奶牛乳腺免疫學研究進展

劉燕霏，楊建德

近年來我國奶牛業(yè)有了長足的發(fā)展，已成為畜牧業(yè)的重要組成部分。制約我國奶業(yè)發(fā)展的因素有奶牛品種、飼草飼料結(jié)構(gòu)、原奶質(zhì)量及飼養(yǎng)管理水平等。主要因素涉及養(yǎng)殖工藝粗放，優(yōu)質(zhì)飼草匱乏，疫病防制體系薄弱，乳品加工技術(shù)落后，牛奶質(zhì)量監(jiān)控體系不健全等諸多方面。奶牛乳房炎是奶牛乳腺組織的炎癥，是一個世界性難題，它的發(fā)生和奶牛遺傳因素、病原微生物、環(huán)境因素及管理因素等密切相關(guān)[1-2]。乳房炎是奶牛最為常見，也是造成奶牛飼養(yǎng)經(jīng)濟損失最嚴重的疾病之一，可直接影響奶汁品質(zhì)，導致產(chǎn)奶量下降，乳汁稀薄，品質(zhì)降低，造成奶牛業(yè)較大的經(jīng)濟損失。如何控制奶牛乳房炎是擺在全球各國專家面前的課題。研究和預防奶牛乳房炎涉及遺傳、病原微生物及環(huán)境管理等諸多方面，本文結(jié)合近些年這方面的文獻，重點闡述乳腺的結(jié)構(gòu)與免疫學在控制乳房炎方面的作用機制。

1 奶牛乳腺組織結(jié)構(gòu)

不同品種的奶牛，乳房大小可存在差異。乳房的左右兩部分被中間韌帶隔開，而前后兩部分被分隔得更加明顯。奶牛乳房一般由4個乳區(qū)構(gòu)成，一個乳區(qū)中產(chǎn)生乳汁不能轉(zhuǎn)移到另外一個乳區(qū)中。每個乳區(qū)對應一個乳頭，每個區(qū)包括乳腺分泌細胞、腺泡、乳導管、乳池等[3]。乳腺由泌乳組織和結(jié)締組織組成。泌乳組織的數(shù)量，即泌乳細胞的數(shù)量，是制約產(chǎn)奶能力的因素之一，但是乳房的大小并不一定和產(chǎn)奶量成正比，因為乳房除乳腺外，還可能存在有大量的結(jié)締組織。泌乳細胞呈單層排列，位于類似于氣泡的球形結(jié)構(gòu)的基膜上，氣泡直徑約為50～250 mm，多個氣泡就可以組成類似于肺泡的小葉結(jié)構(gòu)。合成的乳汁儲存在氣泡、泌乳管、乳房和乳池中。乳頭由乳池和乳導管組成，乳池和乳導管匯合處有6～10條縱向的褶皺形成所謂的病原體屏障（稱之為Furstenberg’s rosette）來抵御病原菌的入侵。乳導管由很多縱向或環(huán)狀的平滑肌纖維包圍，平滑肌纖維的作用是保證非擠奶期間乳導管處于關(guān)閉狀態(tài)，乳導管帶有角蛋白也能起到免受病原體細菌感染的作用。乳腺特別是乳頭上有密集的神經(jīng)末梢，對幼崽的吮吸或接觸等比較敏感。乳房也有神經(jīng)組織，這些神經(jīng)組織與血液循環(huán)系統(tǒng)和乳導管的平滑肌相連，但是沒有直接控制泌乳組織的神經(jīng)。乳腺有密集的動脈和靜脈系統(tǒng)，不斷地為細胞提供合成乳汁的養(yǎng)分。每1 L牛奶需要流過乳房的血液約為500 L，乳房淋巴系統(tǒng)負責清除外來雜質(zhì)殘留，也可啟動免疫反應來防止細菌感染[4-6]。

2 固有免疫

2.1 屏障結(jié)構(gòu)

乳腺組織因具有獨特的生理構(gòu)造，起到抗感染保護作用。乳頭管括約肌和乳頭管內(nèi)上皮細胞分泌的角蛋白能阻止病原菌粘附在上皮細胞表面，還可分泌抗菌活性的蛋白質(zhì)和有機酸類，如棕櫚酸、豆蔻酸、亞油酸等脂肪酸具有抗菌作用，因而構(gòu)成了乳腺抗感染的第一道防線[2]。同時，乳頭管周圍括約肌在擠奶間隔期處于收縮狀態(tài)，可防止病原菌入侵，并在擠奶時將乳頭管內(nèi)角蛋白上的病原菌固定在局部，在擠奶時隨角質(zhì)層脫落被擠出。

2.2 乳汁中抗微生物物質(zhì)

乳汁中含有的補體蛋白、溶菌酶、乳鐵蛋白和乳過氧化物酶系統(tǒng)等抗菌活性物質(zhì)發(fā)揮保護乳腺和維持乳腺功能的重要作用。

補體是存在于血清和乳汁當中具有酶活性的一組不耐熱的蛋白質(zhì)，主要由肝細胞、單核細胞或組織中的巨噬細胞等合成。一些病原微生物成分可直接激活補體替代途徑，達到溶解病原微生物的目的。此外補體還可以起到調(diào)理作用及介導炎癥反應，補體活化后釋放的小片段可吸引吞噬細胞抵達感染部位。在抵抗大腸桿菌性乳房炎的炎癥中，補體發(fā)揮重要作用[7]。補體在健康乳汁中濃度含量較低，而炎性乳汁中補體濃度大幅提高，來共同對付入侵微生物。

溶菌酶（lysozyme）又稱胞壁質(zhì)酶（muramidase），是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。主要通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4糖苷鍵，使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細菌溶解。有研究報道，采用溶酶體轉(zhuǎn)基因到奶山羊乳腺能明顯抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長速度[8]，溶菌酶含量在臨床型乳房炎乳樣中可高達15.6 mg/mL，在亞臨床乳房炎乳樣中含量為11.2 mg/mL，而健康奶樣中含量為6.9 mg/mL[9]，這表明乳汁中溶菌酶含量與乳腺炎癥有關(guān)。

1939年，Sorensen等人在分離乳清蛋白時得到一種紅色蛋白，但至1959年Groves用色譜得到純的紅色物質(zhì)后，才確認這種紅色物質(zhì)是一種與鐵結(jié)合的糖蛋白，稱之為乳鐵蛋白 （lactoferrin，LF）。LF是乳汁中一種重要的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，是中性粒細胞顆粒中具有殺菌活性的單體糖蛋白，其分子量為80 kDa，主要由乳腺上皮細胞和白細胞表達和分泌。LF有效抑制大腸桿菌和沙門氏菌等需鐵性革蘭氏陰性菌及金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌的生長繁殖[5]。LF不僅參與鐵的轉(zhuǎn)運，而且具有廣譜抗菌、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等強大生物功能。Barreto等證實，奶牛LF能夠降低腸炎沙門氏菌對Hep-2細胞的侵襲。泌乳期LF含量低于干奶期和炎癥期，在干奶期阻止大腸桿菌侵染，起到防御作用[7]。

乳過氧化物酶（Lactoperoxidase，LP）是乳汁中抵抗病原菌的過氧化物酶，免疫學上與哺乳動物血紅素有關(guān)。LP也存在于哺乳動物的淚液和唾液中，對許多病原菌具有殺滅作用。這種酶依賴于過氧化氫（H2O2）和硫氰酸鹽（SCN）發(fā)揮作用。LP在過氧化氫作用下，催化的硫氰酸鹽（SCN-）轉(zhuǎn)換形成氧化硫氰酸鹽（OSCN）。OSCN是硫氰酸鹽的主要中間氧化產(chǎn)物，它是LP抗菌成分。LP與SCN-和OSCN合稱為LP系統(tǒng)（LP-S），LP-S是乳汁中天然的抵抗微生物物質(zhì)，可殺滅存在于乳汁的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等[5，7]。

2.3 細胞因子

在正常和乳房炎奶牛乳腺中，細胞因子微妙和敏感的變化可能促進其在乳房的健康預后診斷中的應用。有些學者推測，檢測細胞因子可能成為乳房健康的重要指標。隨著人們對牛乳腺細胞因子網(wǎng)絡和有效細胞因子診斷技術(shù)認識的深入，細胞因子的免疫治療、診斷乳腺炎的作用會進一步顯現(xiàn)。

目前，有多種乳腺細胞因子參與炎癥反應，如白細胞介素-2（IL-2）、γ-干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）和IL-6等。研究證實，乳腺內(nèi)注射的IL-2誘導血液中嗜中性粒細胞遷移至乳汁而導致乳汁中體細胞數(shù)升高；還可加速干奶期乳腺組織退化，增加IgG的局部合成能力，增強CD8+T細胞的細胞毒性，降低乳房內(nèi)感染；臨近分娩期和初乳中IL-2的活性較低，使分娩前后乳房炎的發(fā)病率大幅提高。IFN-γ是由T細胞與分裂素或抗原在免疫識別應答過程中起著重要的免疫調(diào)節(jié)作用。IFN-γ可增強乳腺吞噬細胞的生物學活性，進而有效控制乳腺炎的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ對實驗性大腸桿菌型乳房炎治療有效，單獨使用γ-干擾素或乳酸環(huán)丙沙星均對金黃色葡萄球菌型臨床乳房炎有作用，二者配合效果更好[7，9-10]。TNF-α在急性炎癥過程中產(chǎn)生，特別是大腸桿菌引起的嚴重乳腺炎乳汁和血清中表達水平很高，原因可能是由于應激引起TNF大量產(chǎn)生，進入微循環(huán)對血管內(nèi)皮細胞造成損害。TNF-α能增強部分抗生素殺傷金黃色葡萄球菌的能力，可用作抗生素的輔佐治療劑。CSF在細胞增殖和分化中起著重要作用。粒細胞-巨噬細CSF（GM-CSF）可預防乳腺內(nèi)的新型感染以及增強粒細胞的趨化性和巨噬細胞的吞噬作用。Takahashi等發(fā)現(xiàn)，重組GM-CSF在治療金黃色葡萄球菌亞臨床型乳房炎方面具有很大潛力[11]。臨床型乳房炎乳樣IL-6含量可高達18 ng/mL，亞臨床乳樣含量為30.8 ng/mL，而健康奶樣IL-6含量為5.2 ng/mL[12]，這表明IL-6在臨床和亞臨床乳房炎中可能起一定的作用。

3 適應性免疫

3.1 細胞免疫

乳腺內(nèi)部的細胞免疫防御功能廣義地講包括T細胞、巨噬細胞、NK細胞等發(fā)揮的作用。 巨噬細胞主要通過蛋白酶和活性氧吞噬和殺傷病原微生物，來維持乳腺和乳汁健康。當病原菌侵入乳腺后，乳腺巨噬細胞主要釋放前列腺素、白三烯和細胞因子等化學物質(zhì)，吸引大量多核巨細胞（PMN）進入感染部位，加劇炎性反應并中和毒性產(chǎn)物，同時在乳區(qū)周圍吞噬和消化病原菌，減少病原菌數(shù)量[4-5]。

特異性T細胞包括 CD4＋、CD8＋T細胞和γδT淋巴細胞。雖然T細胞進入乳腺是母牛對抗乳房內(nèi)入侵病原體的關(guān)鍵，但是何種淋巴細胞亞群起作用仍有待于研究。乳腺發(fā)生炎癥時，外周血中的 CD4＋T細胞占主導地位，激活其他細胞如巨噬細胞或B細胞參與免疫反應，血液中分泌修復受感染部分生長因子的 γδT細胞數(shù)量增加。但在金黃色葡萄球菌引起慢性感染的乳腺中，CD8＋T數(shù)量大于CD4＋T，因此 CD8＋T占主導作用。為了研究淋巴細胞亞群動力學，有試驗對大腸桿菌性乳房炎初產(chǎn)奶牛乳汁及血液中T淋巴細胞亞群、CD4+/CD8+比率、CD21+T細胞及淋巴細胞增殖情況進行了研究。乳腺內(nèi)接種104CFU大腸桿菌（A組）和106CFU（B組），與A組相比，在感染后6～24 h的B組更多的淋巴細胞遷移到感染區(qū)，而CD8+T是第一個被吸引至感染乳汁中的T細胞。在感染后 6～24 h B組 CD4+/CD8+比率顯著下降，CD4+/CD8+大幅下降主要因為乳汁中CD8+T細胞濃度的升高。相反，在感染后72 h，CD4+/CD8+比值增加，兩組均增加了約2倍。這一增長主要是由于CD4+T細胞濃度的增加。CD4+T細胞濃度的增加正好與乳汁的CD21+T細胞數(shù)量增加相一致。在血液和乳汁中，B組比A組CD8+T細胞的增殖快很多，這也表明大腸桿菌接種劑量的增加能夠加速CD8+細胞在炎癥區(qū)域積聚，而這些細胞是引起大腸桿菌性早期乳房炎乳腺和乳汁中主要的T細胞[13]。乳腺抗原特異性炎癥取決于CD4+分泌的IL17A和IFN-γ[14]。炎癥NK細胞介導乳腺產(chǎn)生免疫應答過程，主要起殺滅靶細胞、保護乳腺組織的作用。

3.2 體液免疫

奶牛乳腺中B細胞是參與體液免疫應答的重要成分。B細胞對復雜抗原及多種有絲分裂原的識別均需要T細胞協(xié)助?；既榉垦讜r，血液中的B細胞數(shù)量降低，而乳房淋巴結(jié)中的該細胞數(shù)量則升高，可能原因是炎癥發(fā)展過程中B細胞從血液進入乳腺和乳汁中。

3種主要免疫球蛋白 IgG、IgM和IgA，通過血液選擇性進入乳腺內(nèi)對侵入的致病菌起到重要的殺滅和抑制作用[6]?？贵w的滴度高低與奶牛的泌乳階段和乳房炎癥病程發(fā)展有關(guān)。泌乳初期免疫球蛋白濃度一般較低；接近干乳期和分娩時，乳汁中免疫球蛋白含量逐漸增加，使初乳中免疫球蛋白達到較高水平，可為新生犢牛提供早期被動保護。乳房炎發(fā)生時，乳汁中的免疫球蛋白濃度上升。健康乳汁中，IgG1調(diào)理作用較弱，不能有效發(fā)揮促進中性粒細胞對金黃色葡萄球菌的吞噬。但乳汁中IgG2的濃度會隨炎癥的發(fā)展而增加。IgM不是乳汁中抵抗病原菌的主力，僅在感染后早期存在[7]。乳汁中IgG2的含量少，但在金黃色葡萄球菌及鏈球菌感染中起調(diào)理作用。正常乳汁中IgA含量低，但能有效阻止病原黏附乳腺上皮細胞，在局部黏膜免疫應答中發(fā)揮重要作用。乳頭管黏膜和乳頭管近端產(chǎn)生的局部IgA抗體和淋巴因子均有抵抗細菌入侵的能力[3]。

4 結(jié)語

乳腺不是一個獨立的組織器官，受機體遺傳、環(huán)境及管理因素影響。鑒于奶牛乳腺獨特的解剖結(jié)構(gòu)，以及產(chǎn)生具有豐富蛋白乳汁的功能特點，使得乳腺易遭受病原菌的侵入，侵入的病原菌易于受到乳蛋白的保護而不易被機體清除。為了應付各種病原微生物入侵，乳腺首先采用固有免疫機制，如屏障結(jié)構(gòu)和重要抗微生物物質(zhì)如補體蛋白、溶菌酶、乳鐵蛋白和乳過氧化物酶系統(tǒng)等清除病原菌；必要時需要激發(fā)機體的適應性免疫如細胞免疫和體液免疫協(xié)調(diào)作用機制。

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