have been made,but there are still many problems to be solved.How to develop the ideal scaffold material and select the appropriate seed cells still remain to be further studied.In this review,we summarize the recent research progress on scaffold materials and seed cells in construction of tissue engineered blood vessel.

    Tissue engineering;Blood vessels;Scaffolds;Seed cells;Mesenchymal stem cells

    R541.4

    A

    1003—6350(2017)03—0446—05

    10.3969/j.issn.1003-6350.2017.03.034

    2016-05-29)

    云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學聯(lián)合專項(編號:2013FB187、2013FB189);云南省衛(wèi)生科技計劃項目(編號:2014NS208,2014NS209)

    蔣立虹。E-mail:jianglihong_yayy@163.com

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