環(huán)氧化物水解酶的研究進展

婁文勇， 趙 瑩， 彭 飛， 宗敏華

(1. 華南理工大學食品科學與工程學院，應用生物催化實驗室，廣州 510640； 2. 華南理工大學，廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點實驗室，廣州 510640)

環(huán)氧化物水解酶的研究進展

婁文勇1,2*， 趙 瑩1,2， 彭 飛1,2， 宗敏華1,2

(1. 華南理工大學食品科學與工程學院，應用生物催化實驗室，廣州 510640； 2. 華南理工大學，廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點實驗室，廣州 510640)

環(huán)氧化物水解酶可高效率、高選擇性地水解環(huán)氧化物生成手性鄰二醇，對光學活性的鄰二醇的合成和光學活性的環(huán)氧化物的制備具有重要意義. 文章闡述了環(huán)氧化物水解酶的作用、來源、結構及其催化機制，進一步綜述了環(huán)氧化物水解酶催化環(huán)氧化物水解、環(huán)氧化物水解酶的克隆表達等研究進展.

水解酶； 環(huán)氧化物； 鄰二醇； 催化

環(huán)氧化物通過選擇性開環(huán)可以制備具有光學活性的手性醇類化合物及選擇性保留具有重要價值的環(huán)氧化物. 如作為神經(jīng)保護藥關鍵性合成子的(R)-4-氯苯基乙二醇可經(jīng)環(huán)氧化物水解酶水解相應的環(huán)氧化物制備而得. 與之類似，茚環(huán)類環(huán)氧化物經(jīng)環(huán)氧化物水解酶催化開環(huán)水解也可以制得抗艾滋病藥物齊夫而定的重要中間體物質：(1R,2S)-環(huán)氧化合物和(1R,2R)-二醇. 環(huán)氧化物水解酶廣泛存在于自然界中，在植物、動物、真菌和細菌中均存在環(huán)氧化物水解酶，其催化環(huán)氧化物水解反應相比化學催化有諸多優(yōu)點，如選擇性高、催化效率高、環(huán)境友好等，因此引起了廣泛關注. 然而，從自然界篩選的環(huán)氧化物水解酶也存在一定的局限，如理論產(chǎn)率不超過50%，底物的耐受性較低，酶提取純化困難和酶表達量較低等缺點. 針對這些問題，研究人員采用了基因克隆表達及基因突變等技術有效地克服了這些困難.

1 環(huán)氧化物水解酶的來源

近年來，光學純的醇、氨基酸、胺、環(huán)氧化物和有機酸的制備成為研究的熱點，其中手性醇具有重要的應用價值[1]. 1,2-苯乙二醇是一種手性醇，因其烷基鏈上α位連有4個不同的化學基團而具有一定的旋光性. 目前，像這種具有旋光性的手性醇被廣泛用于醫(yī)藥領域、農(nóng)藥領域和材料領域. 光學純的(S)-1,2-苯乙二醇因具有光學、熱學和化學穩(wěn)定性等特點不僅是液晶材料中重要的添加劑，同時還可以作為農(nóng)藥的中間體；而光學純的(R)-1,2-苯乙二醇是制備具有光學活性的醫(yī)用藥物的重要中間體，如進一步合成光學活性藥物β-腎上腺素阻斷劑、(R)-硝基心定、抗心律失常藥等[2-4]. (R)-1,2-庚二醇是用于合成鐵電液晶材料的γ-內酯的前體[5]. (2R,3S)-3-(4-甲氧基苯基)縮水甘油酸酯可用于合成抗癌藥物氨肽酶N抑制劑Besattin、Phebetin、Porbestni和MR-387等一系列化合物[6]. (R)-芐基縮水甘油醚用于合成Acetogenins等免疫抑制劑[7].

環(huán)氧化物是合成手性醇的重要中間體，其立體選擇性開環(huán)可得到手性環(huán)氧化物或手性醇化合物，并用于后續(xù)的應用. 目前，環(huán)氧化物開環(huán)水解成手性醇的反應多集中在化學法和生物法[8]. 化學法常存在諸多不足，因為環(huán)氧化物在水中溶解性較差，需要添加有機溶劑，溶劑的消耗量比較大，步驟較繁瑣，反應條件較苛刻，產(chǎn)品光學純度低，而且反應中需要添加有毒的手性催化劑和保護劑[9-10]. 另外，Jacobsen法雖然能水解外消旋環(huán)氧化物得到手性鄰二醇和手性環(huán)氧化物，但其存在底物譜窄、反應條件苛刻、選擇性低、產(chǎn)物分離純化困難和環(huán)境污染等問題. 與化學法相比，生物法利用酶或細胞作為催化劑，不僅具有催化效率高、選擇性高、反應溫和、污染小等優(yōu)點，而且能夠制備一些化學法難以合成的對映體純的小分子手性鄰二醇和手性環(huán)氧化物，因而生物法日益受到人們青睞，逐漸成為手性化合物制備的重要手段[11-13].

環(huán)氧化物水解酶是可以將水分子選擇性地加成至環(huán)氧環(huán)上，從而生成鄰二醇類化合物的一種酶[14]，它還可通過水解人體內環(huán)氧化物從而降低人體患癌癥的幾率[15]. 在活細胞中，芳香族和脂肪族的環(huán)氧化物均可被環(huán)氧化物水解酶水解，獲得二醇，取得解毒和信號調節(jié)作用.[16-17]. 環(huán)氧化物水解酶的來源較為廣泛，普遍存在于自然界的生物體中，幾乎所檢測過的哺乳動物體內都存在環(huán)氧化物水解酶. 在土豆、綠豆、黃豆、香蕉及煙草等植物中均發(fā)現(xiàn)了該水解酶. 另外，通過對微生物的研究也發(fā)現(xiàn)，該酶廣泛存在于微生物體內，其主要微生物來源有Agrobacteriumradiobacter、Arthrobacterspp.、Aspergillusniger、Bacillusmegaterium、BeauveriaSulfurescens、Chryseomonasluteola、Corynebacteriumspp.、Mycobacteriumparaffinicum、Methylobacteriumspp.、Norcadiaspp.、Pseudomonasspp.、Rhodococcuserythropolis、Rhodosporidiumtoluloides、Rhodotorulaglutinis、Streptomycesantibioticus、Trichosporonloubierii、Xanthophyllomycesdendrorhous等[18].

自HECHTBERGER等[19]報道了利用來源于紅球菌的環(huán)氧化物水解酶選擇性地催化1,2-環(huán)氧庚烷不對稱水解生成相應的R-二醇后，在水相中不同來源的環(huán)氧化物水解酶催化不同結構的環(huán)氧化物不對稱水解的研究相繼出現(xiàn). 21世紀初，我國的研究人員在產(chǎn)環(huán)氧化物水解酶的菌株篩選方面做了大量工作. 曲音波課題組從全國多地收集到的長期被石油、動物油或植物油污染的土壤或水樣中分離得到一株產(chǎn)環(huán)氧化物水解酶的類產(chǎn)堿假單胞菌，該菌可用于拆分苯基縮水甘油酸乙酯. 研究發(fā)現(xiàn)，在添加吐溫60的反應體系中，該菌全細胞催化的底物濃度可達78 mmol/L，且產(chǎn)物的光學純度達98%，但產(chǎn)率較低(33%)[20-21]. 孫萬儒課題組從土壤樣品中篩選出一株產(chǎn)環(huán)氧化物水解酶的黑曲霉菌株[22]，利用該菌株催化外消旋環(huán)氧苯乙烷不對稱水解，得到(R)-1,2-苯基乙二醇的光學純度大于99%，但隨著反應時間的延長，底物的非酶水解嚴重，導致產(chǎn)物的光學純度明顯下降[23]. 許建和課題組從土壤中篩選出一株產(chǎn)環(huán)氧化物水解酶的巨大芽孢桿菌，該菌具有較高的對映體選擇性，可選擇水解(R)-縮水甘油苯基醚，對映體選擇率E值高達47.8%，可選擇性地水解(R)-縮水甘油苯基醚[24]，后期他們還報道了綠豆中存在環(huán)氧化物水解酶的事實[25]. 國外同樣也對產(chǎn)環(huán)氧化物水解酶的菌株進行了篩選研究. DUARAH等[26]從土壤里篩選到一株塔賓曲霉，該菌株具有反應速度快、選擇性高等優(yōu)點，反應45 min可將外消旋的環(huán)氧苯乙烷水解成光學純度達97%的(R)-苯乙二醇，且底物的轉化率高達99%. 同時還研究了苯環(huán)上的氯取代對反應的影響，結果表明，取代后底物的轉化率不受影響，但是產(chǎn)物的光學純度以及反應時間受到嚴重影響.

2 環(huán)氧化物水解酶的結構與催化

目前，已發(fā)現(xiàn)的環(huán)氧化物水解酶可以分為以下幾類：可溶性環(huán)氧化物水解酶、微粒體環(huán)氧化物水解酶、保幼激素環(huán)氧化物水解酶、膽固醇環(huán)氧化物水解酶、羥環(huán)氧烯酸水解酶、白三烯A4環(huán)氧化物水解酶以及檸檬烯環(huán)氧化物水解酶7個亞家族[27-29].

對比不同來源環(huán)氧化物水解酶的蛋白氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，不同來源酶的氨基酸序列相似程度很高，且基本上都屬于α/β折疊型的水解酶[30]，它們具有三位一體的結構[31]，1個電荷中繼網(wǎng)和親核基團共同組成了催化三聯(lián)體. 活性位點由核心結構和帽子結構組成，核心結構由2個天冬氨酸殘基和1個組氨酸殘基構成[32-33]. 目前接受程度較高的催化機理為：先由酶的帽子結構中2個酪氨酸殘基將環(huán)氧化物中的1個O原子質子化，再經(jīng)酶的1個天冬氨酸殘基進攻該部分被質子化的環(huán)氧化物，形成1個共價結合的中間體，然后落入酶活性中心的1個水分子受到組氨酸殘基和另一個天冬氨酸殘基的活化，失去1個質子，形成1個羥基，該羥基進而進攻乙二醇-單酯-酶中間體，酪氨酸被還原，環(huán)氧化物被水解生成二醇[33]. 然而，不同類型和不同來源的環(huán)氧化物水解酶的蛋白相對分子質量大小卻明顯不同，哺乳動物的可溶性環(huán)氧化物水解酶是由2個62 kDa單體結構組成的同型二聚體，而來源于植物的可溶性環(huán)氧化物水解酶一般以單體或二聚體蛋白的形式存在，其相對分子質量為35 kDa左右[33-34]. 微粒體環(huán)氧化物水解酶的相對分子質量約50 kDa[35]，而羥環(huán)氧化物烯酸水解酶和白三烯A4環(huán)氧化物水解酶的相對分子質量分別為53 kDa和70 kDa.

環(huán)氧化物水解酶可以高效催化環(huán)氧化物水解并生成鄰二醇，這也引起了研究人員對該酶催化反應條件的探索. 婁文勇課題組先后研究了來源于綠豆和黃豆的環(huán)氧化物水解酶的催化特性[32,36-40]. 在2012年，該課題組陳文靜[32]利用從綠豆中提取的環(huán)氧化物水解酶催化環(huán)氧苯乙烷. 由于環(huán)氧苯乙烷在水相中(特別是在高底物濃度情況下)易水解的性質，建立了在磷酸緩沖液體系中，底物濃度為5 mmol/L的綠豆環(huán)氧化物水解酶高效催化環(huán)氧苯乙烷的反應體系. 在這個體系里，催化終止時可獲得(R)-1,2-苯乙二醇的對映體過量率高達92.6%，且產(chǎn)率高達47.6%. 為解決水相體系中催化反應時底物濃度較低的問題，隨后研究了在有機溶劑-緩沖液雙相反應體系中綠豆環(huán)氧化物水解酶催化環(huán)氧苯乙烷，選取6種有機溶劑構建雙相催化體系，分別是乙酸乙酯、三氯甲烷、環(huán)己烷、正己烷、辛烷和癸烷. 采用這6種有機溶劑-緩沖液雙相反應體系，利用綠豆環(huán)氧化物水解酶催化環(huán)氧苯乙烷生成(R)-1，2-苯乙二醇，對比研究了這6種有機溶劑體系中反應的對映體過量率、產(chǎn)率以及有機溶劑對酶活性的影響. 結果表明，乙酸乙酯和三氯甲烷對綠豆環(huán)氧化物水解酶的毒性較大，易使酶失活. 進一步研究底物和產(chǎn)物在雙相體系的分配系數(shù)發(fā)現(xiàn)，所選取的有機溶劑對底物都具有較好的萃取效果，反應體系的底物濃度得到了一定程度的提高，表明在所選取的有機溶劑-緩沖液體系中可以有效解除底物對酶的毒性. 綜合酶在6種雙相反應體系中的催化結果以及底物的分配情況，最終確定正己烷-緩沖液體系為進一步研究的催化反應體系. 經(jīng)過催化反應條件的優(yōu)化后，最終底物濃度有效提高4倍，且產(chǎn)率和對映體過量率也有提高，分別為49.2%和94.3%.

離子液體作為一種替代有機溶劑的綠色溶劑，具有低毒、難揮發(fā)、呈液態(tài)的溫度范圍大、生物相溶性好的特點，在催化領域表現(xiàn)出較好的應用前景. 用疏水性離子液體替代有機溶劑，構成疏水性離子液體-緩沖液雙相體系，研究綠豆環(huán)氧化物水解酶在此類雙相體系中的催化性能. 在所研究的9種疏水性離子液體中，C4MIM·PF6對綠豆環(huán)氧化物水解酶的生物相容性最好，可以較好地保留酶的活性，經(jīng)過處理后，活性仍保留85.5%. 進一步優(yōu)化該反應體系的反應條件后，所得產(chǎn)物的產(chǎn)率和對映體純度均有提高，分別為49%和97%，證明離子液體可用于催化體系中提高環(huán)氧化物水解酶的催化性能[36]. 進一步研究發(fā)現(xiàn)，親水性離子液體可以促進環(huán)氧化物水解酶的活力，其中C2OHMIM·BF4和C2OHMIM·TfO對該酶的毒性較低，且C2OHMIM·BF4能有效提高酶的催化速度[32].

酶的固定化技術有利于提高酶的穩(wěn)定性，固定化酶可以重復使用并容易與反應體系分離，降低了產(chǎn)物的純化難度. 本課題組于春楊等[37-38]使用戊二醛作交聯(lián)劑，形成綠豆環(huán)氧化物水解酶交聯(lián)聚體，該酶聚集體的酶活性回收率達到92.5%，且重復使用4次后，仍保留有原始酶活性的85%以上. 進一步研究酶聚集體在正己烷-緩沖液雙相體系中催化環(huán)氧苯乙烷發(fā)現(xiàn)，該酶聚集體的活性明顯較游離酶的活性高，大大縮短了催化的時間(由20 h縮短至6 h)，這也說明該種固定化方法能有效提高酶的穩(wěn)定性. 黃豆也被證實具有環(huán)氧化物水解酶，本課題組岳東梅等[39-40]從黃豆中提取出環(huán)氧化物水解酶(SEH)，并成功地將其固定在金屬有機框架材料UiO-66-NH2中，制備出SEH@UiO-66-NH2固定化酶. 考察在水相緩沖液體系，添加深度共熔溶劑作助溶劑時發(fā)現(xiàn)，SEH@UiO-66-NH2在含氯化膽堿：尿素的緩沖液體系中，利用1,2-環(huán)氧辛烷作底物可選擇性制備(R)-1,2-辛二醇，產(chǎn)率和產(chǎn)物光學純度可以達到40.29%和80.52%.

3 環(huán)氧化物水解酶的克隆表達及其突變

環(huán)氧化物水解酶因其野生菌株表達量較低、菌體培養(yǎng)周期長、或從其它來源提取酶的過程復雜且酶的純度較低等缺點，不少研究人員將環(huán)氧化物水解酶的基因在大腸桿菌中進行克隆表達，以獲得高表達環(huán)氧化物水解酶的工程菌，并可使工程菌內的目的基因進一步突變，從而得到更高效的環(huán)氧化物水解酶. 另外，又因環(huán)氧化物水解酶只能高選擇性水解對映體中的一種環(huán)氧化物，這樣會造成產(chǎn)物的理論產(chǎn)率不超過50%的現(xiàn)象. 為了進一步提升產(chǎn)物的產(chǎn)率，研究人員將可以水解不同構型底物但能生成相同構型產(chǎn)物的環(huán)氧化物水解酶的基因克隆表達于同一工程菌中，以提高產(chǎn)物的產(chǎn)率，突破理論上產(chǎn)率不超過50%的限制.

HWANG等[41]報道了一株產(chǎn)環(huán)氧化物水解酶的Caulobactercrescentus菌株，該菌株所產(chǎn)生的環(huán)氧化物水解酶能將外消旋的對氯環(huán)氧苯乙烷不對稱水解成R型的鄰二醇，將該環(huán)氧化物水解酶的基因克隆表達于其它細胞中，該細胞在產(chǎn)物濃度大于40 mmol/L時，存在較明顯的產(chǎn)物抑制作用. 后續(xù)又進行了一個制備級的規(guī)模實驗，在底物質量濃度為16.8 g/L時，催化終止時可獲得高純度、高產(chǎn)率的產(chǎn)物，對映體純度為95%，產(chǎn)率為72%. 賀婉紅[42]對來源于綠豆環(huán)氧化物水解酶的基因進行克隆表達，先提取出編碼該酶的mRNA，再通過反轉錄合成cDNA，然后擴增成雙鏈的DNA，將該DNA在大腸桿菌中進行克隆表達，獲得了產(chǎn)綠豆環(huán)氧化物水解酶的工程菌株，同時評價了該工程菌株產(chǎn)的綠豆環(huán)氧化物水解酶的酶學性質. 該酶的米氏常數(shù)為2.05 mmol/L，最大反應速率為14.8 μmol/(min·mg). JIN等[43]發(fā)現(xiàn)一株Agrobacteriumradiobacter菌株，該菌株具有編碼環(huán)氧化物水解酶的基因，所編碼的水解酶能高效且特異性地拆分外消旋3-氯-1,2-環(huán)氧丙烷. 通過將該環(huán)氧化物水解酶的目的基因成功克隆表達于大腸桿菌，進一步研究了重組工程菌動力學拆分3-氯-1,2-環(huán)氧丙烷的性能. 結果表明，重組后的大腸桿菌對3-氯-1,2-環(huán)氧丙烷的兩種對映體均有較好的水解能力，但由于S構型的對映體對酶的親和力較強，催化過程會優(yōu)先水解S型的環(huán)氧化物對映體，從而保留R型的環(huán)氧化物對映體. 然而，當S型底物被消耗殆盡后，R型的環(huán)氧化物水解加快，導致R型底物的產(chǎn)率下降，因此催化時間的控制對該拆分反應尤為重要. 此外，由于底物和產(chǎn)物的抑制作用，當?shù)孜餄舛葹?84 mmol/L時，盡管延長反應時間，最終獲得的R型3-氯-1,2-環(huán)氧丙烷的光學純度也明顯下降. 在所驗證的重組菌菌量的范圍內，光學純度不超過61%. 為進一步提升底物濃度，通過分批添加底物和使用雙相反應體系來降低底物的抑制作用. 在分批添加底物時，最終添加底物的嘗試濃度為448 mmol/L，可獲得目標產(chǎn)物的光學純度超過80%，而在環(huán)己烷-緩沖液雙相反應體系中，底物的最終添加濃度為512 mmol/L，目標產(chǎn)物的光學純度大于98%.

來源于BacillusmegateriumECU1001的環(huán)氧化物水解酶的結構與其它來源的水解酶的結構相似，均含有α和β結構，且含有1個覆蓋活性位點的蓋子. KONG等[44]成功將該菌株的環(huán)氧化水解酶的目的基因克隆表達于大腸桿菌，但來源于該野生菌株的環(huán)氧化物水解酶的產(chǎn)物釋放通道較窄，限制了酶的催化速率. 通過對釋放通道附近的氨基酸(如第128位和第145位氨基酸)進行突變，有效拓寬了產(chǎn)物的釋放通道，提升了酶的催化速率.

環(huán)氧化物選擇性水解或拆分受限于理論產(chǎn)率不超50%，通過將選擇性不同的兩種或多種酶克隆表達于1個工程菌中，可有效突破這一限制. KIM等[45]通過將來源于新月柄桿菌和鯔魚的環(huán)氧化物水解酶基因同時克隆表達于大腸桿菌中，從而實現(xiàn)了對外消旋環(huán)氧苯乙烷的催化水解，生成R型鄰二醇的產(chǎn)率超過50%，產(chǎn)物光學純度高達94%，且底物濃度較高，達到50 mmol/L. CAO等[46]將來源于土豆和Agrobacteriumradiobacter的環(huán)氧化物水解酶的基因表達于大腸桿菌中，該菌可將廉價易得的環(huán)氧苯乙烷選擇性地水解為(R)-1，2-型苯乙二醇，在底物濃度為5 mmol/L時，其轉化率高達100%且產(chǎn)物的光學純度高達98%.

4 結論與展望

環(huán)氧化物水解酶的來源廣泛，普遍存在于自然界的植物和微生物中，較易獲得. 在水相和非水相反應體系中(如：有機溶劑-緩沖液雙相體系、含離子液體反應體系等)，環(huán)氧化物水解酶均表現(xiàn)出優(yōu)異的催化選擇性，且酶催化三聯(lián)體結構清晰. 但是，由于環(huán)氧化物難溶于水或易水解的性質，限制了該催化反應在水相體系中的應用，而在非水相反應體系中催化環(huán)氧化物水解可有效克服這些問題，提升催化的效率. 分子生物學技術的應用促進了環(huán)氧化物水解酶的研究進展，其可以用來獲得不同來源的環(huán)氧化物水解酶，研究酶的酶學性質，以及對自然來源酶的改造，獲得更加高效的環(huán)氧化物水解酶或重組工程菌.

探索綠色且有利于環(huán)氧化物溶解的反應介質是建立高效催化環(huán)氧化物反應體系的關鍵一環(huán)，深度共熔溶劑也已證明可用于土豆環(huán)氧化物水解酶的催化反應，提高酶對底物的選擇性，但其它來源的環(huán)氧化物水解酶在該類介質中反應的研究并不多. 隨著生物技術的發(fā)展，利用基因工程技術改造原有的環(huán)氧化物水解酶，提升其催化的選擇性、活力以及底物的耐受力，也逐漸成為主要發(fā)展趨勢.

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Research Progress on Epoxide Hydrolase

LOU Wenyong1,2*, ZHAO Ying1,2, PENG Fei1,2, ZONG Minhua1,2

(1. Laboratory of Applied Biocatalysis, School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China; 2. Guangdong Province Key Laboratory for Green Processing of Natural Products and Product Safety, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Epoxide hydrolases can highly and selectively catalyze epoxides to chiral diols, which is an effective way to synthesize chiral diols. This article introduces the structure, functions, sources and mechanism of catalysis of this enzyme. The research on the hydrolyzation of epoxides by epoxide hydrolases, the enzyme cloning and expression in other bacteria are summarized.

hydrolase;epoxide;chiral diol;catalysis

2017-10-13 《華南師范大學學報(自然科學版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國家自然科學基金項目(21676104,21376096)

*通訊作者:婁文勇，教授，Email:wylou@scut.edu.cn.

Q556.9

A

1000-5463(2017)06-0001-06

【中文責編：譚春林 英文審校：李海航】