魚腥藻藻華水體一株溶藻菌BWFA55的鑒定及溶藻特性

范德朋，胡亞冬，楊敏志，雷明科，王 琦

魚腥藻藻華水體一株溶藻菌BWFA55的鑒定及溶藻特性

范德朋1,2，胡亞冬1,2，楊敏志2，雷明科1，王 琦3

（1. 碧沃豐生物科技 (廣東) 股份有限公司，廣東 佛山 528200；2. 碧沃豐工程有限公司，廣東 佛山 528200；3. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

【】鑒定一株魚腥藻藻華水體的溶藻菌，分析菌株的溶藻特性。從佛山近郊湖泊魚腥藻水華水體中分離到一株溶藻菌BWFA55，通過菌株生理生化鑒定和16S rDNA 基因序列分析鑒定菌種。將該菌株培養(yǎng)4 d，分析菌株的生長特征和溶藻活性。將BWFA55發(fā)酵上清液與水華魚腥藻（）共培養(yǎng)168 h，通過掃描電鏡觀察藻細(xì)胞形態(tài)。將BWFA55菌懸液接種至不同濃度的水華魚腥藻（）藻液，另按不同接種量將BWFA55接種至同濃度藻液，分析藻液濃度及接種量對溶藻效果的影響。測定BWFA55無細(xì)胞上清液、菌體懸液、菌株原發(fā)酵液的溶菌活性，分析BWFA55的主要溶藻方式。采用透析和有機(jī)溶劑萃取分離溶藻物質(zhì)，在不同溫度、pH條件下研究溶藻活性物質(zhì)的特性。經(jīng)鑒定，溶藻菌株BWFA55為地衣芽孢桿菌（）。該菌株24 h發(fā)酵液的溶藻活性最高，在接種量（體積分?jǐn)?shù)）為10%的條件下，水體中水華魚腥藻的葉綠素a（Chl-a）含量在7 d內(nèi)下降80%以上。該菌通過分泌溶藻化合物間接攻擊水華魚腥藻，使絲狀群體的藻細(xì)胞數(shù)量明顯降低，群體連接結(jié)構(gòu)被破壞。BWFA55主要的溶藻活性物質(zhì)存在于發(fā)酵上清液中，分子質(zhì)量大于3 ku，且可被乙酸乙酯萃取，在高溫下保持60%以上的溶藻率，且不受pH影響，有良好的酸堿、溫度耐受性。

水華；水華魚腥藻；芽孢桿菌；溶藻細(xì)菌

近年來，由水體富營養(yǎng)化引起的有害藻華(Harmful Algal Blooms，HAB) 時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重破壞水生環(huán)境。學(xué)界試圖理清HAB的暴發(fā)及衰退與諸如營養(yǎng)物質(zhì)、光照、溫度以及生物因素等環(huán)境條件之間的聯(lián)系[1-2]。在HAB動(dòng)態(tài)發(fā)展過程中往往伴隨明顯的細(xì)菌群落交替[3-6]，尤其是紅細(xì)菌目、黃桿菌目和假單胞菌目等通常與藻華有關(guān)[5,7-8]。這些細(xì)菌促進(jìn)或抑制HAB相關(guān)物種的生長，通過共生或相互競爭方式調(diào)節(jié)藻華形成、持續(xù)時(shí)間和衰退[7,9-11]。在藻華衰退階段細(xì)菌豐度往往增加[12]，表明部分細(xì)菌可能介導(dǎo)HABs的周期性交替，尤其在營養(yǎng)資源有限時(shí)，甚至導(dǎo)致藻類細(xì)胞死亡[7]。雖已證實(shí)溶藻細(xì)菌與目標(biāo)藻類的共存現(xiàn)象[13]，但細(xì)菌調(diào)節(jié)HABs的動(dòng)力學(xué)過程以及相應(yīng)的細(xì)胞和分子機(jī)制仍有待探索[8]。

溶菌細(xì)菌與有害藻類間的關(guān)系極為復(fù)雜[14-15]，其在調(diào)節(jié)有害藻類生長、代謝和毒素產(chǎn)生方面有潛在作用[14,16]，最突出和最重要的作用是抑制或溶解有害藻類[17]。目前已分離大量的溶藻細(xì)菌，多屬于假交替單胞菌屬（）、交替單胞菌屬（）、弧菌屬（）、噬細(xì)胞菌屬（）和腐螺旋菌屬（）。目前，有害藻類主要是甲藻、硅藻和藍(lán)藻[14-15,18]。目前，已提出幾種物理和化學(xué)方法應(yīng)對HAB的暴發(fā)，但這些方法不僅代價(jià)高昂，且可能對水生生態(tài)系統(tǒng)有害[19]。以溶藻微生物為代表的生物防治方法有經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、物種特異性和環(huán)境友好性等特點(diǎn)[20-21]。本研究從佛山南海區(qū)近郊湖泊的魚腥藻水華中分離鑒定出一株溶藻細(xì)菌，并研究該溶藻細(xì)菌的溶藻效果及其溶藻機(jī)理，為藍(lán)藻水華的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種、菌種及其培養(yǎng)條件

水華魚腥藻（）FACHB-245取自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫。藻類細(xì)胞用無菌BG11培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司），在光暗周期為12 hL/12 hD、照度為2 000 lx、溫度為（30±1）℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)菌株BWFA55分離自佛山潭邊村有魚腥藻水華的景觀池（23.174°N，113.126°E）。用新鮮的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基[Nutrient Broth (NB)，廣東環(huán)凱生物科技有限公司]與15 mg/mL的瓊脂制成固體斜面培養(yǎng)基，將BWFA55接種于固體培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)1 d得到菌種斜面。從新制備的菌種斜面上挑取菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于恒溫震蕩箱（30℃、150 r/min）中培養(yǎng)，得到該菌株的發(fā)酵液。

1.2 細(xì)菌菌株鑒定

取1 mL培養(yǎng)16 ～ 20 h的待測菌液，采用酚氯仿法提取純菌總DNA。以所提取DNA作為模板，用16S rDNA通用引物對細(xì)菌基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其上游引物為27F (5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′)，下游引物為1492R (5′-GGTTACCTT GTTACGACTT-3′)。擴(kuò)增條件：95℃5 min；95℃40 s，55℃1 min，72℃1 min，循環(huán)25次；72℃10 min。PCR產(chǎn)物在約1 500 kb處有條帶者為陽性。將陽性樣品送至廣州艾基生物科技有限公司測序。用Chromas判斷16S rDNA測序結(jié)果的序列有效長度，并通過BioEdit將序列剪切和拼接完整。將拼接后序列通過Eztaxon網(wǎng)站進(jìn)行同源性分析。下載與待測菌株最相近的模式菌株16S rDNA序列，利用ClustX和MEGA6軟件對待測菌株序列及下載序列進(jìn)行對齊剪切[22]，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[22]，用重樣抽樣法（Bootstrap）計(jì)算出進(jìn)化樹各分支置信度。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹確定待測菌株的進(jìn)化位置。

用API 50 CHB/E試劑盒（法國生物梅里埃）對BWFA55進(jìn)行不同碳源的生化分析。培養(yǎng)期間，糖發(fā)酵產(chǎn)酸，pH下降，因而以指示劑顏色變化表示菌株對不同碳源的利用情況，組成該菌株的生化圖譜，導(dǎo)入bioMerieux軟件進(jìn)行菌株鑒定或分型。

1.3 藻密度與Chl-a濃度的相關(guān)性分析

取長勢良好的水華魚腥藻，用培養(yǎng)基BG11配制成5個(gè)不同水平倍增藻密度的藻液，分別采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法和Chl-a含量測定法測定藻細(xì)胞的豐度。鑒于水華魚腥藻藻體為單一絲狀，或不定形膠質(zhì)體，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)方法易造成較大的偶然誤差，根據(jù)以上2種測定方法的結(jié)果，以細(xì)胞密度對Chl-a含量進(jìn)行線形回歸分析，以探究藻密度與Chl-a濃度的相關(guān)性。

1.4 細(xì)菌菌株的生長特性和溶藻活性

BWFA55按照1.1節(jié)菌種培養(yǎng)方法培養(yǎng)4 d。用紫外-可見分光度計(jì)定時(shí)測量600 nm的光密度(600 nm)，監(jiān)測細(xì)菌生長。

采集BWFA55各階段生長的菌液，按體積分?jǐn)?shù)10%接種到Chl-a質(zhì)量濃度為（3 178.16±146.92）μg/L的水華魚腥藻培養(yǎng)液中，按照1.1節(jié)水華魚腥藻培養(yǎng)方式進(jìn)行光照培養(yǎng)，定期取培養(yǎng)液，用熱乙醇法提取Chl-a，測定663、647、630、750 nm處光密度值，計(jì)算Chl-a濃度，并根據(jù)下式計(jì)算溶藻率（%）。以培養(yǎng)7 d的溶藻率表征溶藻活性，并以相同體積NB作為對照。

溶藻率= (0-ρ) /0， （1）

式中，ρ和0分別為時(shí)間和初始Chl-a質(zhì)量濃度。

后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)均以培養(yǎng)24 h的發(fā)酵液，用BG11培養(yǎng)液將發(fā)酵液稀釋至(600 nm) 為1.0，作為統(tǒng)一的菌濃度。BWFA55上清液則是將上述稀釋后的發(fā)酵液以10 000 r/min、室溫條件離心10 min，收集離心上清液制得。

1.5 藻濃度及接種量對溶藻效果的影響

按1.4節(jié)方法配制(600nm)為1.0的BWFA55懸液。取培養(yǎng)至穩(wěn)定期的水華魚腥藻(培養(yǎng)條件見1.1節(jié))，以BG11培養(yǎng)液依次稀釋成（710.89±27.13）、（1 440.84±77.76）、（2854.77 ± 120.50）、（7139.62 ± 90.22）、（13 772.57 ± 571.70）μg/L，分別記為I、II、III、IV、V組。各組分別按體積分?jǐn)?shù)10%接種BWFA55懸液；另取BWFA55懸液按體積分?jǐn)?shù)1%、5%、10%、20%的接種量添加至對數(shù)生長期的水華魚腥藻培養(yǎng)液 [初始Chl-a質(zhì)量濃度為（965.00 ± 9.81）μg/L] 中。按照1.4節(jié)方法測試各組溶藻活性。

1.6 BWFA55的溶藻方式

BWFA55按照1.1節(jié)菌種培養(yǎng)方法培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心20 min，收集上清液和沉淀。離心上清液用0.22 μm濾膜過濾收集無細(xì)胞上清液。沉淀用BG11培養(yǎng)液重懸得到細(xì)菌懸液。按照1.4節(jié)的方法分別測定發(fā)酵液、無細(xì)胞上清液、菌體懸液、NB和BG11培養(yǎng)基的溶藻活性。其中NB組作為控制對照組， BG11組作為空白對照。每組設(shè)3個(gè)平行。溶藻活性測試的初始藻細(xì)胞Chl-a質(zhì)量濃度為(968.69 ± 21.24) μg/L。比較BWFA55發(fā)酵液及其無細(xì)胞上清液和細(xì)菌菌體的溶藻活性，以判斷菌株BWFA55的主要溶藻方式是產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，還是微生物與藻競爭營養(yǎng)或者侵染破壞藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.7 BWFA55上清液作用下的藻細(xì)胞形態(tài)觀察

將溶藻菌BWFA55上清液按體積比10%加至水華魚腥藻藻液中，加入等體積NB培養(yǎng)基組為空白對照組，每組樣本設(shè)置3個(gè)平行，按1.1節(jié)藻培養(yǎng)方式培養(yǎng)168 h后取樣，以10 000 r/min、室溫條件離心10 min，收集細(xì)胞，用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）洗滌3次，重懸于體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中，置于4℃下12 h以上。以10 000 r/min、室溫條件離心10 min，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，分別在體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、90%、95%、100%乙醇，以及乙醇、叔丁醇體積比為2∶1、1∶1、1∶2的溶液中依次脫水3次，每次脫水10 min。置于4 ℃下12 h以上，用真空冷凍干燥機(jī)干燥樣品。將樣品表面鍍金，于掃描電鏡下觀察藻細(xì)胞形態(tài)。

1.8 BWFA55上清液的溶藻穩(wěn)定性測定

按1.4方法制備的BWFA55上清液在-40、0、40、60、80和100水浴2 h，同時(shí)用高壓滅菌鍋在121℃高溫處理2 h，恢復(fù)至室溫 (25℃)。用2 mol/L的HCl或NaOH將BWFA55上清液的pH值調(diào)整為4、5、6、7、8、9、10和11，在室溫下維持2 h，調(diào)整為pH 7.2 (原pH值)。所有處理的上清液均以體積分?jǐn)?shù)10%接種到水華魚腥藻藻液中，按1.7方法測定其溶藻活性。NB經(jīng)與BWFA55上清液相同的處理后作為對照。

1.9 溶藻物質(zhì)的乙醇沉淀、萃取及透析

取按1.4節(jié)方法制備的BWFA55上清液50 mL，加入150 mL無水乙醇，常溫下靜置10 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心20 min，收集上清液和沉淀。取離心的上清液，經(jīng)65℃真空旋蒸濃縮至50 mL，重復(fù)上述加乙醇、靜置、離心和真空旋蒸濃縮的步驟3次。濃縮液繼續(xù)真空蒸發(fā)至干后，用少量蒸餾水溶解殘留固體，得溶解相。將上述各沉淀用蒸餾水溶解后合并，經(jīng)65 ℃真空蒸發(fā)掉殘留的乙醇，得沉淀相。用無菌水定容到相同體積，采用1.4的方法測定比較兩相的溶藻效果，測試的初始Chl-a質(zhì)量濃度為（3 022.90 ± 234.12）μg/L。

將BWFA55上清液冷凍干燥，依次加入一倍體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，反復(fù)萃取3次，每次靜置30 min，分別收集水相與有機(jī)相，經(jīng)65℃真空旋蒸濃縮，用無菌水定容至原體積，采用1.4節(jié)方法測定溶藻效果。將乙酸乙酯萃取得到的溶藻物質(zhì)于100 ～ 500 u（截留物質(zhì)分子質(zhì)量）的透析袋中除鹽，轉(zhuǎn)入3 ku的透析袋中，于20倍體積的BG-11緩沖液中，震蕩透析3 h，連續(xù)3 ～ 5次，合并透析液，將100 ～ 500 u和3 ku兩次透析的透析液分別濃縮，采用1.4節(jié)方法測定溶藻效果。

1.10 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2013、SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均用單因素方差分析 (One-way ANOVA) 方法。用GraphPad Prism 8.0.2繪圖。

2 結(jié)果

2.1 溶藻細(xì)菌的鑒定

菌株BWFA55經(jīng)16S rDNA序列擴(kuò)增，獲得1 451 bp的片段。將BWFA55 16S rDNA基因序列與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性檢索，所得鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）顯示，BWFA55與地衣芽孢桿菌（）在同一分支，自展值為96，結(jié)果可靠。與BWFA55親緣關(guān)系最近的是F 6，相似性為99.85%。將49種碳源利用結(jié)果（表1）與梅里埃的API芽孢桿菌鑒定數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果表明BWFA55為地衣芽孢桿菌，同源性為99.20%。

圖1 基于16S rDNA序列的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 菌株BWFA55的碳源利用結(jié)果

說明：-，陰性；+，陽性。

Notes: -, negative; +, positive.

2.2 藻密度與Chl-a濃度的相關(guān)性

圖2顯示，藻密度與Chl-a濃度的線性回歸關(guān)系良好（2= 0.997 3），故以Chl-a濃度表征藻細(xì)胞生物量，通過計(jì)算Chl-a濃度變化表征溶藻率。

2.3 細(xì)菌菌株的生長特性和溶藻活性

BWFA55的生長曲線（圖3(A)）顯示，溶藻菌在接種24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。不同發(fā)酵時(shí)間BWFA55發(fā)酵液溶藻活性的結(jié)果表明，各時(shí)間段的發(fā)酵液在與水華魚腥藻共培養(yǎng)7 d后均表現(xiàn)出溶藻活性（圖3(B)），且發(fā)酵24 ～ 48 h的發(fā)酵液溶藻效果最佳，為88.44% ± 1.29%和83.32% ± 3.00%，兩者間無顯著性差異，發(fā)酵時(shí)長超過48 h時(shí)，溶藻活性明顯下降（＜0.05），96 h時(shí)為58.65% ± 4.78%。

圖2 水華魚腥藻細(xì)胞密度與質(zhì)量Chl-a濃度之間的關(guān)系

Fig. 2 Relationship between algal density and Chl-a mass concentration

凡含一個(gè)相同字母則表示差異不顯著（P > 0.05）

2.4 BWFA55上清液作用下藻細(xì)胞的形態(tài)變化

掃描電鏡（SEM）觀察結(jié)果（圖4）顯示，正常水華魚腥藻細(xì)胞腰鼓形，單一絲狀體，表面平滑，細(xì)胞完整（圖4(A、B、C)）。與BWFA55共培養(yǎng)168 h后，藻細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。絲狀群體的藻細(xì)胞數(shù)量明顯降低，群體連接結(jié)構(gòu)被破壞（圖4(D、E)），細(xì)胞表面皺縮，細(xì)胞壁下陷，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)含物外溢（圖4(F、G、H、I)）。

A – C，正常藻細(xì)胞；D – I，共培養(yǎng)168 h后的藻細(xì)胞。

2.5 BWFA55發(fā)酵液接種量及藻初始濃度對溶藻效果的影響

圖5顯示，接種量1%（體積分?jǐn)?shù)）處理組藻細(xì)胞Chl-a濃度變化與空白組（CK）相近，在7 d時(shí)，兩者Chl-a質(zhì)量濃度分別為（3 472.59 ± 116.7）μg/L和（4 124.56 ± 179.38）μg/L，1%處理組有一定抑制作用；接種量5%、10%、20%處理組藻細(xì)胞Chl-a濃度前2 d變化趨勢與對照組相近，3 d后有明顯抑制作用，共培養(yǎng)7 d時(shí)Chl-a質(zhì)量濃度從 (965.76 ± 11.15) μg/L分別降至 (197.71 ± 52.73)、(74.35 ± 21.32)、(97.33 ± 15.79) μg/L，溶藻效果顯著（< 0.05），溶藻率分別為78.98% ± 6.56%、90.72% ± 1.35%和89.81% ± 2.46%?；谌茉逍Чc應(yīng)用可行性，選用體積分?jǐn)?shù)10%的接種量開展下一步研究。

圖5 不同體積分?jǐn)?shù)BWFA55發(fā)酵液的溶藻活性

由圖6可知，上清液體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，溶藻效果均顯著高于對照組（< 0.05），且在初始Chl-a質(zhì)量濃度較高時(shí) [≥(1 440.84±77.76) μg/L] 溶藻效果隨初始Chl-a質(zhì)量濃度的增加而降低（< 0.05）。5個(gè)處理組在7 d時(shí)的溶藻率依次為78.01% ± 0.74%、88.10% ± 0.45%、75.12% ± 1.00%、62.57% ± 2.27%、54.96% ± 0.70%。NB對水華魚腥藻也呈現(xiàn)一定溶藻效應(yīng)，但溶藻效果隨著初始藻濃度的升高逐漸降低，當(dāng)初始Chl-a濃度為13 772 μg/L時(shí)，溶藻率為-10.14% ± 0.61%。各處理組溶藻率與各NB對照組均有顯著差異（< 0.05）。

2.6 BWFA55的溶藻方式

圖7為不同試驗(yàn)組與水華魚腥藻共培養(yǎng)7 d的溶藻效果。圖7 (A)表明，菌體重懸液與空白對照組（BG11）的Chl-a濃度均呈上升趨勢，菌體重懸液組5 ～ 7 d Chl-a濃度低于空白對照組，說明菌體懸液無明顯的溶藻作用，對藻的生長有一定抑制作用。控制對照組（NB）、無細(xì)胞上清液組和原發(fā)酵液組Chl-a濃度均呈下降趨勢，說明這3個(gè)組分有溶藻作用，其7 d溶藻率見圖7 (B)，無細(xì)胞上清液的溶藻率是原發(fā)酵液的90.3%，說明發(fā)酵液的溶藻作用主要通過其上清液起作用。同時(shí)NB培養(yǎng)基雖有一定的溶藻作用，但遠(yuǎn)低于無細(xì)胞上清液，說明BWFA55發(fā)酵過程中產(chǎn)生胞外代謝產(chǎn)物有較強(qiáng)的溶藻作用。綜上，BWFA55的主要通過分泌溶藻物質(zhì)達(dá)到溶藻的效果。

凡含一個(gè)相同字母，則差異不顯著（P > 0.05），大寫字母表示不同處理樣品間的差異，小寫字母表示不同初始Chl-a濃度組間的差異；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組初始Chl-a質(zhì)量濃度分別為（710.89 ± 27.13）、（1 440.84 ± 77.76）、（2 854.77 ± 120.50）、（7 139.62 ± 90.22）、（13 772.57 ± 571.70）μg/L。

2.7 BWFA55上清液的溶藻穩(wěn)定性

圖8顯示，不同溫度和pH處理后的BWFA55上清液，其溶藻率均遠(yuǎn)高于同樣濃度的NB培養(yǎng)基。由圖8(A)可知，-40 ～ 40 ℃處理后溶藻活性無顯著變化，40℃后溶藻活性有所下降，但121℃處理仍保留0℃處理的81.9%±3.0%，說明BWFA55上清液中的主要溶藻物質(zhì)有較高的熱穩(wěn)定性。由圖8(B)可知，不同pH條件處理后，各組溶藻活性保留pH 7時(shí)的96.6% ～ 99.9%，說明BWFA55上清液中的主要溶藻物質(zhì)有較好的酸堿耐受性。

凡含一個(gè)相同字母，則差異不顯著（> 0.05），大寫字母表示不同處理樣品間的差異，小寫字母表示不同溫度或pH間的差異

The data with a same letter indicate no significant difference between them (> 0.05), and the capital letters indicate the difference from treated samples, and different small letters indicate the difference from different temperature or pH

圖8 BWFA55的溶藻熱穩(wěn)定性（A）和酸堿穩(wěn)定性（B）

Fig. 8 Algicidal thermostability (A) and pH stability (B) of BWFA55

2.8 溶藻物質(zhì)的乙醇沉淀、萃取與透析

圖9表明，沉淀相比溶解相溶藻效果更佳，沉淀相溶藻率為63.57%±3.36%，溶解相為13.50% ± 3.11%，溶藻活性物質(zhì)不能用乙醇沉淀法完全分離。

圖10表明，石油醚、乙酸乙酯和正丁醇有機(jī)相處理組的葉綠素a質(zhì)量濃度分別為 (3 460.63 ± 61.83) μg/L、(1 185.83 ± 44.01) μg/L和(2 251.95 ± 66.52)μg/L，水相葉綠素a質(zhì)量濃度降至(2 629.51 ± 109.62) μg/L，表明乙酸乙酯可有效萃取溶藻物質(zhì)，溶藻率為60.77% ± 1.46%。

乙酸乙酯萃取的各分子質(zhì)量溶藻物質(zhì)的溶藻效果如圖11所示。圖11可見，主要溶藻物質(zhì)被截留在3 ku的透析袋中，溶藻率為72.43% ± 1.82%。

圖9 溶解相和沉淀相的溶藻活性

圖10 有機(jī)溶劑萃取對溶藻效果的影響

圖11 無菌上清液和透析樣的溶藻效果

3 討論

近年來，由于社會經(jīng)濟(jì)和工業(yè)的迅速發(fā)展，大量氮磷無序排放導(dǎo)致江河湖泊有害藻華頻發(fā)，不僅造成巨大的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)損失，藻類毒素也通過食物鏈嚴(yán)重威脅著人類健康，因此迫切需要有效、環(huán)保的方法來控制有害藻華。研究表明，有害藻華提供了利于細(xì)菌生長繁殖的微環(huán)境[3,23]。而這些細(xì)菌的某些類群可抑制藻華物種生長[8]，有效去除水體中的藻華物種[24,25]，導(dǎo)致有害藻華衰退，因此是控制藻華的優(yōu)選手段[17, 22]。

地衣芽孢桿菌（）可產(chǎn)生氨基酸類、核酸類、脂類、磷酯類、多烯類等多種抗生素物質(zhì)，對多種動(dòng)植物和人類病原菌有良好的抑制作用[26]，有應(yīng)用于調(diào)節(jié)HAB的潛力。目前，關(guān)于地衣芽孢桿菌抑制藍(lán)藻生長鮮有報(bào)道。水華魚腥藻是原核生物，因此其對BWFA55的代謝產(chǎn)物應(yīng)有敏感性。本研究中，水華魚腥藻與BWFA55共培養(yǎng)過程中，其絲狀群體的藻細(xì)胞數(shù)量明顯降低，群體連接結(jié)構(gòu)被破壞，隨著藻細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破裂，藻細(xì)胞內(nèi)含物外溢，細(xì)胞死亡，與細(xì)菌S7[27]對水華魚腥藻的溶藻過程類似。

本研究中，BWFA55發(fā)酵液對水華魚腥藻有良好的抑制作用，菌體重懸液也表現(xiàn)出一定的抑制作用，可能由BWFA55菌體與水華魚腥藻競爭水體中的營養(yǎng)成分所致；上清液的溶藻率略低于原發(fā)酵液，均顯著高于NB組（< 0.05），表明溶藻活性物質(zhì)主要存在于上清液中，間接抑藻。BWFA55抑藻作用與菌液添加量呈正相關(guān)，但10%添加量的抑藻率與20%相差不大，說明溶藻活性物質(zhì)有一定的抑藻飽和濃度。

細(xì)菌的次級代謝產(chǎn)物類型較多，有抑藻能力的胞外物質(zhì)有蛋白質(zhì)、脂肪酸、多糖、色素等[28-32]。有報(bào)道稱，細(xì)菌的胞外抑藻物質(zhì)為大分子物質(zhì)，張小倩等[33]發(fā)現(xiàn)，短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）可分泌一種耐高溫的大分子物質(zhì)對銅綠微囊藻（）生長有明顯的抑制效果。本研究的無菌上清液分別在不同溫度、pH條件下處理后均仍有良好的抑藻效果，說明該抑藻物質(zhì)有較高的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，是非蛋白類物質(zhì)。經(jīng)不同極性大小的有機(jī)溶劑萃取后，僅乙酸乙酯、正丁醇萃取的無菌上清液有抑藻效果，表明該抑藻物質(zhì)極性在乙酸乙酯和正丁醇之間。經(jīng)透析后，抑藻物質(zhì)的分子質(zhì)量大于3 ku。因此推測，該抑藻物質(zhì)不是蛋白質(zhì)、核酸等易變性的大分子物質(zhì)，可能是一種親脂的短肽類物質(zhì)。

目前報(bào)道的大多數(shù)溶藻菌研究中，初始Chl-a濃度一般較低（500 ～ 1 000 μg/L）[34-35]，而自然水體水華嚴(yán)重時(shí)可達(dá)2 000 μg/L[36]。水華魚腥藻在培養(yǎng)后期，藻體大量漂浮在水體上層，本研究的供試藻初始Chl-a質(zhì)量濃度為724.47 ～ 13 447.86 μg/L，可代表水華魚腥藻藻華各階段的表層水Chl-a濃度。BWFA55在實(shí)驗(yàn)中對各濃度的水華魚腥藻均能在較短時(shí)間達(dá)到較高的溶藻率，表明菌株BWFA55對防治自然水體魚腥藻藻華暴發(fā)有較高的應(yīng)用前景。

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Identification and Algicidal Characteristics of an Algicidal Bacterium BWFA55 in Anabaena Bloom Water

FAN De-peng1,2, HU Ya-dong1,2, YANG Min-zhi2, LEI Ming-ke1, WANG Qi3

（1.().,.,528200,; 2..,.,528200,; 3.,524088,）

【】To identify an alginolytic bacterium from algal bloom water, and analyze its alginolytic activities.【】A strain named BWFA55 with high algolytic activity againstisolated from Anabaena bloom lakes in the suburbs of Foshan was identified by API 50 CHB/E physiological-biochemical properties and 16S rDNA sequence analysis. The strain was cultured for 4 days to analyze its growth characteristics and alginolytic activity against. The fermentation supernatant of BWFA55 was co-cultured withfor 168 h, and then, the cell morphology of the algae was observed by scanning electron microscopy. The algicidal effects of the algal concentrations and the inoculation quantity of BWFA55were analyzed. The methods for BWFA55 to dissolve the algae were analyzed by measuring the lytic activities of sterile supernatant from BWFA55cell suspension and fermentation broth. The alginolytic substances were separated by dialysis and organic solvent extraction. The characteristics of alginolytic substances were studied at different temperatures and pH conditions.【】The BWFA55 was identified asWhen 10% 24-hour fermentation broth was co cultured with Anabaena bloom, the algicidal activity was the highest. The chlorophyll a (chl-a) content was reduced by >80% in 7 days. This strainattackedindirectly by secreting alginolytic compounds. This process significantly reduced the number of cells in filamentous population and the population connection structure was destroyed. The major alginolytic compounds of BWFA55 in the fermentation supernatant had a molecular mass >3 ku, and it could be extracted by ethyl acetate. Aalginolytic rate of more than 60% could be maintained at high temperature and were not affected by pH. Therefore it was confirmed that the active substances had a good thermal stability and acid-base stability.

algal bloom;;sp; alginolytic bacteria

X52；X172

A

1673-9159（2021）06-0009-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2021.06.002

范德朋，胡亞冬，楊敏志，等. 魚腥藻藻華水體一株溶藻菌BWFA55的鑒定及溶藻特性[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，41（6）：9-17.

2021-07-12

2019年佛山市自籌經(jīng)費(fèi)類科技計(jì)劃項(xiàng)目（公共服務(wù)能力提升項(xiàng)目）（1920001001601）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2019YFD0900200）；廣東省企業(yè)科技特派員項(xiàng)目（GDKTP2020017800）

范德朋（1976—），男，碩士，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境生物計(jì)術(shù)。E-mail: derek@bio-form.com

胡亞冬（1979—），女，工程師，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境生物技術(shù)。E-mail: huyadong@bio-form.com

（責(zé)任編輯：劉慶穎）